龔貴平,吳 波,劉林培,胡國(guó)全,何明雄

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 沼氣科學(xué)研究所,生物質(zhì)能技術(shù)研究中心,四川 成都 610041)

乳酸(LA),是一種重要的有機(jī)酸,其年消費(fèi)量約占有機(jī)酸總消費(fèi)量的15%以上,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用至食品、醫(yī)藥、包裝、塑料等領(lǐng)域[1]。根據(jù)分子手性差異,乳酸又被分為L(zhǎng)-乳酸和D-乳酸。由于乳酸分子中同時(shí)具有羥基和羧基,具備多個(gè)分子聚合形成聚合物的基礎(chǔ),可以制備聚乳酸材料。聚乳酸是一種重要的熱塑聚合物,由于其良好的生物相容性和生物降解性,目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用至食品包裝、紡織加工、醫(yī)用材料、農(nóng)用薄膜生產(chǎn)等眾多領(lǐng)域[1]。隨著我國(guó)頒布更為嚴(yán)格的“限塑令”以及人們對(duì)于綠色、環(huán)保和可回收材料的需求日益增加,生物可降解材料越來越受到人們的重視和市場(chǎng)青睞,乳酸的市場(chǎng)需求量也呈現(xiàn)較大規(guī)模的增長(zhǎng),據(jù)估計(jì),2025年全球乳酸需求量將達(dá)到196萬t[2]。目前,乳酸的生產(chǎn)方法主要包括發(fā)酵法、酶法和化學(xué)合成法[3]。據(jù)估計(jì),全世界90%的乳酸是通過發(fā)酵法生產(chǎn)的[2,4-5]。在乳酸發(fā)酵中,出于技術(shù)和成本考慮,目前常用的原料仍是淀粉,通過水解淀粉制備糖液,再進(jìn)行乳酸發(fā)酵仍是主流方法。但該方法存在與人爭(zhēng)糧的風(fēng)險(xiǎn),且不利于大規(guī)模發(fā)展,這極大地限制了乳酸及聚乳酸行業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。尋找更加廉價(jià)、可持續(xù)的乳酸發(fā)酵原料成為今后的一大研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。第二代生物煉制過程,即基于木質(zhì)纖維素原料的發(fā)酵過程,對(duì)于乳酸發(fā)酵將是更具前景且更易于擴(kuò)大應(yīng)用的方法[2,6]。

秸稈作為一種農(nóng)業(yè)種植副產(chǎn)物和廢棄物,是重要的可再生生物質(zhì)資源。在我國(guó),秸稈主要以玉米、小麥、高粱、水稻、油菜、甘蔗及其他農(nóng)作物莖稈為主。據(jù)2018年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年產(chǎn)生各類秸稈近10億t,可收集量達(dá)到近9億t[4,6]。秸稈主要成分包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及少量蛋白質(zhì)等其他成分。通過各類物理或化學(xué)預(yù)處理及酶解,可以將秸稈轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖(葡萄糖、木糖等),同時(shí)也產(chǎn)生各種抑制物,如,糠醛、5-羥甲基糠醛(HMF)及酚類物質(zhì)等。經(jīng)過內(nèi)源產(chǎn)乳酸菌(LAB)發(fā)酵,或在各類微生物細(xì)胞工廠中構(gòu)建異源表達(dá)途徑,可以將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸。目前,以秸稈為原料生產(chǎn)乳酸仍面臨幾大問題,如,秸稈結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以分離、糖類物質(zhì)共利用困難、預(yù)處理過程產(chǎn)生各類有毒抑制物、纖維素酶價(jià)格較高、底物和產(chǎn)物抑制等[2,6-7]。為了解決這些問題,許多新型技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)并應(yīng)用至乳酸的高效生產(chǎn)中,如,高產(chǎn)乳酸的篩選和構(gòu)建、新型預(yù)處理技術(shù)、同步糖化發(fā)酵工藝、抑制物耐受性菌株篩選及選育等[2,8]。除此之外,為了進(jìn)一步減少生產(chǎn)步驟和降低發(fā)酵成本,一些研究也嘗試在微生物中表達(dá)纖維素酶生產(chǎn)基因,將秸稈直接轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖,進(jìn)一步生產(chǎn)乳酸[9]。筆者介紹了以各類秸稈為原料,通過內(nèi)源產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵或異源途徑構(gòu)建生產(chǎn)乳酸,以及發(fā)酵過程的控制和策略選擇的最新研究進(jìn)展,并對(duì)以秸稈為原料生產(chǎn)乳酸面臨的主要挑戰(zhàn)和解決辦法進(jìn)行了介紹與總結(jié)。

