買 潔,余 霄,李文娟,聶志奎,紀曉俊

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院 材料化學工程國家重點實驗室,江蘇 南京 211800;2.江西新瑞豐生化股份有限公司,江西 新干 331300)

類胡蘿卜素是一大類含有40個C原子的四萜類化合物,在自然界植物、真菌、藻類等中廣泛存在。常見的有番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素等。類胡蘿卜素化學結構獨特、抗氧化作用強,被廣泛地應用于食品、醫(yī)藥和飼料等領域[1]。例如,番茄紅素作為最常見的類胡蘿卜素之一,因最早從番茄中發(fā)現而得名,具有延緩衰老、預防心血管疾病等功效,可被用于食品添加劑及保健品等。此外番茄紅素還具有抗癌活性,可以預防前列腺癌及胃腸道癌等[2-3]。β-胡蘿卜素是維生素A合成的前體,具有抗氧化、抗癌活性,也是食品添加劑、化妝品等的重要成分[4]。蝦青素,一種紅色的酮類類胡蘿卜素,主要用作水產養(yǎng)殖的飼料及食品添加劑。淡水綠藻雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)可以積累自身干重1.5%～3.0%的蝦青素,是天然蝦青素生產提取的重要來源[5]。因類胡蘿卜素在食品、醫(yī)藥等領域的廣泛應用,其市場價值在2017年已達到15億美元,據預測2022年類胡蘿卜素的市場需求有望增至20億美元[6]。但是,植物提取和化學合成的方法產量過低、提取分離工藝復雜,難以滿足當前市場需求,利用微生物合成類胡蘿卜素逐漸成為一種有前景的生產方式。

類胡蘿卜素已在許多非類胡蘿卜素生產菌株如釀酒酵母和解脂耶氏酵母等微生物中實現了異源表達[7-10]。解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是一種非常規(guī)產油酵母,可以積累達到自身干重80%以上的油脂,是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認證的安全微生物(GRAS),可以用于食品醫(yī)藥等行業(yè)的生產[11-13]。由于其安全高效、底物利用范圍廣等優(yōu)勢,解脂耶氏酵母近年來備受關注,已經被開發(fā)生產萜類[14-15]、功能性脂肪酸[16]、聚酮類[17]化合物等化學品。相比釀酒酵母的低脂質合成水平,解脂耶氏酵母具有豐富的乙酰CoA含量,自身脂質的積累有利于疏水性的類胡蘿卜素的儲存,解脂耶氏酵母是類胡蘿卜素異源生成的理想的細胞工廠[18-20]。在番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素等主要類胡蘿卜素的合成能力方面,解脂耶氏酵母要顯著優(yōu)于釀酒酵母(表1)。本文綜述了利用合成生物學策略促進解脂耶氏酵母合成類胡蘿卜素的研究進展,并對合成策略進行總結分類,以便更好地厘清類胡蘿卜素異源合成研究中的焦點問題及未來的研究方向。

表1 釀酒酵母和解脂耶氏酵母中類胡蘿卜素的合成Table 1 Biosynthesis of Carotenoids in Saccharomyces cerevisiae and Yarrowia lipolytica

1 類胡蘿卜素生物合成途徑

在解脂耶氏酵母中構建的類胡蘿卜素的合成途徑可以分為兩部分,上游甲羥戊酸(MVA)途徑合成前體香葉基香葉基焦磷酸(GGPP),以及下游不同類胡蘿卜素的合成(圖1)。MVA途徑是存在于解脂耶氏酵母的內源途徑,以乙酰CoA為底物,通過多步酶促反應,可以合成萜類的前體異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP),IPP和DMAPP可以作為C5單元繼續(xù)合成萜類的直接前體香葉基焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)和GGPP,其中GGPP是類胡蘿卜素合成共同的前體骨架[31]。該上游途徑生成的前體GGPP對類胡蘿卜素的產量具有重要影響,因此,對上游MVA途徑進行調控以提高GGPP的合成,為下游類胡蘿卜素的合成提供充足的前體具有重要作用。

Erg10—乙酰CoA硫解酶;Erg13—羥甲基戊二酸單酰CoA合成酶;HmgR—羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶;Erg12—甲羥戊酸激酶;Erg8—甲羥戊酸磷酸激酶;Erg19—甲羥戊酸磷酸脫羧酶;Idi—異戊烯焦磷酸異構酶;Erg20—法尼基焦磷酸合成酶;Ggpps—香葉基香葉基焦磷酸合成酶;Erg9—角鯊烯合酶;CrtE—GGPP合酶;CrtB —八氫番茄紅素合酶;CrtI/CarB—八氫番茄紅素脫氫酶;Ccd1—類胡蘿卜素裂解雙加氧酶;CrtW—β-胡蘿卜素酮化酶;CrtZ—β-胡蘿卜素羥化酶;CarRP/CarRA/CrtYB—八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環(huán)化酶圖1 類胡蘿卜素生物合成途徑Fig.1 The biosynthetic pathways of carotenoids

