劉 正,侍永江,周泰然,高 磊,郭羽芬,唐士杰,羅洪鎮(zhèn)

(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江蘇 淮安 223003)

化石能源是當(dāng)前世界上最重要的能量來源,在經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人類和社會(huì)進(jìn)步中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。化石能源過量開采造成了資源枯竭、環(huán)境惡化等一系列問題,因此亟須開發(fā)綠色、可再生的高效能源。利用生物燃料部分替代化石燃料的潛力已逐漸凸顯。在2017年當(dāng)年全球能源供應(yīng)中,可再生生物質(zhì)供能占比約10.3%[1]。目前已有87個(gè)國家制定了使用可再生能源的經(jīng)濟(jì)目標(biāo),使得涉及人類糧食及能源安全的生物經(jīng)濟(jì)越來越受重視[2]。目前儲(chǔ)量極為豐富的木質(zhì)纖維素資源已由多種方式轉(zhuǎn)化為丁醇、乙醇、柴油等多種燃料,得到研究者廣泛關(guān)注[3]。

木質(zhì)纖維素具有儲(chǔ)量豐富、可再生、低成本等天然優(yōu)勢[4],可用于生產(chǎn)高效生物燃料,如,具有高熱值、低蒸氣壓、低揮發(fā)性的丁醇[5]。目前,生產(chǎn)丁醇的微生物主要是產(chǎn)溶劑梭菌,如,拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum),產(chǎn)溶劑梭菌通過復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)將底物轉(zhuǎn)化為丙酮、乙醇和丁醇的混合物,其中丁醇占總?cè)軇┑馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)約60%。由于梭菌無法直接利用木質(zhì)纖維素原料,需要對(duì)木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理,以提高后續(xù)發(fā)酵性能,而預(yù)處理產(chǎn)生的抑制物是限制木質(zhì)纖維素高值化利用的主要瓶頸[6]?；诖?理解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)預(yù)處理中衍生的抑制物特征及其對(duì)產(chǎn)溶劑梭菌的抑制機(jī)制,并建立有效的解抑制工程策略,是實(shí)現(xiàn)有效利用木質(zhì)纖維素資源合成燃料丁醇的關(guān)鍵。本綜述聚焦上述問題,介紹預(yù)處理中的抑制物衍生特征,重點(diǎn)關(guān)注產(chǎn)溶劑梭菌對(duì)抑制物的脅迫響應(yīng)機(jī)制及解抑制策略,并討論木質(zhì)纖維素高效生物轉(zhuǎn)化的發(fā)展前景。

1 木質(zhì)纖維素預(yù)處理抑制物的衍生特征

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是一種非均質(zhì)聚合物,主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成,3種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40%～50%、25%～30%和15%～25%;此外,還包含少量灰分、蛋白質(zhì)等成分。木質(zhì)纖維素各組分含量受種類、環(huán)境溫度、濕度、地理位置等影響而有所差異。構(gòu)成木質(zhì)纖維素的三大組分中,纖維素是一種由葡萄糖單元組成的多糖,在酸或酶作用下,其連接鍵被破壞，從而產(chǎn)生可被微生物利用的葡萄糖;半纖維素是由五碳糖和六碳糖組成的多聚物;木質(zhì)素是由幾種不同的苯基丙烷單體通過芳香醚鍵隨機(jī)連接組合而成的三維無定型聚合物。纖維素、半纖維素、木質(zhì)素交聯(lián)形成的致密結(jié)構(gòu)具有極強(qiáng)的抗降解特性,很大程度上阻礙了其高效生物轉(zhuǎn)化。預(yù)處理能夠有效破壞木質(zhì)纖維素細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu),去除木質(zhì)素的同時(shí)降低纖維素的結(jié)晶度,提高纖維素可及度和酶解效率[7]。由于不同預(yù)處理方式對(duì)木質(zhì)纖維素的作用強(qiáng)度等不同,導(dǎo)致預(yù)處理衍生的抑制物質(zhì)量濃度、種類也有一定差異。預(yù)處理過程中形成的抑制物主要包括:弱酸類物質(zhì)、呋喃衍生物、酚類化合物(圖1)[8]。弱酸類物質(zhì)主要來源于纖維素降解形成的己糖經(jīng)進(jìn)一步脫水形成的5-羥甲基糠醛(5-HMF),弱酸類物質(zhì)包括甲酸、乙酸、乙酰丙酸。其中,乙酸由半纖維素乙?；蜕俨糠帜举|(zhì)素乙酰化形成;呋喃衍生物包括5-HMF、呋喃甲酸、糠醛等,而糠醛是由半纖維素過度降解而直接形成;酚類化合物主要由木質(zhì)素組分水解形成,如,4-羥基苯甲醛、阿魏酸、丁香醛、香草醛等。