1 乳酸微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建

1.1 傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵

傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵是指人們利用乳酸菌等微生物轉(zhuǎn)化糖類物質(zhì)生產(chǎn)乳酸的過程。乳酸發(fā)酵遍布人們生活的各個(gè)方面,如,人們熟知的酸奶發(fā)酵、泡菜發(fā)酵和食品釀造等[10]。乳酸發(fā)酵對(duì)于人類發(fā)展十分重要,人們通過使用產(chǎn)乳酸菌保存食物,在產(chǎn)生乳酸的同時(shí),也營(yíng)造了酸性低氧環(huán)境,能促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng),并阻止其他微生物的生長(zhǎng),可以延長(zhǎng)食物保質(zhì)期,同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也給食物帶來了特定的風(fēng)味或香氣。常見的乳酸發(fā)酵菌種包括乳酸菌、片球菌、乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌、米根霉等[10-11]。

乳酸發(fā)酵分為同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵,兩者均以葡萄糖作為底物合成乳酸,且均在無氧條件下進(jìn)行,1 mol葡萄糖產(chǎn)生2 mol ATP。其不同點(diǎn)在于,同型乳酸發(fā)酵過程中,葡萄糖首先通過糖酵解途徑(EMP途徑)被分解為丙酮酸,丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下,生成乳酸。理論上1 mol葡萄糖可以轉(zhuǎn)化為2 mol乳酸(理論轉(zhuǎn)化率為100%),實(shí)際生產(chǎn)中,由于微生物存在其他生理活動(dòng)會(huì)消耗部分碳源,所以通常轉(zhuǎn)化率80%以上被認(rèn)為是同型乳酸發(fā)酵[12]。而在異型乳酸發(fā)酵中,由于缺乏磷酸果糖利用的酶,葡萄糖經(jīng)過磷酸戊糖途徑(PPP途徑)首先被轉(zhuǎn)化為5-磷酸核酮糖,進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為5-磷酸木酮糖,隨后在磷酸酮解酶(PK)的催化下,生成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸,前者進(jìn)入EMP途徑被轉(zhuǎn)化為丙酮酸,進(jìn)一步生成乳酸;后者在磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)的催化下,生成乙酰輔酶A,再經(jīng)乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶催化,最終生成乙醇(或乙酸)及CO2,故異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)物為1分子乳酸、1分子乙醇(或乙酸)和CO2,乳酸理論轉(zhuǎn)化率僅為50%[12]。

