譚宏棣， 陸 億， 萬燕妮， 陸玉丹， 梁業(yè)金， 劉 鵬

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是由多種病因引起的骨髓造血功能障礙，可導(dǎo)致外周血全血細(xì)胞減少、骨髓造血細(xì)胞增生降低，臨床上通常表現(xiàn)為較嚴(yán)重的貧血、出血和感染，常見于青壯年，在我國的發(fā)病率約為0.74/10萬[1]。目前，西醫(yī)治療AA主要是通過免疫抑制和激素等方法，也取得一定的效果，但整體療效不理想，且長期治療容易引起消化道反應(yīng)、激素水平紊亂和肝腎功能損害等[2]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療AA有其獨(dú)特優(yōu)勢，可以彌補(bǔ)西藥治療上的不足，改善患者的生活質(zhì)量[3]。雞血藤是豆科植物密花豆(Spatholobus Suberectus Dunn)的干燥藤莖，主要分布于廣東、廣西、云南等地，味苦、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)的功效[4]。臨床上常用于保護(hù)心血管、抗腫瘤、調(diào)節(jié)酪氨酸酶、改善血液系統(tǒng)等[5]。也有文獻(xiàn)報(bào)道雞血藤在治療AA上有一定的效果[6-7]，但其潛在的作用機(jī)制尚未明確。鑒此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)雞血藤治療AA的主要活性成分及其潛在的分子作用機(jī)制進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料收集

1.1.1 雞血藤活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索雞血藤的化學(xué)成分。根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)[吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)、排泄(excretion)，ADME]對(duì)其可被人體吸收的活性成分進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)[8]：口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%，化合物類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18。

1.1.2 雞血藤活性成分的靶點(diǎn)基因獲取 通過DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)對(duì)篩選出的活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)基因預(yù)測，剔除不能預(yù)測到作用靶點(diǎn)基因的成分。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將篩選出的靶蛋白進(jìn)行蛋白基因轉(zhuǎn)化，限定物種為“Homo sapiens”，得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因名稱(Gene Symbol)。

1.1.3 AA的疾病靶點(diǎn)基因獲取 以“aplastic anemia”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中進(jìn)行檢索，剔除重復(fù)的疾病基因，最終得到AA的疾病靶點(diǎn)基因。

1.2分析方法

1.2.1 雞血藤活性成分靶點(diǎn)基因與AA的疾病靶點(diǎn)基因交集分析 應(yīng)用在線工具Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對(duì)雞血藤活性成分靶點(diǎn)基因和AA的疾病靶點(diǎn)基因繪制韋恩圖，獲得活性成分和疾病的交集靶點(diǎn)基因，即為雞血藤治療AA的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。

1.2.2 構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò) 將雞血藤治療AA的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫的在線平臺(tái)(https://string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，限定研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評(píng)分設(shè)為：medium confidence>0.4，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因功能注釋和通路富集分析 將方法1.2.1所得的交集靶點(diǎn)基因通過R軟件中的RSQLite程序包、BiocManage程序包、org.Hs.eg.db程序包進(jìn)行處理，獲得交集基因的ID。將獲得的基因ID再次運(yùn)用R軟件中的colorspace程序包、stringi程序包、ggplot2程序包、DOSE程序包、clusterProfiler程序包、enrichplot程序包、pathview程序包進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.2.4 藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)基因-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 對(duì)方法1.2.3獲得通路進(jìn)行分析，從中篩選出排前10位的藥物治療疾病的相關(guān)通路，將通路、藥物名稱、活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)基因、疾病名稱導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)基因-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1雞血藤活性成分篩選結(jié)果 通過TCMSP檢索得到雞血藤的活性成分有68種，根據(jù)篩選條件共獲得目標(biāo)成分24種。見表1。

表1 雞血藤活性成分篩選結(jié)果

2.2雞血藤活性成分靶點(diǎn)基因獲取結(jié)果 將24種目標(biāo)活性成分導(dǎo)入DrugBank數(shù)據(jù)庫中，配對(duì)得到418個(gè)靶點(diǎn)基因，剔除Unipro數(shù)據(jù)庫檢索不到的條目后共獲得雞血藤活性成分靶點(diǎn)基因172個(gè)，再去除重復(fù)項(xiàng)后，剩下56個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.3AA的疾病靶點(diǎn)基因獲取結(jié)果 經(jīng)GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索，并去除重復(fù)的疾病基因后，最終得到AA的疾病靶點(diǎn)基因1 665個(gè)。