圖1 木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中產(chǎn)生的各類發(fā)酵抑制物[8]Fig.1 Fermentative inhibitors formation during pretreatment of lignocellulosic biomass[8]

化學(xué)預(yù)處理是木質(zhì)纖維素預(yù)處理最常用的預(yù)處理技術(shù),主要包括酸預(yù)處理、堿預(yù)處理以及有機(jī)溶劑預(yù)處理。其中,酸預(yù)處理是一種高效且應(yīng)用廣泛的預(yù)處理工藝。Gu等[9]用稀H2SO4預(yù)處理甘蔗秸稈時(shí),木聚糖脫除率和糖得率分別達(dá)到88%和90%。酸預(yù)處理會(huì)使得半纖維素降解產(chǎn)生乙酸,同時(shí)部分纖維素降解產(chǎn)生的己糖脫水形成5-HMF?？啡┖?-HMF在各種水解液中的質(zhì)量濃度差異較大,但普遍質(zhì)量濃度均不超過3.5 g/L,甲酸、乙酰丙酸來源單一且不易形成,因此,質(zhì)量濃度普遍較低(0.1～0.6 g/L),而乙酸的質(zhì)量濃度最高可達(dá)8.0 g/L[10]。堿預(yù)處理通常在較為溫和的條件下進(jìn)行,與酸預(yù)處理的區(qū)別在于,堿預(yù)處理主要溶解木質(zhì)素和半纖維素,斷開分子間的酯鍵連接,以降低纖維素的結(jié)晶度和聚合度。Kim等[11]利用Na2CO3作為廉價(jià)堿催化劑,預(yù)處理玉米秸稈時(shí),葡萄糖產(chǎn)率為267.5 g/kg,并有效破壞玉米秸稈的頑固結(jié)構(gòu)。由于堿預(yù)處理主要去除木質(zhì)素及半纖維素,因此所形成的抑制物主要包括甲酸、乙酸以及酚類化合物。相較于甲酸、乙酸等抑制物,酚類化合物被認(rèn)為是對(duì)酶解及發(fā)酵的抑制作用最為強(qiáng)烈的一類抑制物[12]。大多數(shù)抑制劑具有良好的水溶性,而酚類化合物在水中的溶解度低、水溶性差,導(dǎo)致其檢測濃度與水解液中的真實(shí)濃度有一定差異[13]。有機(jī)溶劑預(yù)處理的作用方式與堿預(yù)處理相似,利用有機(jī)溶劑和其水溶液可以破壞木質(zhì)素與半纖維素之間的化學(xué)鍵。Jafari等[14]利用丙酮進(jìn)行丁醇發(fā)酵的原料預(yù)處理,成功脫除69%木質(zhì)素以及83%半纖維素,將葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至61%。然而,有機(jī)溶劑預(yù)處理同樣無法避免發(fā)酵抑制物形成。表1總結(jié)歸納了不同預(yù)處理的優(yōu)缺點(diǎn)及抑制物衍生特征[15-18]。

在木質(zhì)纖維素水解液中,弱酸一般不會(huì)單獨(dú)存在,往往與呋喃類衍生物、酚類化合物共同存在,對(duì)微生物產(chǎn)生協(xié)同抑制作用。弱酸的抑制效果相比于呋喃、酚類化合物的抑制效果較弱。因此,目前研究多數(shù)致力于呋喃類衍生物以及酚類化合物。其中,酚類化合物的低水溶性、成分復(fù)雜導(dǎo)致在其定性定量分析上存在一定難度,其抑制機(jī)制的解析應(yīng)是值得重視的方向。

2 產(chǎn)溶劑梭菌對(duì)預(yù)處理抑制物的脅迫響應(yīng)機(jī)制

2.1 弱酸類物質(zhì)