1.2 乳酸發(fā)酵細(xì)胞工廠的構(gòu)建

傳統(tǒng)乳酸通過微生物內(nèi)源產(chǎn)乳酸代謝途徑生產(chǎn)乳酸,其發(fā)酵周期長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)要求高、過程不易控制且乳酸產(chǎn)量較低,不適合大規(guī)模擴(kuò)大生產(chǎn),無法滿足人們的需求。隨著代謝工程和合成生物學(xué)的快速發(fā)展,人們已經(jīng)可以快速地對(duì)微生物代謝途徑進(jìn)行設(shè)計(jì)和重構(gòu),高效生產(chǎn)所需的化合物。在各種內(nèi)源產(chǎn)乳酸菌中,研究者應(yīng)用了各種方法,以提高其乳酸產(chǎn)量。Zhang等[13]對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BacilluscoagulansD-DSM1進(jìn)行改造,刪除了2個(gè)內(nèi)源L-乳酸脫氫酶基因(ldhL1和ldhL2),并在ldhL1基因的位置插入來源于徳氏乳桿菌Lactobacillusdelbrueckii的D-乳酸脫氫酶基因LdldhD,可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基不滅菌(培養(yǎng)溫度50 ℃)的D-乳酸高效生產(chǎn),產(chǎn)量為145 g/L,轉(zhuǎn)化率為0.98 g/g,光學(xué)純度達(dá)到99.9%。在副干酪乳桿菌Lactobacillusparacasei中,Tian等[14]通過構(gòu)建CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除D-乳酸生產(chǎn)基因(lhdD)并引入ldhL1基因,提高了L-乳酸的光學(xué)純度(超過99.0%)和產(chǎn)量(220 g/L),產(chǎn)率達(dá)到7.5 g/L/h。通過適應(yīng)性進(jìn)化,篩選得到了耐受高溫的菌株,實(shí)現(xiàn)在高糖條件下的開放式L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)。除了在內(nèi)源產(chǎn)乳酸菌中進(jìn)行代謝工程改造生產(chǎn)乳酸外,通過構(gòu)建異源表達(dá)途徑,許多內(nèi)源不產(chǎn)乳酸的微生物也被用于乳酸生產(chǎn)。這些微生物包括釀酒酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等。研究者在缺乏乳酸生產(chǎn)能力的釀酒酵母中,通過表達(dá)來源于腸膜明串珠菌LeuconostocmesenteroidesATCC 8293的專一性催化D-乳酸合成的D-乳酸脫氫酶基因(ldhA,LEUM_1756),實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母中D-乳酸的生產(chǎn)。隨后,通過敲除競(jìng)爭(zhēng)性途徑基因,如,丙酮酸脫氫酶基因(PDC1)、乙醇脫氫酶基因(ADH1)和3-磷酸甘油脫氫酶基因(GPD1、GPD2),提高了D-乳酸產(chǎn)量,達(dá)到112 g/L,產(chǎn)率為2.2 g/L/h[15-16]。Zhao等[17]在大腸桿菌SZ470中插入來源于乳酸片球菌Pediococcusacidilactici的L-乳酸脫氫酶基因ldhL,通過敲除乙醇脫氫酶基因ahdE及適應(yīng)性進(jìn)化,實(shí)現(xiàn)了以木糖為原料合成L-乳酸。當(dāng)木糖質(zhì)量濃度為70 g/L時(shí),L-乳酸產(chǎn)量為62 g/L,產(chǎn)率為1.63 g/L/h,光學(xué)純度達(dá)到99.5%,木糖轉(zhuǎn)化率為97%。在枯草芽孢桿菌中,研究者評(píng)估了5種外源D-乳酸脫氫酶基因的表達(dá)情況,這些基因包括來源于凝結(jié)芽孢桿菌B.coagulans的ldhA和gldA101以及來源于3種德氏乳桿菌L.delbrueckii的ldhA基因。結(jié)果表明,來源于德氏乳桿菌的一個(gè)lhdA基因具有最高的D-乳酸合成催化活性,在37 ℃時(shí),D-乳酸產(chǎn)量為1 mol/L,在48 ℃時(shí),D-乳酸產(chǎn)量為0.6 mol/L(轉(zhuǎn)化率為0.99 g/g葡萄糖)[18]。人工多菌體系,又稱混合發(fā)酵或混菌發(fā)酵,其原理是通過將產(chǎn)物合成途徑劃分為多個(gè)模塊,并分配到多個(gè)細(xì)胞或宿主中進(jìn)行表達(dá),在進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí),底物可以經(jīng)多個(gè)代謝模塊和多個(gè)宿主轉(zhuǎn)化,生成產(chǎn)物。該方法有助于降低底盤細(xì)胞的代謝壓力,提高底物轉(zhuǎn)化效率,解除反饋抑制,使得代謝途徑的全局調(diào)控更加靈活[19]。作為合成生物學(xué)的最前沿,人工多菌體系也已經(jīng)被應(yīng)用至乳酸生產(chǎn)中。在一些乳酸菌中,由于其異型乳酸發(fā)酵特性,往往會(huì)產(chǎn)生許多副產(chǎn)物,如,乙酸、乙醇等,導(dǎo)致乳酸產(chǎn)率降低,并且增加乳酸回收純化的成本。因此,采用同型和異型乳酸發(fā)酵菌混合培養(yǎng)是一種減少副產(chǎn)物產(chǎn)生的策略,利用可以快速同化葡萄糖的同型乳酸發(fā)酵菌,可以改變異型乳酸發(fā)酵菌的木糖代謝方式,減少副產(chǎn)物產(chǎn)生[8]。Zhang等[20]構(gòu)建短乳桿菌LactobacillusbrevisATCC 367和植物乳稈菌LactobacillusplantarumATCC 21028混合培養(yǎng)體系,利用生物質(zhì)水解糖進(jìn)行乳酸發(fā)酵。L.brevis是一種異型乳酸發(fā)酵微生物,可以同時(shí)利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)乳酸,但轉(zhuǎn)化率較低,為0.52 g/g。當(dāng)和L.plantarum進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí),乳酸轉(zhuǎn)化率明顯上升,為0.8 g/g,并且副產(chǎn)物積累有明顯降低。除此之外,由于許多微生物中缺乏木糖代謝途徑,無法同時(shí)利用秸稈水解液中的葡萄糖和木糖。設(shè)計(jì)和構(gòu)建能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖進(jìn)行乳酸發(fā)酵的人工多菌體系(一種微生物只利用葡萄糖產(chǎn)乳酸、一種微生物只利用木糖產(chǎn)乳酸),可以有效提高底物利用效率,也是一種重要的乳酸發(fā)酵策略。