下游不同類胡蘿卜素的合成中,當前主要報道的有番茄紅素、β-胡蘿卜素和蝦青素等。番茄紅素是GGPP到類胡蘿卜素中合成途徑的第一個產物,通常通過異源表達GGPP合酶CrtE、八氫番茄紅素合酶CrtB、八氫番茄紅素脫氫酶CrtI[32]。CrtB催化前體GGPP縮合生成八氫番茄紅素,再由CrtI催化連續(xù)的去飽和反應生成番茄紅素。CrtI催化的番茄紅素合成是該途徑的限速步驟。番茄紅素是β-胡蘿卜素合成的前體,但在β-胡蘿卜素的途徑構建中CrtE、CrtB和CrtI并不是合成番茄紅素的唯一選擇,具有八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環(huán)化酶的雙功能酶(如，CarRP、CrtYB、CarRA)經常被用于β-胡蘿卜素合成途徑的構建。此外,Gao等[33]報道在解脂耶氏酵母中表達了一個新型CARS基因,該基因編碼具有八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素脫氫酶和番茄紅素β-環(huán)化酶活性的多功能胡蘿卜素合酶,成功檢測到β-胡蘿卜素的產生。以β-胡蘿卜素為前體,可以分別生成蝦青素和β-紫羅蘭酮等多種類胡蘿卜素[34]。β-酮化酶(CrtW)和β-羥化酶(CrtZ)催化β-胡蘿卜素生成蝦青素,蝦青素的合成途徑中存在多種中間類胡蘿卜素產物,包括海膽酮、角黃素、玉米黃質等,根據兩種酶不同的組合選擇,蝦青素的合成路徑不同(圖1)。

2 解脂耶氏酵母異源合成各種類胡蘿卜素的研究進展

2.1 番茄紅素

番茄紅素是類胡蘿卜素生物合成代謝途徑中的第一個產物,通過在解脂耶氏酵母中異源表達CrtE、CrtB和CrtI,構建番茄紅素的合成途徑。由于明顯的產物顏色和清晰的合成途徑,番茄紅素經常作為模式產物用于解脂耶氏酵母基因工程方法的驗證和合成生物學工具的開發(fā)[35-36]。如IUP(異戊二烯醇利用)途徑,是一種可以通過外源添加異戊烯醇經過兩步磷酸化生成前體IPP和DMAPP的人工合成途徑,曾被報道在大腸桿菌中構建,用于提高萜烯化合物前體的供應[37]。Luo等[22]首次在解脂耶氏酵母中導入了類似的IUP途徑,以番茄紅素為目標產物驗證途徑構建,通過外源添加異戊二烯醇,解脂耶氏酵母中的番茄紅素顯著提高。進一步,最終通過過表達異戊烯焦磷酸異構酶(Idi)、法尼基焦磷酸合成酶(Erg20),并增強脂質的合成,發(fā)酵得到了4.2 g/L的番茄紅素。由于解脂耶氏酵母中非同源末端重組(NHEJ)發(fā)生的頻率大于同源重組(HR),Bai等[36]在解脂耶氏酵母中過表達了DNA連接酶4dl4、促進蛋白Xrcc4、促進連接蛋白Paxx,并截短尿嘧啶(Ura)啟動子增加篩選壓力增加拷貝,建立了一種高效的基于NHEJ的迭代基因整合技術,導入番茄紅素合成途徑驗證,番茄紅素產量顯著提高,番茄紅素合成途徑基因(CRTE、CRTB、CRTI)在解脂耶氏酵母菌株中呈現多拷貝,以CRTB拷貝數最多(圖2)。此外,Schwartz等[35]在解脂耶氏酵母中構建了基于CRISPR/Cas9的HR整合,采用該方法后無篩選標記殘留,在MFE1、AXP、XPR2、A08、D17位點高效地發(fā)生同源重組,重組效率為49%～69%,實現了番茄紅素合成途徑的高效導入,表明該方法有效可行。