Cho等[19]以C.acetobutylicum為發(fā)酵菌株,添加0.2 g/L甲酸能夠略微提高丁醇發(fā)酵的總?cè)軇┊a(chǎn)量,而當(dāng)甲酸添加量增至1.0 g/L時(shí),總?cè)軇┊a(chǎn)量下降75%。此外,C.beijerinckii則因?yàn)槠浼?xì)胞膜含有甲酸脫氫酶，因而對(duì)弱酸有較高的耐受性,其溶劑合成能力并未受到弱酸的抑制。同時(shí),丁醇發(fā)酵是典型的兩階段發(fā)酵過程,分為產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期,弱酸類物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)pH的降低,形成過酸環(huán)境,梭菌自身厭氧呼吸產(chǎn)能較少,菌體需要消耗大量三磷酸腺苷(ATP)將胞內(nèi)多余的質(zhì)子排出,因而細(xì)胞的生長代謝受到限制。細(xì)胞內(nèi)低質(zhì)量濃度甲酸的存在,即可造成乙酸、丁酸過量積累,溶劑合成受到抑制,在梭菌發(fā)酵過程中出現(xiàn)“酸崩潰”現(xiàn)象,發(fā)酵相轉(zhuǎn)型無法順利進(jìn)行[20]。

表1 不同預(yù)處理工藝的優(yōu)缺點(diǎn)及產(chǎn)生的主要抑制物Table 1 Advantages and disadvantages of different pretreatment methods and major inhibitors

2.2 呋喃類衍生物

研究表明,低質(zhì)量濃度的糠醛或5-HMF單獨(dú)存在時(shí),能夠提高C.beijerinckii溶劑合成能力,但混合呋喃類物質(zhì)則抑制菌株對(duì)木糖的利用能力,并降低溶劑產(chǎn)量[21]。在梭菌厭氧發(fā)酵過程中,糠醛和5-HMF可以被轉(zhuǎn)化為對(duì)細(xì)胞毒性較低的糠醇和2,5-二羥甲基糠醇。然而,實(shí)際上預(yù)處理所形成的糠醛和5-HMF質(zhì)量濃度較高,嚴(yán)重影響菌體代謝,破壞菌體細(xì)胞膜,降低糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)(TCA)中參與細(xì)胞代謝的關(guān)鍵酶活性,從而降低葡萄糖利用率。并且,糠醛和5-HMF的代謝轉(zhuǎn)化過程依賴于細(xì)胞內(nèi)還原力的參與,而胞內(nèi)還原力水平是合成溶劑的關(guān)鍵因素。此外,呋喃化合物在酸性環(huán)境中可能發(fā)生水合反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為甲酸以及乙酰丙酸。在這種情況下,多種抑制物共同存在會(huì)對(duì)細(xì)胞生長、產(chǎn)氫能力具有強(qiáng)烈抑制[22]。Liu等[23]系統(tǒng)研究了甲酸、乙酸、糠醛、5-HMF等主要抑制劑對(duì)C.acetobutylicum的抑制情況,結(jié)果表明,多種抑制劑脅迫下,糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶活性降低,與丙酮-丁醇合成和氧化還原代謝相關(guān)的代謝產(chǎn)物以及關(guān)鍵酶均受到抑制。此外,參與糖異生、氧化三羧酸循環(huán)、氧化應(yīng)激的過氧化物酶蛋白活性顯著上升,表明梭菌對(duì)抑制劑脅迫下產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),并自發(fā)調(diào)節(jié)代謝,但這種適應(yīng)機(jī)制是以降低丁醇合成效率為代價(jià)。