2 以秸稈為原料生產(chǎn)乳酸

秸稈主要成分為纖維素(由β-1,4糖苷鍵連接的D-葡萄糖線性多聚物,占50%～60%)、半纖維素(各種糖類物質(zhì)的支鏈多聚物,包括D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖和D-半乳糖,占10%～30%)和木質(zhì)素(由香豆醇、松柏醇和芥子醇形成的無定形單晶聚合物,占10%～20%)。經(jīng)過水解,秸稈可以被轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵單糖,這些可發(fā)酵糖主要為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等。通過各類微生物細(xì)胞工廠,這些可發(fā)酵糖可以被轉(zhuǎn)化為乳酸,它們?cè)谖⑸镏械拇x途徑如圖1所示。當(dāng)以葡萄糖作為底物時(shí),在大多數(shù)微生物中,葡萄糖首先通過糖酵解途徑被轉(zhuǎn)化為丙酮酸,隨后在乳酸脫氫酶的催化下,生成乳酸。除此之外,在一些微生物中,葡萄糖首先在己糖激酶的催化下,被轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖,隨后進(jìn)入磷酸戊糖途徑,生成5-磷酸木酮糖。5-磷酸木酮糖進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖,兩者會(huì)再次進(jìn)入糖酵解途徑,轉(zhuǎn)化為丙酮酸,最后,丙酮酸生成乳酸。當(dāng)以木糖作為底物時(shí),其代謝途徑與葡萄糖不同,木糖可以通過木糖還原酶(XR)、木糖脫氫酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)3個(gè)酶催化下被轉(zhuǎn)化為5-磷酸木酮糖,也可以直接在木糖異構(gòu)酶(XI)單酶作用下,轉(zhuǎn)化為5-磷酸木酮糖。根據(jù)微生物種類不同,5-磷酸木酮糖具有不同的代謝途徑。5-磷酸木酮糖可以進(jìn)入磷酸戊糖途徑,被轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖,再進(jìn)入糖酵解途徑被轉(zhuǎn)化為丙酮酸和乳酸。另外,5-磷酸木酮糖也可以通過磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑(PK途徑)被利用,即在PK和PTA催化下,生成等摩爾的乳酸、乙醇(或乙酸)及CO2。阿拉伯糖則被轉(zhuǎn)化為木糖醇,隨后生成5-磷酸木酮糖,進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為乳酸。除此之外,以玉米秸稈和高粱秸稈為例,考慮到濕秸稈中還存在一定量的果糖或蔗糖,圖1還列舉了利用果糖和蔗糖為原料生產(chǎn)乳酸的代謝途徑。

LDH—L-乳酸脫氫酶;DLDH—D-乳酸脫氫酶;ADH—乙醇脫氫酶;PDC—丙酮酸脫羧酶圖1 秸稈基乳酸微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建及代謝通路Fig.1 Construction and metabolic pathways of straw-based lactic acid microbial cell factory

在各種微生物中,葡萄糖是最容易被利用的碳源,許多微生物中沒有木糖利用代謝途徑,當(dāng)以秸稈作為原料生產(chǎn)乳酸時(shí),需要引入外源木糖代謝途徑。除此之外,以木糖為底物時(shí),由于不同代謝途徑的存在,會(huì)造成副產(chǎn)物(乙醇、乙酸、CO2等)積累,不利于乳酸的轉(zhuǎn)化。通過代謝途徑抑制及代謝流重定向,可以抑制競(jìng)爭(zhēng)途徑,提高底物轉(zhuǎn)化率[8]。