2.2 β-胡蘿卜素

β-胡蘿卜素通過催化番茄紅素環(huán)化生成,該步驟在解脂耶氏酵母中的實現通常通過導入具有八氫番茄紅素合酶及番茄紅素環(huán)化酶的雙功能酶實現。Gao等[38]曾報道在解脂耶氏酵母中引入來自卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)的雙功能酶CarRP和八氫番茄紅素脫氫酶CarB,通過“推-拉”策略過表達MVA途徑關鍵基因及多拷貝β-胡蘿卜素合成途徑基因CARRP和CARB(5個拷貝的CARRP),最終發(fā)酵得到了4 g/L 的β-胡蘿卜素。Liu等[39]則通過表達來自三孢布拉霉菌(Blakesleatrispora)的CarRA和CarB,以及相同過表達MVA途徑基因,得到了1.7 g/L的β-胡蘿卜素產量。在優(yōu)化β-胡蘿卜素生產的報道中,Larroude等[40]通過金門克隆(Golden Gate)組裝技術介導的啟動子改組技術,篩選出了β-胡蘿卜素表達盒最優(yōu)的翻譯延伸因子(TEF)啟動子,當β-胡蘿卜素表達盒CarTEF增加至2個拷貝數,β-胡蘿卜素產量達到6.5 g/L。最近,Liu等[24]報道了目前β-胡蘿卜素的最高產量7.6 g/L。除傳統(tǒng)代謝工程優(yōu)化外,由于解脂耶氏酵母的二態(tài)性,β-胡蘿卜素產量增加導致解脂耶氏酵母形態(tài)向菌絲體轉變,敲除調節(jié)形態(tài)相關的編碼基因CLA4和MHY1,成功將其形態(tài)調節(jié)至酵母態(tài),β-胡蘿卜素的產量相應增加了139%。β-胡蘿卜素不僅自身是具有多種功能的類胡蘿卜素,還是多種類胡蘿卜素合成的前體,在蝦青素、β-紫羅蘭酮的合成過程中,積累β-胡蘿卜素都是重要的一步。

2.3 蝦青素

蝦青素在解脂耶氏酵母中高產的關鍵是前體β-胡蘿卜素的積累以及β-酮化酶和β-羥化酶的選擇。Kildegaard等[34]首次在解脂耶氏酵母中實現了蝦青素的生物合成,通過表達β-胡蘿卜素合酶CrtYB和CrtI以及增強前體GGPP供應和下調競爭途徑,β-胡蘿卜素的產量達到了(797.1±57.2) mg/L。隨后,通過表達來自副球菌屬(Paracoccussp.)的β-胡蘿卜素酮化酶PsCrtW和菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)的β-胡蘿卜素羥化酶PaCrtZ以及后續(xù)的多拷貝優(yōu)化組合,得到了54.6 mg/L(3.5 mg/g·DCW)(細胞干重)的蝦青素產量。在提高前體β-胡蘿卜素的積累方面,Tramontin等[5]在解脂耶氏酵母中比較了不同來源的GGPP合酶,發(fā)現來自藍藻(Synechococcussp.)的GGPP合酶(Ggpps7)顯著提高了β-胡蘿卜素的產量。在解脂耶氏酵母合成蝦青素的過程中,由于中間代謝產物的積累,酶的偏好性造成蝦青素合成途徑代謝不平衡,β-酮化酶和β-羥化酶的組合篩選優(yōu)化可以平衡中間代謝物的產生,提高蝦青素的產量。最近Ma等[26]報道的蝦青素的合成達到了858 mg/L,他們篩選了最優(yōu)的組合PsCrtW/HpCrtZ(來自雨生紅球藻(H.pluvialis)的CrtZ),還將融合的酶定位到不同的亞細胞器中,包括脂滴、內質網和過氧化物酶體,有效減少中間代謝物的積累。Tramontin等[5]篩選比較β-酮化酶和β-羥化酶比率對蝦青素合成的影響,發(fā)現n(HpBkt)∶n(HpCrtZ)的比率為1∶1時,蝦青素產量最高,PsCrtW/PaCrtZ則在摩爾比為1∶3時，蝦青素產量最高,符合之前報道的β-羥化酶是蝦青素合成途徑的限制步驟。最近,Zhu等[41]通過篩選及迭代整合最高表達活性的HpCrtW/HpCrtZ,蝦青素產量達到了當前最高的3.3 g/L(41.3 mg/g·DCW)。值得注意的是,目前報道的途徑組合均沒有完全將中間代謝物轉化為蝦青素,在解脂耶氏酵母中提高蝦青素的合成還需要進一步探索。