2.3 酚類化合物

酚類化合物主要來源于木質(zhì)素組分的降解[24]。在預(yù)處理液中的含量較低,但是與相同質(zhì)量濃度的糠醛、5-HMF相比，則具有更強(qiáng)的毒性。酚類化合物具有親脂性,容易穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,破壞細(xì)胞膜的完整性,引起細(xì)胞內(nèi)部活性氧(ROS)積累,誘發(fā)細(xì)胞死亡。Liu等[25]對(duì)0.5 g/L阿魏酸脅迫下的C.beijerinckii進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析(RNA-seq),結(jié)果表明,氧化還原相關(guān)輔助因子、核黃素代謝、雙組分系統(tǒng)、DNA復(fù)制相關(guān)基因產(chǎn)生差異表達(dá)。利用基于RNA-seq的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析手段,對(duì)多種典型酚類化合物存在下丁醇發(fā)酵過程的研究表明:對(duì)香豆酸主要影響細(xì)胞核糖體蛋白的基因表達(dá)及鞭毛的組裝、DNA重組;丁香醛與香草醛則顯著影響嘌呤、淀粉、蔗糖的代謝及產(chǎn)孢和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能;阿魏酸則引起糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因表達(dá)代謝紊亂[26]。此外,筆者研究團(tuán)隊(duì)借助發(fā)酵動(dòng)力學(xué)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討了酚酸、酚醛分別脅迫下的丁醇發(fā)酵性能,結(jié)果表明,酚醛比酚酸對(duì)C.acetobutylicum細(xì)胞生長和溶劑合成具有更強(qiáng)的抑制,酚類化合物改變了細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、糖酵解相關(guān)的基因表達(dá)[27]。此外,木質(zhì)纖維素生物質(zhì)真實(shí)水解液中的酚類化合物應(yīng)同時(shí)包含酚酸、酚醛,本團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探究了產(chǎn)溶劑梭菌在復(fù)合酚類化合物存在下的脅迫機(jī)制,結(jié)果表明復(fù)合酚類化合物脅迫12 h后,葡萄糖利用效率降低21%。RNA-seq分析結(jié)果表明,復(fù)合脅迫條件使得與孢子生成、細(xì)胞分裂、抗氧化活性、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、熱休克蛋白等關(guān)鍵生理過程相關(guān)的基因均出現(xiàn)差異表達(dá)(圖2),并繪制了產(chǎn)溶劑梭菌耐受酚類化合物的全局抑制機(jī)制圖[28]。以上研究結(jié)果將為后續(xù)菌株抗逆性能提升給予理論指導(dǎo)。

由2.1～2.3節(jié)可知,弱酸類物質(zhì)、呋喃類衍生物、酚類化合物這三種物質(zhì)對(duì)產(chǎn)溶劑梭菌的抑制作用存在差異。劉歡歡等[29]選取糠醛、5-HMF、甲酸、乙酸和苯酚等作為主要抑制劑進(jìn)行耐受性研究,代謝組學(xué)分析結(jié)果表明,低質(zhì)量濃度的甲酸和苯酚(0.5 g/L)對(duì)丁醇發(fā)酵抑制作用強(qiáng)于高質(zhì)量濃度的糠醛(2 g/L),而低質(zhì)量濃度的呋喃類化合物(1 g/L)能夠提高丁醇發(fā)酵性能,并且苯酚脅迫主要影響脂肪酸代謝和核酸代謝,而糠醛能夠?qū)е掳麅?nèi)還原性化合物積累出現(xiàn)紊亂,甲酸脅迫則主要使胞內(nèi)代謝活動(dòng)遲緩,菌體生長緩慢。綜上所述,木質(zhì)纖維素真實(shí)水解液中的抑制劑種類繁多,其濃度特征也隨預(yù)處理方法的不同而出現(xiàn)顯著差異(表1),并且抑制劑之間可能存在協(xié)同抑制作用。

3 解除抑制效應(yīng)的工程策略

3.1 脫毒策略

解除預(yù)處理衍生物抑制效應(yīng)最直接的方式是脫毒工藝,其使得預(yù)處理液中的抑制物濃度降低。不同脫毒工藝的優(yōu)缺點(diǎn)如表2所示。一般可采用化學(xué)試劑與抑制物反應(yīng)使得抑制物的毒性降低,或者采用吸附、分離等物理方式除去抑制物,它們都屬于發(fā)酵之前脫除抑制物的方法。常用的脫毒方法包括:水洗、過堿中和、活性炭吸附、離子交換吸附、電化學(xué)脫毒、電凝處理等。