秸稈水解可以通過化學(xué)催化和酶催化完成?；瘜W(xué)催化需要相對(duì)較高的溫度,容易產(chǎn)生有毒物質(zhì),而酶催化則只需相對(duì)較低的能量輸入,且具有更高的轉(zhuǎn)化效率。然而,酶催化水解過程卻受到秸稈相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)阻礙,使得酶無法有效地附著并催化水解。因此,秸稈預(yù)處理是一個(gè)必需的過程,有助于打開秸稈的復(fù)雜結(jié)構(gòu),有效促進(jìn)多糖的快速水解和釋放。預(yù)處理打開纖維素結(jié)構(gòu)的同時(shí),其苛刻條件導(dǎo)致部分半纖維素和木質(zhì)素降解產(chǎn)生有毒抑制物,對(duì)后續(xù)酶解和發(fā)酵產(chǎn)生抑制。常用的以秸稈為原料的乳酸發(fā)酵策略是分步糖化發(fā)酵(SHF),即將預(yù)處理后的秸稈進(jìn)行酶解,生成可發(fā)酵糖,再接種產(chǎn)乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵,生產(chǎn)乳酸。相比于分步糖化發(fā)酵,同步糖化發(fā)酵(SSF)產(chǎn)乳酸則更具優(yōu)勢(shì)。因?yàn)樵赟HF中,往往存在著反饋抑制。反饋抑制通常發(fā)生在酶水解過程中,當(dāng)纖維素被纖維素酶破壞分解產(chǎn)生葡萄糖時(shí),隨著葡萄糖摩爾濃度的增加,纖維素酶活性會(huì)被抑制,從而降低水解和糖形成速率。在SSF中,纖維素水解和發(fā)酵在一個(gè)體系中同時(shí)進(jìn)行,水解產(chǎn)生的糖類物質(zhì)可以很快被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物,可以解除糖對(duì)酶的抑制作用,有效減少末端產(chǎn)物抑制,提高酶解和發(fā)酵效率。目前,SSF仍存在一定問題,例如,大多數(shù)纖維素酶的最適酶解溫度為45～50 ℃,而大多數(shù)微生物在高溫條件下無法生長(zhǎng),造成酶解和發(fā)酵溫度不一致[4]。目前,只有少數(shù)幾種耐熱微生物可以實(shí)現(xiàn)同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,如,凝結(jié)芽孢桿菌、耐熱乳酸菌、枯草芽孢桿菌等[21]。

重組纖維素酶分解策略(RCS)的目的是模擬內(nèi)源纖維素降解微生物,對(duì)產(chǎn)乳酸菌進(jìn)行工程化設(shè)計(jì)和改造,使其擁有纖維素酶分泌能力,無須對(duì)秸稈進(jìn)行預(yù)處理和水解,直接使用一鍋法將秸稈發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乳酸[2]。這可以極大地降低乳酸的生產(chǎn)成本。通過在產(chǎn)乳酸菌中表達(dá)纖維素酶生產(chǎn)相關(guān)基因,并將纖維素酶分泌至胞外,可以將纖維素有效地分解為葡萄糖。這些酶包括外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶。目前,RCS已經(jīng)在一些產(chǎn)乳酸菌中得到應(yīng)用。研究者將來源于熱纖梭菌的內(nèi)切葡聚糖酶(Cel8A)引入乳酸菌L.plantarum中,可以實(shí)現(xiàn)乳酸菌以5～6個(gè)葡萄糖單元的纖維低聚糖為底物的生長(zhǎng)[22]。在乳酸乳球菌Lactococcuslactis中,研究者通過構(gòu)建人工操縱子,實(shí)現(xiàn)了內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的分泌表達(dá),該菌株可以代謝纖維八糖生產(chǎn)L-乳酸[23]。雖然RCS在產(chǎn)乳酸菌中已經(jīng)有一些應(yīng)用,但通過RCS進(jìn)行纖維素水解仍然面臨許多問題和挑戰(zhàn)。在工程化產(chǎn)乳酸菌中,據(jù)報(bào)道,外源表達(dá)的纖維素酶分泌對(duì)于微生物是有毒的,且其分泌途徑會(huì)飽和[2],這極大限制了重組產(chǎn)乳酸菌分泌的纖維素酶的數(shù)量。因?yàn)槠洳荒芡耆?、有效地降解?fù)雜木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu),使得它們只能代謝和水解,擁有8～9個(gè)纖維素單元的短鏈纖維糊精或部分降解纖維素。與內(nèi)源產(chǎn)纖維素酶的熱纖梭菌相比,重組產(chǎn)乳酸菌中表達(dá)的纖維素酶酶活僅為100 U/L,而熱纖梭菌中為100～1 000 U/L。除此之外,由于纖維素酶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制,需要使用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子延遲纖維素酶的表達(dá),將細(xì)胞生長(zhǎng)和纖維素酶表達(dá)過程分開。然而,目前這些啟動(dòng)子尚未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化使用,因?yàn)槠涫褂昧枯^大,從而增加了成本。同步糖化共培養(yǎng)發(fā)酵(SSCF)是解決上述問題的一種方法,將乳酸生產(chǎn)菌和纖維素酶分泌菌進(jìn)行共培養(yǎng),可以實(shí)現(xiàn)以纖維素為原料生產(chǎn)乳酸。Shahab等[24]構(gòu)建了人工的真菌-細(xì)菌群體,實(shí)現(xiàn)了以木質(zhì)纖維素為原料合成乳酸。通過構(gòu)建好氧的產(chǎn)纖維素酶的里氏木霉和兼性厭氧的乳酸菌共培養(yǎng)體系,當(dāng)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的微晶纖維素作為底物時(shí),乳酸產(chǎn)量達(dá)到34.7 g/L。進(jìn)一步地,通過聯(lián)合生物加工過程(CBP),實(shí)現(xiàn)了己糖和戊糖的同時(shí)利用,當(dāng)以未脫毒的蒸汽爆破預(yù)處理櫸木作為原料時(shí),乳酸產(chǎn)量可以達(dá)到19.8 g/L,轉(zhuǎn)化率為理論最大轉(zhuǎn)化率的85.2%。表1列舉和總結(jié)了近些年來報(bào)道的以秸稈基原料為底物,通過各類微生物細(xì)胞工廠以不同發(fā)酵方式生產(chǎn)乳酸的情況。

