周狄霏,馮晨曦,宋書(shū)真,楊 松,2,3*,馬增新,2,3*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 青島 266109;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266109;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 青島生物沼氣環(huán)境微生物國(guó)際合作基地,山東 青島 266109)

第一次工業(yè)革命以來(lái)，隨著石油和煤炭等傳統(tǒng)碳基能源的開(kāi)發(fā)和利用，人類社會(huì)的勞動(dòng)生產(chǎn)率得到了極大提高，但推動(dòng)社會(huì)進(jìn)步的同時(shí)，也產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，CO2和甲烷等溫室氣體的大量外排，造成了全球溫室效應(yīng)的逐漸加劇，對(duì)人類的生存和持續(xù)發(fā)展構(gòu)成重大威脅[1]。應(yīng)對(duì)環(huán)境危機(jī)，世界各國(guó)積極響應(yīng)減少溫室氣體排放，我國(guó)國(guó)家主席習(xí)近平在第七十五屆聯(lián)合國(guó)大會(huì)上提出了中國(guó)將于2030年前實(shí)現(xiàn)碳達(dá)峰，2060年前實(shí)現(xiàn)碳中和的目標(biāo)[2]。如何更加有效地減少甚至利用這些溫室氣體作為化工原料,成為生物化工領(lǐng)域的近期研究熱點(diǎn)和焦點(diǎn)之一，2019年國(guó)家科技部合成生物學(xué)重點(diǎn)專項(xiàng)和2021年綠色生物制造重點(diǎn)專項(xiàng)都將C1生物催化轉(zhuǎn)化的研究和應(yīng)用示范作為專項(xiàng)資助。近期Li等[3]、Wang等[4]發(fā)現(xiàn)CO2通過(guò)化學(xué)催化方法可以高選擇性、高穩(wěn)定性加氫合成甲醇。還有研究者發(fā)現(xiàn)CO2還可加氫高效合成甲酸[5]。甲醇和甲酸作為CO2的衍生物是甲基營(yíng)養(yǎng)菌生長(zhǎng)的天然碳原料[6]，因而對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)菌的代謝工程改造,不但將助力于CO2減排的持續(xù)發(fā)展需求，而且為生物化工行業(yè)利用甲醇和甲酸這類重要替代原料提供了可能的甲基細(xì)胞工廠[6]。

甲基營(yíng)養(yǎng)菌是一類可以天然利用C1作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的微生物[7]。前期研究報(bào)道了代謝工程改造的甲基營(yíng)養(yǎng)菌可催化轉(zhuǎn)化甲烷和甲醇合成各類平臺(tái)化學(xué)品[7-9]，近期研究者還發(fā)現(xiàn)一些甲基營(yíng)養(yǎng)菌可以吸附和利用環(huán)境中的稀土元素，具有稀土金屬生物富集冶煉的潛在能力，因此，甲基營(yíng)養(yǎng)菌成為一類重要的應(yīng)用于生物制造和環(huán)境修復(fù)的細(xì)胞底盤，受到了研究者的廣泛關(guān)注[10-12]。甲基營(yíng)養(yǎng)菌中心代謝主要包含3個(gè)代謝模塊(圖1)，即C1氧化模塊、異化模塊以及同化模塊。甲烷和甲醇通過(guò)氧化途徑耦合異化途徑可以徹底被氧化為CO2，該過(guò)程為同化途徑和合成代謝提供還原力和能量；另一部分甲烷和甲醇的氧化產(chǎn)物(甲醛和甲酸)通過(guò)同化途徑進(jìn)入中心代謝，為生物大分子合成提供前體碳[13]。作為甲基營(yíng)養(yǎng)菌中心代謝的起始點(diǎn)，甲醇脫氫酶的研究受到了極大的關(guān)注，主要研究集中在提高其在胞內(nèi)表達(dá)水平和催化活性，從而提高甲醇消耗效率和中心代謝通量[14-15]。近年研究發(fā)現(xiàn)稀土元素(如，La、Ce、Gd、Nd)成為甲烷和甲醇氧化的關(guān)鍵調(diào)控因子，控制了不同類型的甲醇脫氫酶(即，MxaFⅠ和XoxF)的表達(dá)，影響中心代謝的通量分配[11-12,16-18]。基于對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)菌中心代謝的逐步理解，研究者為了進(jìn)一步提高甲基營(yíng)養(yǎng)菌同化代謝效率，減少能量和還原力的額外損耗，提出了新的代謝工程改造策略，如，構(gòu)建協(xié)同同化途徑[19]、構(gòu)建卡爾文循環(huán)[20](Calvin-Benson-Bassham cycle，CBB)、引入乙醛酸循環(huán)[21](glyoxylate cycle)和利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子耦合生物傳感器改造(sensor-assisted transcriptional regulator engineering，SATRE)[22]，這些新策略為進(jìn)一步提高甲基營(yíng)養(yǎng)菌合成目標(biāo)產(chǎn)品所需的代謝前體物奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