水洗通常使用大量的水對(duì)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)預(yù)處理后進(jìn)行重復(fù)、多次洗滌,速度較快,但存在諸多缺點(diǎn)如:產(chǎn)生大量廢水,損失可發(fā)酵糖、抑制物去除不徹底等[30]。過堿中和通常使用Ca(OH)2與抑制物進(jìn)行反應(yīng),該方法能夠有效去除抑制物。Zhang等[31]利用堿和活性炭脫除水解物中的抑制劑,呋喃衍生物和芳香單體的去除率達(dá)到75.6%和68.1%,并除去較多酚酸物質(zhì)。但是其缺點(diǎn)也較為明顯,會(huì)損失部分可發(fā)酵糖;用于脫毒的試劑無法回收利用;過程中產(chǎn)生的沉淀及鹽會(huì)影響后續(xù)的糖化、發(fā)酵,降低了工藝經(jīng)濟(jì)性。由于水解液中的抑制物多數(shù)為羰基化合物,如，羧酸(乙酸、阿魏酸)、木質(zhì)素衍生的酚醛(丁香醛)、糠醛、5-HMF。含有羰基的這類化合物,其碳氧雙鍵容易極化,在碳原子上產(chǎn)生正電荷,使得碳原子可以與核酸、蛋白質(zhì)等生物親核試劑形成共價(jià)鍵。因此,大多數(shù)帶有伯氨基和側(cè)鏈官能團(tuán)的氨基酸能夠與上述羰基化合物發(fā)生反應(yīng),從而降低其抑制發(fā)酵的能力。如帶有巰基和胺基的半胱氨酸,容易與親電的羰基反應(yīng),解除這類化合物的抑制。Xie等[32]利用多種親核氨基酸選擇性解毒生物質(zhì)水解物,結(jié)果表明,半胱氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸和天冬酰胺表現(xiàn)出良好的解毒效果。以半胱氨酸作為親核氨基酸處理時(shí),96%的5-HMF被脫除,產(chǎn)品質(zhì)量濃度大幅提高。

圖2 C. acetobutylicum ATCC 824對(duì)復(fù)合酚類化合物脅迫的整體響應(yīng)機(jī)制[28]Fig.2 The overall response mechanism of C. acetobutylicum ATCC 824 to combined phenolic stress[28]

表2 木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理液脫毒方式及其優(yōu)缺點(diǎn)Table 2 Detoxification methods of lignocellulosic hydrolysate and their advantages and disadvantages

此外,許多物理化學(xué)方法在脫除抑制物方面效果良好,并且能夠保證極低的糖損失率。Jiang等[33]采用電化學(xué)解毒的方法處理玉米芯水解液24 h后,酚類化合物下降約40%,呋喃及糠醛質(zhì)量濃度也有不同程度的降低,最終丁醇產(chǎn)量是未解毒批次的1.6倍,并且在整個(gè)過程中避免了可發(fā)酵糖的損失以及副產(chǎn)物的形成。Jeong等[34]使用Al電極在8 g/L的NaCl中電凝處理3 h,成功去除了47.8%酚類化合物以及大部分5-HMF和糠醛,僅有約2%的糖損失率。

生物脫毒法指通過微生物產(chǎn)生的酶脫除抑制劑,能夠?qū)崿F(xiàn)抑制劑原位脫毒、降低操作成本、提高整體發(fā)酵性能。從真菌中分離出來的漆酶近年來廣泛應(yīng)用于木質(zhì)素的解聚過程,其結(jié)構(gòu)域有4個(gè)不同的Cu離子,能夠介導(dǎo)單酚、多酚、芳香胺、無機(jī)離子等多種底物的氧化。Allard-Massicotte等[35]在過濾、絮凝等物理化學(xué)脫毒方式的基礎(chǔ)上,以酶加量為100 mg/g的脫毒條件,成功脫除水解液中包含香草醛、丁香醛、鄰苯二酚、沒食子酸在內(nèi)的復(fù)合酚類化合物,降解率達(dá)77%,水解液脫毒后酚類化合物總質(zhì)量濃度僅為0.28 g/L,低于其抑制微生物代謝的最低值,最終提高一倍以上的丁醇產(chǎn)量。近期研究從腐爛木材中分離得到真菌,并純化出具有良好熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性的漆酶,在甘蔗渣中脫毒5.5 h即可去除79.28%的酚類抑制劑,具有一定的工業(yè)應(yīng)用潛力[36]。