2.4 其他

類胡蘿卜素結構多樣,除微生物中常異源合成的番茄紅素、β-胡蘿卜素和蝦青素外,還有許多其他類胡蘿卜素的生物合成有待開展(表2)。其中,β-紫羅蘭酮和玉米黃質的合成已有報道。以β-胡蘿卜素為前體,Lu等[30]采用模塊途徑工程的手段在解脂耶氏酵母中優(yōu)化了β-紫羅蘭酮的生物合成。整個合成途徑被分為3個模塊:乙酰CoA供應、MVA途徑以及β-紫羅蘭酮合成。通過提高乙酰CoA供應、過表達MVA途徑基因以及表達β-胡蘿卜素合成途徑基因(CARB、CARRP),導入矮牽牛(Petuniahybrida)的類胡蘿卜素裂解雙加氧酶 (Ccd1),最終β-紫羅蘭酮的產量達到了0.98 g/L。玉米黃質是蝦青素合成途徑的中間代謝產物,最近也被報道在解脂耶氏酵母中實現異源合成。Xie等[28]通過在解脂耶氏酵母中積累β-胡蘿卜素,篩選3種不同來源的CrtZ,玉米黃質的產量為(21.98±1.80)mg/L,產量偏低,還有待進一步優(yōu)化。此外,杜邦公司的專利還報道了多種新的類胡蘿卜素的生物合成方法,包括葉黃素、玉米黃質、角黃素、β-隱黃素等[42-43]。

3 解脂耶氏酵母積累類胡蘿卜素的合成生物學策略

3.1 增加前體乙酰CoA供應

乙酰CoA是MVA途徑的起始化合物,也是解脂耶氏酵母中碳代謝的中心代謝節(jié)點。增加酵母體內乙酰CoA的供應,也有利于增強類胡蘿卜素的合成。MVA途徑的乙酰CoA來源于解脂耶氏酵母胞漿,其主要來源于胞漿檸檬酸的裂解。因此過表達ATP-檸檬酸裂解酶編碼基因ACL1/2,可以有效增加乙酰CoA的可用性,Zhang等[45]的工作驗證了這一結論。他們還過表達了AMP脫氨酶(Ampd)以抑制異檸檬酸脫氫酶的活性,獲得更多可用的檸檬酸,番茄紅素的產量成功增加了3倍。但是在β-胡蘿卜素的合成中過表達Ampd時,并沒有觀察到類似的產量提高。此外,Lu等[30]在解脂耶氏酵母中合成β-紫羅蘭酮的研究中,構建了一種非氧化糖酵解途徑(PK-PTA)增強乙酰CoA供應。該途徑由磷酸酮醇化酶(Pk)和磷酸轉乙?；?Pta)組成,僅需四步就能從1 mol葡萄糖直接在細胞質中產生3 mol乙酰CoA。他們選取了兩種異源Pk和Pta組合研究,以乙酸滴度篩選,最終選取了乙酸滴度最高的來自兩歧雙歧桿菌(Bifdobacteriumbifdum)的BbPk和來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的BsPta。在解脂耶氏酵母中整合BbPk-BsPta途徑,β-紫羅蘭酮的產量提高了32%。

3.2 優(yōu)化表達途徑關鍵基因

類胡蘿卜素在解脂耶氏酵母中的表達策略,可以分為增強上游途徑提高前體GGPP的供應,以及拉動下游類胡蘿卜素分支途徑,提高目標產物的合成。優(yōu)化途徑關鍵基因,包括上游MVA途徑以及下游類胡蘿卜素合成途徑的關鍵基因,可以有效地提高相應類胡蘿卜素的合成。HMG-CoA還原酶(Hmgr),催化HMG-CoA生成MVA,是MVA途徑的限速步驟,過表達截短的Hmgr(tHmgr)能夠有效地提高MVA途徑的通量,是一種被廣泛應用的策略[9,49]。在已報道的解脂耶氏酵母異源合成類胡蘿卜素的研究中,Hmgr也被經常過表達以提高前體供應。而除了限速步驟Hmgr外,過表達MVA途徑的所有基因也被用來提高類胡蘿卜素前體供應,Gao等[38]通過推拉策略合成β-胡蘿卜素以及Lu等[30]合成β-紫羅蘭酮的工作中,MVA途徑相關酶的編碼基因的過表達均有效提高了目標產物的產量。此外,增加Hmgr的拷貝數也可以有效地提高類胡蘿卜素的合成,這在Gao等[38]和Liu等[39]合成類胡蘿卜素的工作中均有報道。Zhang等[48]則在過表達Hmgr的基礎上額外過表達了MVA途徑的基因ERG13,也成功了β-胡蘿卜素的產量。此外,GGPP是合成類胡蘿卜素的直接前體,解脂耶氏酵母中GGPP供應不足,因此過表達內源GGS1或者異源GGPP合酶如,CrtE、Ggpps7提高前體GGPP合成,是類胡蘿卜素合成中最重要也是最通用的策略[5]。其次,由于下游類胡蘿卜素合成途徑的基因是異源導入解脂耶氏酵母中的,自身活性限制導致上下游通量不平衡,從而導致類胡蘿卜素產量不高。因此,提高下游類胡蘿卜素合成途徑的拷貝數,可以顯著提高類胡蘿卜素產量。如,Bai等[36]以番茄紅素為目標產物在解脂耶氏酵母體內建立NHEJ基因整合方法,篩選出的高產番茄紅素的菌株。類似的,在解脂耶氏酵母異源合成β-胡蘿卜素的報道中,β-胡蘿卜素的合成途徑基因均為多拷貝表達[48]。