近年來(lái),陶雨萱等[23]、Zhang等[24]、高教琪等[25]、Zhou等[26]、張卉等[27]和Wang等[15]已從微生物甲醇轉(zhuǎn)化以及天然甲基營(yíng)養(yǎng)型和合成甲基營(yíng)養(yǎng)微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建等方面系統(tǒng)綜述C1研究。本文主要側(cè)重于闡述甲基營(yíng)養(yǎng)菌依賴稀土元素氧化甲烷和甲醇的代謝調(diào)控機(jī)制，并綜述了甲烷氧化菌為例的甲基營(yíng)養(yǎng)菌中心代謝的新認(rèn)知和甲醇利用菌代謝工程改造的新策略，以期為甲基營(yíng)養(yǎng)菌進(jìn)一步深入研究和改造利用提供一定的參考。

淺綠色區(qū)域—氧化代謝模塊；粉紅色區(qū)域—異化代謝模塊；綠色區(qū)域—4種不同類型的同化代謝模塊；XuMP cycle—木酮糖單磷酸途徑；RuMP cycle—核酮糖單磷酸途徑；Serine cycle—絲氨酸循環(huán)；CBB cycle—卡爾文循環(huán)；H4MPTP pathway—四氫蝶呤途徑；Ru5P—5-磷酸核酮糖；He6P—6-磷酸己酮糖；Xu5P—5-磷酸木酮糖；F6P—6-磷酸果糖；FBP—果糖-1，6-二磷酸；G3P—甘油醛-3-磷酸；DHAP—二羥基丙酮磷酸；6PG—6-磷酸葡萄糖酸；RuBP—1,5-二磷酸核酮糖；PGA—3-磷酸甘油酸；PEP—磷酸烯醇式丙酮酸；Serine—絲氨酸；Malate—蘋果酸；Glycerate—甘油酸；Glycine—甘氨酸；Acetyl-CoA—乙酰輔酶A；FDH—甲酸脫氫酶；MMOs—甲烷單加氧酶；NADPH—還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADP+—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADH—還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAD+—還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸圖1 甲基營(yíng)養(yǎng)菌利用不同代謝模塊同化甲醛、甲酸和CO2Fig.1 Formaldehyde,formate and carbon dioxide assimilated by methylotrophs used different metabolic modules