3.2 代謝工程改造策略

微生物對(duì)發(fā)酵抑制劑中呋喃類、酚類化合物的代謝方式主要包括氧化還原、轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控等。其中,通過氧化還原反應(yīng)將高毒性的醛類轉(zhuǎn)化為具有較低毒性的酸和醇,二者再進(jìn)入微生物的中心碳代謝從而實(shí)現(xiàn)呋喃、酚類化合物的最終降解[37-38]。微生物對(duì)弱酸類物質(zhì)的代謝機(jī)制與其他兩類抑制物不同,主要通過乙酸代謝、重吸收實(shí)現(xiàn)代謝。乙酸在乙酰輔酶A合成酶作用下,合成乙酰輔酶A,進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán),乙酰丙酸先轉(zhuǎn)化為乙酰丙酸輔酶A后進(jìn)一步被裂解,形成甲酰輔酶A和乙酰輔酶A,進(jìn)入TCA循環(huán),完成代謝。Ezeji等[39]研究表明,C.beijerinckiiBA101對(duì)低質(zhì)量濃度的乙酸、糠醛、5-HMF有較強(qiáng)的耐受性,糠醛和5-HMF在3 g/L下能被C.beijerinckiiBA101代謝利用，從而提高發(fā)酵性能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),酚類化合物如香豆酸、阿魏酸在2 g/L質(zhì)量濃度下，即可以完全抑制產(chǎn)溶劑梭菌的發(fā)酵,0.5 g/L香豆酸使得丁醇產(chǎn)量降低了90%[40]。因此,提高菌株對(duì)酚類化合物耐受性是丁醇發(fā)酵需解決的關(guān)鍵問題。Guo等[41]通過連續(xù)培養(yǎng)分離出具有高抑制物耐受性的C.beijerinckii,以未經(jīng)脫毒的預(yù)處理液作為底物(含2.1 g/L酚類化合物和40.3 g/L還原糖)時(shí),得到2.6 g/L丙酮、7.5 g/L丁醇和0.5 g/L乙醇。Lu等[42]通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了過表達(dá)乙醛脫氫酶/乙醇脫氫酶基因(adhE2)和輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(ctfAB)的工程菌C.beijerinckiiCC101-SV6,與僅表達(dá)adhE2的C.beijerinckii工程菌株相比,其溶劑合成及有機(jī)酸吸收的能力顯著提高。同時(shí)C.beijerinckiiCC101-SV6能合成約12 g/L丁醇,并高效吸收有機(jī)酸,有效防止“酸崩潰”的發(fā)生;而且該菌利用葡萄糖和木糖的能力也有所提高,表現(xiàn)出對(duì)抑制劑的高耐受性。只是單一過表達(dá)乙醛脫氫酶/乙醇脫氫酶可能增加了發(fā)酵初期代謝負(fù)擔(dān),使得胞內(nèi)ATP供應(yīng)不足,還原力失衡,因而，部分乙酰輔酶A無法正常代謝有機(jī)酸。Jiménez-Bonilla等[43]過表達(dá)Pseudomonasputida的外排泵基因提高了C.saccharoperbutylacetonicum對(duì)阿魏酸的耐受性,結(jié)果表明,整體基因的過表達(dá)降低了菌株對(duì)抑制劑的耐受性,而單一過表達(dá)亞基基因(srpB)就能夠顯著提高菌株的魯棒性,最終丁醇產(chǎn)量能夠達(dá)到不添加抑制劑批次的水平。Wu等[44]以過表達(dá)或敲除編碼葡萄糖特異性的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)相關(guān)基因,構(gòu)建了C.acetobutylicum工程菌株,由于該基因具有調(diào)控葡萄糖利用效率、溶劑合成等多種功能,因而在指數(shù)生長期能量/輔因子再生、溶劑合成和抑制劑耐受水平均得到提高,最終表現(xiàn)出較好的丁醇發(fā)酵性能。