2.4活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)交集結(jié)果 將56個(gè)成分靶點(diǎn)基因和1 665個(gè)疾病基因?qū)隫enny 2.1，進(jìn)行活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)交集，繪制韋恩圖，見圖1。結(jié)果獲得21個(gè)共同靶點(diǎn)，即為雞血藤治療AA的關(guān)鍵靶點(diǎn)：B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3，CASP3)、對(duì)氧磷酯酶1(paraoxonase 1，PON1)、過氧化物酶體增生激活受體γ(proliferator-activated receptor gamma，PPARG)、細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase 1，CHEK1)、尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子(urokinase plasminogen activator，PLAU)、真核起始因子6(eukaryotic initiation factor 6，EIF6)、腫瘤蛋白p63(tumor protein p63，TP63)、蛋白激酶C(protein kinase C epsilon，PRKCE)、原癌基因蛋白(proto-oncogene，MYC)、細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1，CCNB1)、v-rel網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞過多癥病毒癌基因同源物A(v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA)、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白(retinoblastoma 1，RB1)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、MDM2癌基因(murine double minute 2，MDM2)、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、半胱氨酸蛋白酶-7(caspase-7，CASP7)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白(tyrosinase-related protein，TYR)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S-transferase P1，GSTP1)。

圖1 雞血藤活性成分與AA靶點(diǎn)交集的韋恩圖

2.5雞血藤治療AA關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

將21個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入在STRING數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖2。網(wǎng)絡(luò)中涉及21個(gè)節(jié)點(diǎn)，73條邊，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)度值為6.95，平均局部聚類系數(shù)為0.651。通過比較基因相互連接次數(shù)，將連接次數(shù)較多的基因列為核心基因。列出前10的基因。見圖3。

圖2 雞血藤治療AA的PPI圖

圖3 核心因子柱狀圖(TOP10)

2.6GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

將藥物疾病共同的21個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)應(yīng)用R軟件中的程序包進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析共獲得1 052個(gè)富集結(jié)果，其中生物過程(biological processes，BP)1 012個(gè)、細(xì)胞組分(cellular components，CC)13個(gè)、分子功能(molecular functions，MF)27個(gè)。將校正值P≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行排序篩選，靠前的10項(xiàng)分子功能氣泡圖。見圖4。KEGG通路富集分析共得70條信號(hào)通路，將校正值P≤0.05的項(xiàng)目結(jié)合靶標(biāo)命中數(shù)量進(jìn)行排序篩選，靠前的10項(xiàng)通路富集分析氣泡圖。見圖5。

圖4 基因功能分析分子功能氣泡圖(TOP10)

圖5 通路富集分析氣泡圖(TOP10)

2.7藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的結(jié)果 藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)見圖6。將網(wǎng)絡(luò)中的57個(gè)節(jié)點(diǎn)根據(jù)度值(Degree)進(jìn)行排序，獲得雞血藤治療AA的主要有效成分和作用靶點(diǎn)，其度值前10位的有效成分和作用靶點(diǎn)見表2～3。

紅色菱形為雞血藤、AA和KEGG；褐色為有效成分；藍(lán)色為關(guān)鍵靶點(diǎn)；綠色為通路

表2 雞血藤治療AA的主要活性成分及度值(TOP10)

表3 雞血藤治療AA的主要靶點(diǎn)及度值(TOP10)

3 討論

3.1AA是以外周全血細(xì)胞減少和骨髓造血細(xì)胞增生低下為主要表現(xiàn)的獲得性骨髓衰竭性疾病，在中醫(yī)學(xué)屬“虛勞”范疇。與國外地區(qū)相比，AA在我國的發(fā)病率相對(duì)較高[9]。目前，在西醫(yī)治療上，AA主要以免疫抑制療法為主，可以較好地改善患者生存情況，但仍有大約30%的患者治療無效或者復(fù)發(fā)，且長期應(yīng)用免疫抑制劑和激素容易引起消化道反應(yīng)、激素水平紊亂和肝腎功能損害。近年來，有越來越多的學(xué)者關(guān)注于中醫(yī)藥治療AA的效果。雞血藤是一味活血化瘀中藥，主要含有黃酮類、萜類、甾醇類、木質(zhì)素類及蒽醌類等化學(xué)成分，具有補(bǔ)血、促進(jìn)造血、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[10-11]。