3 秸稈基原料生產(chǎn)乳酸面臨的主要問題與挑戰(zhàn)

3.1 葡萄糖效應(yīng)和底物抑制

在大多數(shù)微生物中,當(dāng)葡萄糖和木糖同時(shí)存在時(shí),優(yōu)先利用葡萄糖,當(dāng)葡萄糖被利用完后才利用木糖,這被稱為葡萄糖效應(yīng)(CCR)。當(dāng)以秸稈為原料生產(chǎn)乳酸時(shí),葡萄糖效應(yīng)會(huì)增加糖類物質(zhì)的利用時(shí)間,延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間,不利于乳酸的生產(chǎn)。因此,篩選和構(gòu)建可以同時(shí)利用葡萄糖和木糖的微生物,或開發(fā)新型的發(fā)酵工藝,對(duì)于以秸稈為原料生產(chǎn)乳酸至關(guān)重要。研究者在L.plantarum中引入木糖代謝途徑,以質(zhì)量濃度分別為75 g/L的葡萄糖和25 g/L的木糖混合物作為底物,D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到74.2 g/L,轉(zhuǎn)化率為0.78 g/g,未出現(xiàn)CCR現(xiàn)象[36]。除此之外,使用具有葡萄糖和木糖同時(shí)代謝能力的共培養(yǎng)體系進(jìn)行乳酸發(fā)酵,也是應(yīng)對(duì)CCR的一種策略[37]。底物抑制通常發(fā)生在糖摩爾濃度(如,六碳糖和五碳糖)較高的發(fā)酵過程中,底物摩爾濃度超過臨界水平導(dǎo)致菌株被抑制,表現(xiàn)為延遲期變長(zhǎng)、滲透壓脅迫、水活性降低和細(xì)胞裂解。滲透壓脅迫會(huì)造成細(xì)胞功能紊亂,由于糖摩爾濃度的增加,胞內(nèi)水分會(huì)通過滲透作用排出細(xì)胞,造成細(xì)胞脫水。底物抑制極大減弱了糖的利用,影響整個(gè)發(fā)酵過程及乳酸生產(chǎn)。因此,克服底物抑制是實(shí)現(xiàn)乳酸高效生產(chǎn)的一大挑戰(zhàn)。通過篩選和開發(fā)耐受高摩爾濃度底物的菌株、優(yōu)化發(fā)酵過程及添加滲透保護(hù)劑等方法,可以減弱底物抑制效應(yīng)[8]。

表1 各類微生物細(xì)胞工廠以秸稈基原料生產(chǎn)乳酸Table 1 Lactic acid production with various microbial cell factories with straw as the substrate