3.3 統(tǒng)合生物加工及微生物共培養(yǎng)策略

統(tǒng)合生物加工(CBP)是將原料水解、酶水解及后續(xù)溶劑發(fā)酵過程整合為一步的工藝,因而，產(chǎn)溶劑梭菌能夠直接利用原料生產(chǎn)丁醇等溶劑。將兩種或多種微生物同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng),利用底物進(jìn)行發(fā)酵,實(shí)現(xiàn)解除抑制物抑制效應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行溶劑的合成。從經(jīng)濟(jì)角度,該工藝能夠降低甚至減少昂貴的預(yù)處理成本,提高經(jīng)濟(jì)可行性;從技術(shù)角度,共培養(yǎng)能夠?qū)崿F(xiàn)不同微生物之間的功能互補(bǔ),擴(kuò)展底物譜,提高其對(duì)產(chǎn)物和抑制劑的耐受能力,高效合成溶劑。Wen等[45]開發(fā)出一種基于雙梭菌共培養(yǎng)的CBP系統(tǒng),以纖維素梭菌(C.cellulovorans)和C.beijerinckii作為發(fā)酵菌株,通過敲除乙酸激酶基因和乳酸脫氫酶基因,并過表達(dá)丁酸激酶基因,轉(zhuǎn)變碳代謝更多流向丁酸生成方向;過表達(dá)與有機(jī)酸重吸收相關(guān)的基因(ctfAB),以提高乙酸轉(zhuǎn)化速率。利用雙梭菌體系實(shí)現(xiàn)了纖維素酶生產(chǎn)、木質(zhì)纖維素水解和己糖/戊糖共發(fā)酵,一步生成丁醇,發(fā)揮纖維素梭菌能夠直接利用纖維素生成可發(fā)酵糖的優(yōu)勢,避免發(fā)酵抑制物的形成。Cui等[46]將C.beijerinckiiG117與重組枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis1A1)共培養(yǎng),B.subtilis消耗培養(yǎng)基中的O2后，為C.beijerinckii創(chuàng)造厭氧環(huán)境,并且B.subtilis產(chǎn)生的乳酸被C.beijerinckii重吸收,B.subtilis1A1通過表達(dá)二級(jí)醇脫氫酶將C.beijerinckiiG117產(chǎn)生的丙酮還原為異丙醇,維持胞內(nèi)氧化還原平衡。利用不同菌株之間生理生化性質(zhì)、代謝途徑和能力的差異,不僅成功實(shí)現(xiàn)發(fā)酵抑制物的原位降解,而且能夠同步合成目標(biāo)產(chǎn)物。不足的是,許多微生物共培養(yǎng)體系中,菌株之間在分子水平上的微生物相互作用機(jī)制仍未可知。在工業(yè)化應(yīng)用中存在以下問題:如何獲取適用于CBP技術(shù)的微生物菌株、工藝中的多種水解酶如何高效共表達(dá)、整體發(fā)酵協(xié)同性如何提高、水解酶之間的組分比例如何調(diào)控等。此外,為提高微生物共培養(yǎng)系統(tǒng)的性能,使微生物更好地發(fā)揮相互作用,以后可重點(diǎn)從氧傳遞速率控制、菌株種群比例調(diào)控、共培養(yǎng)系統(tǒng)分子機(jī)制解析等方面開展研究。

代謝工程改造策略提高細(xì)胞代謝魯棒性是近年研究的熱點(diǎn)方向。然而木質(zhì)纖維素衍生抑制劑對(duì)產(chǎn)溶劑梭菌的影響是全局性的,往往涉及細(xì)胞生長、溶劑合成、抑制劑代謝等多個(gè)過程,以代謝工程改造手段提高其耐受性難度較大。抑制物對(duì)產(chǎn)溶劑梭菌全局影響的機(jī)制極其復(fù)雜,若單獨(dú)通過改造某一代謝通路或基因,無法達(dá)到預(yù)期效果。CBP和微生物共培養(yǎng)策略是提高產(chǎn)溶劑梭菌對(duì)產(chǎn)物丁醇及抑制劑耐受性的有效手段。但在其應(yīng)用中仍然存在不同微生物之間的底物利用競爭問題。此外,由于不同微生物或酶的最適生長條件和最高活性條件的不同,共培養(yǎng)體系的性能無法發(fā)揮到極致,并且菌株之間在分子水平上的相互作用機(jī)制尚缺乏深入研究。通過解決上述問題將為產(chǎn)溶劑梭菌高產(chǎn)丁醇策略的提出提供指導(dǎo)。