3.2本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出雞血藤的活性成分24種，其中木犀草素、β-谷甾醇、甘草查爾酮A、蘆薈大黃素、芒柄花黃素、豆甾稀醇、8-O-甲基脲、毛蕊異黃酮對(duì)應(yīng)疾病的靶點(diǎn)數(shù)目比較多。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用，還具有抗凝血功能，調(diào)節(jié)血液循環(huán)[12]。β-谷甾醇是一種植物甾醇，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗動(dòng)脈粥樣硬化和護(hù)肝等功能[13]，還可以通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路上調(diào)細(xì)胞增殖能力，抑制細(xì)胞凋亡[14]。蘆薈大黃素屬蒽醌類物質(zhì)，在保護(hù)心血管、護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)、抗病原微生物和抗炎等方面均具有一定的作用[15]。

3.3本研究PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，CASP3、PPARG、CHEK1、RELA、Bcl-2、RB1、IL-6、MYC、MDM2、VEGFA可能是雞血藤治療AA的核心因子。CASP3能夠特異性地剪切PARP1和Ac-DEVD-AMC，從而導(dǎo)致DNA裂解促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡途徑中成為關(guān)鍵的酶類之一。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在AA患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CASP3呈高表達(dá)，可能參與誘導(dǎo)造血細(xì)胞凋亡[16]。PPARG是重要的細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物的脂肪組織、血管平滑肌組織、心肌組織中均有表達(dá)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化等特性。有報(bào)道顯示PPARG調(diào)控的miR-199a-5p通過抑制生長因子β誘導(dǎo)蛋白(transforming growth factor beta-induced，TGFBI)的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂，這可能是AA骨髓脂肪形成的一種機(jī)制，為AA治療提供了新的、有前景的靶點(diǎn)[17]。Bcl-2是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一，它具有顯著抑制細(xì)胞凋亡的作用。有研究報(bào)道免疫功能紊亂與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，且與Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶(caspase,CASP)等被激活和表達(dá)上調(diào)有關(guān)[18]。VEGFA是分泌性血管內(nèi)皮生長因子的其中一個(gè)家族成員，有研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA高表達(dá)可以促進(jìn)骨不連斷端微小血管新生，從而帶來大量的血供和營養(yǎng)物質(zhì)；還可促進(jìn)骨髓中微血管的形成，為造血細(xì)胞的成熟與分化提供有利的環(huán)境，從而促進(jìn)AA患者造血功能的恢復(fù)[19-21]。IL-6是骨髓基質(zhì)細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，其分泌異常與AA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與造血細(xì)胞調(diào)控、造血功能重建，對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞和免疫功能造成影響[22]?？傊?，這些關(guān)鍵蛋白，主要參與和影響細(xì)胞凋亡、免疫抑制、抗炎、抗氧化和造血功能。PPI網(wǎng)絡(luò)圖也顯示，雞血藤治療AA是多成分、多靶點(diǎn)相互作用的結(jié)果。

3.4GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，雞血藤治療AA過程中涉及多個(gè)生物過程和多個(gè)通路。BP主要涉及對(duì)氧氣、類固醇激素和糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)，參與信號(hào)通路的調(diào)控。疾病在發(fā)生、發(fā)展過程中是不斷變化的，不同疾病在變化過程也會(huì)出現(xiàn)相同或相似的機(jī)理。雞血藤治療AA的相關(guān)通路涵蓋了細(xì)胞凋亡、p53信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路，還包含了與病毒、癌癥、傳染病等相關(guān)通路，提示不同疾病治療通路具有相似性，為中醫(yī)“異病同治”的診療方式提供了理論依據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)，在AA患者中發(fā)現(xiàn)骨髓造血干細(xì)胞、骨髓造血祖細(xì)胞大量凋亡，提示細(xì)胞凋亡是AA的重要機(jī)制之一[23]。在《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)[24]中也有說明，相關(guān)基因介導(dǎo)的造血干細(xì)胞過度凋亡導(dǎo)致的骨髓衰竭是AA的主要發(fā)病機(jī)制。而p53對(duì)AA的影響包括了核糖體生物合成、紅細(xì)胞生成、癌癥易感性和機(jī)體異常等方面[25]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過構(gòu)建藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，揭示了雞血藤是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路間的相互作用發(fā)揮治療AA的作用，主要活性成分包括木犀草素、β-谷甾醇、甘草查爾酮A、蘆薈大黃素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮等，但研究結(jié)論仍需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。