1 稀土元素對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)菌中心代謝的調(diào)控

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，稀土元素的添加有利于甲基營(yíng)養(yǎng)菌生長(zhǎng)。該現(xiàn)象除了與“鑭開(kāi)關(guān)”調(diào)控兩種類型甲醇脫氫酶的差異表達(dá)有關(guān)，還可能涉及中心代謝調(diào)控。2018年，Good等[35]以甲基營(yíng)養(yǎng)菌M.extorquensAM1為研究對(duì)象，在添加和未添加La3+條件下，通過(guò)RNA-seq(RNA測(cè)序)轉(zhuǎn)錄組和靶向代謝組分析，發(fā)現(xiàn)在添加La3+后,M.extorquensAM1的甲醇氧化途徑代謝物濃度發(fā)生了明顯的變化，隨著胞內(nèi)甲酸鹽濃度增加，絲氨酸循環(huán)途徑和乙基丙二酰輔酶A途徑(ethylmalonyl-CoA pathway，EMC pathway)也發(fā)生了顯著改變，即，絲氨酸循環(huán)途徑除乙醛酸外，大部分代謝物濃度不同程度減少，EMC途徑中除甲基琥珀酰輔酶A(Methylsuccinyl-CoA)和甲磺酸輔酶A(Mesaconyl-CoA)濃度上調(diào)，其他代謝物均不同程度下調(diào)。在添加La3+后，研究者推測(cè)可能這些中心代謝物的變化導(dǎo)致了M.extorquensAM1菌生長(zhǎng)速率提高15%～22%，生物量提高10%～12.5%。2018年，Akberdin等[18]對(duì)甲烷氧化菌M.alcaliphilum20ZR在添加La3+后的中心代謝變化進(jìn)行了多維組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在添加La3+后，菌體生長(zhǎng)速率提高了28%，但碳轉(zhuǎn)化率降低了30%～40%,結(jié)合蛋白質(zhì)組和代謝物組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)添加La3+導(dǎo)致脂肪酸降解途徑強(qiáng)化，TCA循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)中間代謝物及下游氨基酸(如，谷氨酸、谷氨酰胺及天冬酰胺等)含量增加，而核酮糖單磷酸途徑(ribulose monophosphate pathway，RuMP pathway)中多個(gè)代謝物含量降低(如，果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸等)。作者推測(cè)XoxF甲醇脫氫酶可能具備直接氧化甲醇生成甲酸的功能，XoxF與pMMO(particulate MMO，微粒型甲烷單加氧酶)耦合效率高，有利于電子傳遞，強(qiáng)化了甲烷的氧化，從而提高了菌體的生長(zhǎng)速率，但RuMP途徑的代謝流受限，降低了生物量的碳轉(zhuǎn)化效率。以上研究表明，兩種甲醇脫氫酶系統(tǒng)的存在，增強(qiáng)了菌體對(duì)動(dòng)態(tài)變化環(huán)境的適應(yīng)性和競(jìng)爭(zhēng)能力，也加深了對(duì)稀土元素調(diào)控不同類型甲基營(yíng)養(yǎng)菌中心代謝途徑的認(rèn)知。

—金屬螯合劑;+激活；-—抑制；TonB—TonB依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)體；ABC—ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；XoxF—XoxF型甲醇脫氫酶編碼基因；mxaF—MxaF型甲醇脫氫酶編碼基因；MxcQ—膜傳感器信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶；MxcE—雙組分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；MxbM—雙組分轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(反應(yīng)調(diào)節(jié)因子)；MxbD—雙組分轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(傳感器激酶);mxbDM—編碼雙組分轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MxbD和MxbM的基因圖2 甲基營(yíng)養(yǎng)菌中La3+對(duì)甲醇脫氫酶的調(diào)控機(jī)制Fig.2 The regulation mechanism of lanthanum ionson methanol dehydrogenase in methylotrophs

隨著上述理論研究的發(fā)現(xiàn)，也為利用稀土元素強(qiáng)化甲基細(xì)胞工廠合成化學(xué)產(chǎn)品提供了一定的借鑒，例如，在聚羥基脂肪酸(PHA)合成工程菌株M.extorquensAM1中添加La3+可強(qiáng)化菌體的生長(zhǎng)[36]；在△mxaF敲除的甲烷氧化菌MethylosinustrichosporiumOB3b中通過(guò)稀土元素(Ce3+)的添加和消除的兩階段培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)和甲醇生產(chǎn)的不斷切換[37]。未來(lái)隨著研究者逐步闡明稀土元素調(diào)控甲醇脫氫酶以及中心網(wǎng)絡(luò)的代謝機(jī)制，不但有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)甲基營(yíng)養(yǎng)菌甲烷和甲醇的代謝調(diào)控過(guò)程，而且為代謝工程改造甲基營(yíng)養(yǎng)菌提高C1的中心代謝效率提供了新的思路。

2 甲烷氧化菌的中心代謝新認(rèn)知

甲烷在全球儲(chǔ)量巨大，估計(jì)約為2 000億立方米[38]，它被認(rèn)為是下一代的碳原料，同時(shí)也是僅次于CO2的第二大溫室氣體，是減少溫室氣體排放的主要控制目標(biāo)。甲烷氧化菌可以利用甲烷作為唯一的能源和碳源生長(zhǎng)，在甲烷減排上具有廣闊的應(yīng)用前景。根據(jù)代謝途徑的不同，可將甲烷氧化菌分為三類[39]：1)利用核酮糖單磷酸途徑的Ⅰ類甲烷氧化菌(Ⅰ型和Ⅹ型，如M.buryatense5GB1、M.alcaliphilum20Z)；2)利用絲氨酸循環(huán)途徑的Ⅱ類甲烷氧化菌(Ⅱ型，如M.trichosporiumOB3b)；3)利用卡爾文循環(huán)的Ⅲ類甲烷氧化菌(Ⅳ型，如Verrucomicrobia)，如表1所示。