3.2 產(chǎn)物抑制

由于發(fā)酵過程中乳酸不斷累積,會(huì)造成系統(tǒng)pH降低,從而影響微生物生長(zhǎng)及乳酸的進(jìn)一步生產(chǎn)。生成的乳酸會(huì)滲透進(jìn)入細(xì)胞膜,從而改變細(xì)胞膜電勢(shì),導(dǎo)致胞內(nèi)酸化及細(xì)胞膜受損,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,被稱為產(chǎn)物抑制。通常,在乳酸發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基pH需控制在5～7之間[18]。因此,在傳統(tǒng)乳酸生產(chǎn)過程中,需在培養(yǎng)基中添加堿作為中和劑,將乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸鹽,以穩(wěn)定培養(yǎng)基pH。目前,以Ca(OH)2作為中和劑仍是主流方法,然而,該方法會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——CaSO4(石膏),給生產(chǎn)帶來極大負(fù)擔(dān)[2]。為了解決乳酸產(chǎn)物抑制的問題,研究者采用了各種策略。例如,在乳酸產(chǎn)生后,立即將乳酸從培養(yǎng)基中分離掉,被認(rèn)為是提高乳酸產(chǎn)量的有效方法,而這需要高效的分離技術(shù)支撐。將酶和細(xì)胞循環(huán)的連續(xù)同步糖化發(fā)酵過程,或?qū)⒚负图?xì)胞固定化,被認(rèn)為可以解決反饋、底物和產(chǎn)物抑制問題,有助于提高乳酸產(chǎn)量和摩爾濃度[2]。除此之外,通過菌種突變、篩選、選育和適應(yīng)性進(jìn)化等方法,尋找耐受高摩爾濃度乳酸和耐受高滲透壓的微生物,可以提高微生物對(duì)高摩爾濃度乳酸的耐受性,最終提高乳酸產(chǎn)量。Park等[38]通過核糖體RNA測(cè)序法在葡萄皮上篩選到了一株產(chǎn)D-乳酸的耐酸酵母菌株,命名為畢赤酵母Pichiakudriavzevii。該菌株可以在pH為2.0、50 ℃環(huán)境下生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步將該菌株用于乳酸商業(yè)化生產(chǎn),作者將來源于L.plantarum的D-乳酸脫氫酶基因(d-LDH)替換丙酮酸脫羧酶基因PDC1,其乙醇發(fā)酵途徑被重新定向。為了進(jìn)一步提高乳酸耐受性,該菌株被置于高摩爾濃度乳酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化,通過全基因組測(cè)序,結(jié)果證明一種新型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PAR1與乳酸耐受有直接關(guān)系。最終的改造菌株,其D-乳酸產(chǎn)量分別為135 g/L(pH為3.6)和154 g/L(pH為4.7),產(chǎn)率分別為3.66和4.16 g/L/h。在釀酒酵母中,Baek等[15]表達(dá)外源D-乳酸脫氫酶基因,實(shí)現(xiàn)了D-乳酸的生產(chǎn)。之后,通過適應(yīng)性進(jìn)化以及表達(dá)編碼與弱酸應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活因子HAA1,提高了該工程釀酒酵母對(duì)D-乳酸的耐受性,在不進(jìn)行中和的條件下,D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到48.9 g/L。進(jìn)一步通過多輪適應(yīng)性進(jìn)化,該菌株的乳酸耐受性進(jìn)一步提高,在pH為3.5時(shí),D-乳酸的產(chǎn)量可以提高至82.6 g/L,產(chǎn)率為1.50 g/L/h。

3.3 秸稈水解抑制物耐受

對(duì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的秸稈進(jìn)行預(yù)處理和水解是取得高乳酸產(chǎn)量的必要條件。然而,大多數(shù)的預(yù)處理方法均會(huì)導(dǎo)致抑制物的產(chǎn)生。預(yù)處理過程產(chǎn)生的抑制物主要包括三大類:1)呋喃衍生物;2)弱酸;3)酚類化合物。呋喃衍生物主要包括由己糖和戊糖降解產(chǎn)生的糠醛和5-羥甲基糖醛(HMF),會(huì)導(dǎo)致延遲期變長(zhǎng)。弱酸主要包括乙酸和甲酸,它們?cè)谝阴；芙饧翱啡┖虷MF降解過程產(chǎn)生。乙酸和甲酸均被證明會(huì)抑制微生物細(xì)胞生長(zhǎng),甲酸是最具抑制性的化合物之一[39]。最近的一項(xiàng)研究表明,香豆酸和阿魏酸等酚類化合物在質(zhì)量濃度超過1 g/L時(shí),顯著抑制幾種產(chǎn)乳酸微生物的生長(zhǎng)[39]。事實(shí)上,這些化合物的抑制機(jī)制不僅取決于每個(gè)化合物各自產(chǎn)生的抑制作用,還取決于它們之間的相互作用和協(xié)同作用。因此,在發(fā)酵過程中,使用可以穩(wěn)定耐受抑制物的微生物是實(shí)現(xiàn)具有成本競(jìng)爭(zhēng)力的乳酸生產(chǎn)過程的關(guān)鍵。近年來,許多策略已經(jīng)被應(yīng)用至解決秸稈預(yù)處理后抑制物釋放的問題,例如,篩選在預(yù)處理過程釋放較少抑制物的秸稈原料、對(duì)秸稈水解液進(jìn)行脫毒處理、采用同步糖化發(fā)酵等工藝緩解抑制物毒性、篩選對(duì)抑制物具有高耐受性的發(fā)酵菌株、通過適應(yīng)性進(jìn)化或代謝工程提高抑制物耐受性等[8]。Zhao等[40]分離得到一株乳酸片球菌P.acidilacticiDQ2,可以耐受質(zhì)量濃度分別為3.0 g/L的HMF、3.6 g/L的乙酸、3.2 g/L的乙酰丙酸。以酸處理和生物脫毒的玉米秸稈作為底物,通過SSF策略,乳酸產(chǎn)量為101.9 g/L,產(chǎn)率為1.06 g/L/h,轉(zhuǎn)化率為0.772 g/g。一株分離的枯草芽孢桿菌Bacillussp.P38可以耐受質(zhì)量濃度為10 g/L的糠醛和6 g/L的乙酸。在補(bǔ)料發(fā)酵中,利用玉米秸稈水解液作為底物,可以生產(chǎn)180 g/L L-乳酸,產(chǎn)率為2.4 g/L/h,轉(zhuǎn)化率為0.96 g/g[41]。Zhang等[42]分離的凝結(jié)芽孢桿菌B.coagulansJI12對(duì)于抑制物有較好的耐受性,其可以耐受質(zhì)量濃度分別為12 g/L的乙酸、4 g/L的糠醛,使用SSCF策略,可以轉(zhuǎn)化100 g干小麥秸稈生產(chǎn)46.12 g乳酸。