表2 多種類胡蘿卜素在解脂耶氏酵母中的異源合成Table 2 Heterologous biosynthesis of different carotenoids in Yarrowia lipolytica

續(xù)表

Acl1/2—ATP檸檬酸裂解酶;HmgR—羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶;Ggpps—GGPP合成酶;Gps—GGPP合成酶;HR—同源重組;NHEJ—非同源末端重組圖2 解脂耶氏酵母中異源合成類胡蘿卜素的合成生物學策略Fig.2 Synthetic biology strategies for heterologous biosynthesis of carotenoids in Yarrowia lipolytica

3.3 下調副產物競爭途徑

當在解脂耶氏酵母中構建目標類胡蘿卜素產物的異源合成途徑時,以FPP為前體的角鯊烯及麥角固醇合成途徑是四萜類類胡蘿卜素合成的競爭途徑[34]。因為相比于異源的類胡蘿卜素合成基因,內源的角鯊烯合酶Erg9具有較強的催化活性,所以FPP傾向于流向角鯊烯合成途徑。但由于角鯊烯是麥角甾醇的前體,麥角甾醇對細胞的流動性具有重要作用,因此,不能通過簡單的敲除角鯊烯的合成途徑基因來降低其積累,只能通過截短ERG9的啟動子或以弱啟動子替換ERG9啟動子達到下調競爭途徑的作用[34,53]。

脂質合成途徑由于和萜類合成共同競爭相同前體乙酰CoA,在解脂耶氏酵母的萜類化合物異源合成過程中是另一種競爭途徑。另外，由于四萜類胡蘿卜素是一種疏水性化合物,在解脂耶氏酵母胞內主要儲存在脂滴中,因此脂質合成途徑在類胡蘿卜素合成的解脂耶氏酵母菌株中經常被上調。Luo等[22]在番茄紅素的合成中,嘗試過表達Dga1和Acc1提高脂質合成,番茄紅素產量提高。由于脂質合成和番茄紅素合成共同競爭乙酰CoA前體,可能存在乙酰CoA供應不足的問題,通過外源添加棕櫚酸經由β-氧化途徑提高乙酰CoA供應,番茄紅素的產量提高了1.97倍。Matth?us等[9]通過敲除參與β-氧化的第一步基因POX1-6并敲除編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因GUT2,脂質體的積累增強了4倍,番茄紅素的積累也顯著增強。

4 結論與展望

解脂耶氏酵母與釀酒酵母相比,優(yōu)勢明顯,已成為生產類胡蘿卜素的常用底盤微生物之一。類胡蘿卜素生產的代謝工程研究重點,主要集中在代謝中心節(jié)點乙酰CoA合成的增強、前體MVA途徑的優(yōu)化以及下游異源途徑的優(yōu)化等。利用解脂耶氏酵母合成的類胡蘿卜素主要包括番茄紅素、β-胡蘿卜素和蝦青素等。類胡蘿卜素結構和種類多樣,其他重要應用價值的類胡蘿卜素產品,如,玉米黃質、葉黃素等的開發(fā)還有待進一步探索。此外,解脂耶氏酵母中生產類胡蘿卜素的合成生物學策略有待進一步嘗試,如,增加前體乙酰CoA的供應有多種途徑可以實現,乙酰CoA穿梭途徑中,肉堿乙酰轉移酶Cat2也被報道有顯著提高乙酰CoA的作用。前體GGPP的供應是類胡蘿卜素合成的限制因素之一,未來可進一步挖掘不同來源的GGPP合酶，提高GGPP的供應。此外，對于類胡蘿卜素合成途徑中關鍵的活性限制,除提高編碼基因的拷貝數外,定點突變和定向進化也可應用于提高相關酶的催化活性。這些策略均有望進一步優(yōu)化和提高解脂耶氏酵母中類胡蘿卜素的異源合成。