4 結(jié)論與展望

木質(zhì)纖維素預(yù)處理衍生的抑制物是限制生物煉制產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主要瓶頸。本文介紹了木質(zhì)纖維素不同預(yù)處理工藝及抑制物衍生特征,并歸納總結(jié)了解除抑制的前沿工程策略，為木質(zhì)纖維素資源轉(zhuǎn)化提供了借鑒。當(dāng)前,CBP系統(tǒng)、微生物共培養(yǎng)和代謝工程等技術(shù)已應(yīng)用于解除抑制劑的抑制效應(yīng)研究,但仍存在諸多難以解決的技術(shù)難題。除文中所述的解抑制策略之外,許多應(yīng)用前景廣闊的技術(shù)路線值得研究者們關(guān)注。

首先,木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程是一個(gè)高度復(fù)雜性、非線性特征的系統(tǒng),抑制物的質(zhì)量濃度衍生特征受原料、預(yù)處理工藝等因素的影響,運(yùn)用傳統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)模型難以進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測。若能從預(yù)處理中減少抑制物的產(chǎn)生,進(jìn)而降低后續(xù)脫毒成本,會(huì)提高整體工藝的經(jīng)濟(jì)性。目前,人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)技術(shù)作為一種有效的預(yù)測建模方法,具有快速尋找最優(yōu)解的特點(diǎn),適用于處理木質(zhì)纖維素預(yù)處理等高度復(fù)雜的反應(yīng)過程,在生物煉制領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力,并且目前已被開發(fā)用于生物燃料生產(chǎn)、熱解、生物質(zhì)熱力學(xué)性質(zhì)和高熱值預(yù)測等研究領(lǐng)域[47-48]。其次，基于適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化(ALE)策略能夠提高菌株耐受多種抑制物的能力,通過重復(fù)分批培養(yǎng)或在設(shè)定的脅迫條件下延長培養(yǎng)時(shí)間,使菌株發(fā)生所需的遺傳變異[49];但該過程往往需要經(jīng)歷漫長的培養(yǎng)周期。因此,利用合成生物學(xué)設(shè)計(jì)并構(gòu)建相關(guān)生物元件和基因文庫,借助基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白、代謝等組學(xué)手段,挖掘與產(chǎn)溶劑梭菌的抑制物耐受性相關(guān)的關(guān)鍵基因,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)、代謝變化、基因表達(dá)的精準(zhǔn)把控。在DNA、RNA、蛋白質(zhì)水平調(diào)控產(chǎn)溶劑梭菌的代謝網(wǎng)絡(luò),減少副產(chǎn)物生成,避免中間產(chǎn)物積累,維持菌株內(nèi)部代謝平衡,最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)溶劑梭菌直接利用木質(zhì)纖維素原料或提高細(xì)胞耐受性的生物功能。近期研究者組合利用ALE和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯著提高了Yarrowialipolytica對(duì)芳香醛的耐受性,由轉(zhuǎn)錄組分析和反向代謝工程手段證實(shí)了過表達(dá)醛酮還原酶基因和醛脫氫酶基因可將芳香醛轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇和酸,從而獲得對(duì)芳香醛具有高耐受的進(jìn)化株[50]。最后,還需關(guān)注的科學(xué)問題是丁醇的產(chǎn)物抑制效應(yīng),這是限制丁醇高效發(fā)酵的瓶頸之一,約5 g/L丁醇就可抑制產(chǎn)溶劑梭菌的正常生理代謝。因此，利用原位分離耦合技術(shù)將溶劑在發(fā)酵過程中分離出來,能夠減少溶劑對(duì)細(xì)胞毒害,提高整體發(fā)酵性能。最新的研究已通過構(gòu)建一系列針對(duì)不同菌株的基因編輯工具,以引入外源基因等方式系統(tǒng)改造產(chǎn)溶劑梭菌,獲得高效生產(chǎn)高附加值的脂肪酸酯等產(chǎn)品的工程菌株,大幅提高了生產(chǎn)效率[51]。未來,利用從基因元件、模塊到整體代謝系統(tǒng)的合成生物學(xué)等新興交叉學(xué)科的優(yōu)勢,結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等手段,從多角度研究生物系統(tǒng),獲得更多優(yōu)良的工業(yè)發(fā)酵菌株,最終實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)高效生物轉(zhuǎn)化的工業(yè)化目標(biāo)。