4 總結(jié)與展望

隨著生物可降解材料市場(chǎng)的逐漸擴(kuò)大,聚乳酸材料越來越受到市場(chǎng)的重視和青睞,其生產(chǎn)原料-乳酸的價(jià)格和成本成為影響整個(gè)行業(yè)的重要因素之一。因此,選擇合適且廉價(jià)的乳酸發(fā)酵原料,是實(shí)現(xiàn)聚乳酸擴(kuò)大化生產(chǎn)和應(yīng)用的關(guān)鍵因素。筆者總結(jié)了各類乳酸細(xì)胞工廠的構(gòu)建,以及以秸稈為原料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的最新研究進(jìn)展,重點(diǎn)介紹了乳酸合成代謝途徑的重構(gòu)、乳酸的發(fā)酵過程與工藝優(yōu)化,以及秸稈基原料發(fā)酵產(chǎn)乳酸面臨的主要問題和挑戰(zhàn)。目前,乳酸發(fā)酵生產(chǎn)仍然以淀粉基原料為主,雖然以秸稈為原料高效生產(chǎn)乳酸極具前景,但仍然面臨許多問題和挑戰(zhàn),如,能量輸入高、秸稈預(yù)處理酶價(jià)格高、微生物糖利用效率低、發(fā)酵過程產(chǎn)生不必要的副產(chǎn)物等,這些問題制約著以秸稈為原料生產(chǎn)乳酸的商業(yè)化應(yīng)用。針對(duì)這些問題和挑戰(zhàn),筆者提出了相應(yīng)的解決思路與途徑,如圖2所示。

圖2 秸稈基原料生產(chǎn)乳酸主要問題的解決思路與途徑Fig.2 Approaches to solve the problems in the production of lactic acid with straw as raw material

未來的研究將集中在以下幾個(gè)方面:1)“設(shè)計(jì)秸稈”,即篩選和評(píng)估新型的秸稈原料,目的是篩選預(yù)處理后產(chǎn)生較少抑制物,但能產(chǎn)生更多可發(fā)酵糖的原料,以減少發(fā)酵過程抑制和提高糖共利用效率;2)通過細(xì)胞表面展示技術(shù)、高效纖維素酶生產(chǎn)基因篩選、纖維素酶分泌菌-乳酸菌混菌發(fā)酵等方法改進(jìn)RCS策略,以期實(shí)現(xiàn)直接以秸稈為原料一步轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乳酸,降低原料處理和發(fā)酵過程成本;3)利用代謝工程和合成生物學(xué)方法,篩選、改造和優(yōu)化微生物全局代謝途徑,提高糖利用效率(混菌發(fā)酵)和菌株耐受性,獲得高產(chǎn)乳酸菌株;4)尋找和開發(fā)高效的乳酸發(fā)酵工藝和乳酸回收純化工藝,降低生產(chǎn)過程成本。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步、整合及合成生物學(xué)的發(fā)展,以秸稈基原料發(fā)酵乳酸,通過乳酸聚合進(jìn)一步制備生物可降解生物材料,在未來必將大有可為。