在Ⅰ型甲烷氧化菌中，由于M.buryatense5GB1菌具有生長(zhǎng)速率快(比生長(zhǎng)速率為0.23 h-1)、耐鹽堿能力強(qiáng)(培養(yǎng)條件：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%的NaCl、pH為9.5時(shí)生長(zhǎng)最佳)等生理生化特點(diǎn)，是甲烷生物轉(zhuǎn)化極具應(yīng)用前景的細(xì)胞工廠[40-42]。2017年，F(xiàn)u等[43]首次報(bào)道了基于13C標(biāo)記的M.buryatense5GB1中心代謝通量分配，闡述了Ⅰ型甲烷氧化菌的中心代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝流分配特點(diǎn)。當(dāng)M.buryatense5GB1以甲烷為碳源生長(zhǎng)時(shí)，利用13C標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn),RuMP途徑將3分子甲醛縮合為1分子C3化合物(如，丙酮酸、磷酸烯酮式丙酮酸(PEP))，會(huì)導(dǎo)致所有中間代謝物都被13C完全標(biāo)記，而丙酮酸和PEP下游羧化和脫羧反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致下游代謝物13C標(biāo)記位置和程度發(fā)生改變，這為代謝通量模擬計(jì)算提供了可能性。同時(shí)通過(guò)對(duì)中心代謝一些重要中間代謝物(如，蘋果酸、草酰乙酸)的標(biāo)記模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以甲烷為碳源生長(zhǎng)時(shí)，M.buryatense5GB1菌的氧化型TCA循環(huán)是完整的，在分別敲除fumA和fumC(編碼TCA循環(huán)的延胡索酸酶基因)突變菌株中進(jìn)行13C示蹤分析，發(fā)現(xiàn)突變菌株與野生型菌株相比，在蘋果酸和草酰乙酸的13C標(biāo)記模式上存在著明顯差異。此外，阻斷TCA循環(huán)將導(dǎo)致菌株合成還原力及能量受限，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。這些結(jié)果表明，TCA循環(huán)不僅為菌體合成生物量提供前體代謝物，還可以提供還原力和能量。該研究進(jìn)一步補(bǔ)充對(duì)M.buryatense5GB1中心代謝的認(rèn)知，為進(jìn)一步代謝改造提供了更多的可能性。

表1 甲烷氧化菌的分類Table 1 Classification of methanotrophs

M.buryatense5GB1菌的培養(yǎng)過(guò)程，不僅培養(yǎng)基組分復(fù)雜，而且不同培養(yǎng)條件會(huì)對(duì)其細(xì)胞生長(zhǎng)、碳代謝流分配、還原力以及能量再生等方面具有顯著影響。2021年，Hu等[44]、郭樹(shù)奇等[45]探究了M.buryatense5GB1菌在甲烷和O2不同摩爾比下優(yōu)化生長(zhǎng)的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)在n(CH4)∶n(O2)為0.93時(shí)，獲得最高比生長(zhǎng)速率為0.287 h-1，進(jìn)而通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組和代謝物組分析，闡述了其相關(guān)機(jī)制，結(jié)果表明與甲烷同化途徑、磷利用途徑和氮固定途徑的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平提高以及丙酮酸濃度增加有關(guān)，該研究為后期代謝工程改造提供了一定的理論借鑒。M.buryatense5GB1是一種僅能以甲烷和甲醇為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的專性甲基營(yíng)養(yǎng)菌[40]，長(zhǎng)期以來(lái)人們認(rèn)為，在甲烷和甲醇作為碳源生長(zhǎng)時(shí)，其中心代謝網(wǎng)絡(luò)是相同的[40,46]。直到2019年，F(xiàn)u等[47]通過(guò)代謝組和13C標(biāo)記的代謝通量分析等方法證明了在分別以甲烷和甲醇作為碳源時(shí)，中心代謝發(fā)生明顯變化。當(dāng)以甲烷為唯一碳源時(shí)，甲烷首先氧化為甲醇，氧化所需電子大部分源于甲醇氧化，僅小部分來(lái)自NADH，而以甲醇作為碳源時(shí)，甲醇氧化所產(chǎn)生的電子直接進(jìn)入呼吸鏈傳遞并泵出質(zhì)子產(chǎn)生ATP，這些結(jié)果表明在以甲醇為唯一碳源時(shí)產(chǎn)生過(guò)量ATP。因此，與以甲烷為碳源生長(zhǎng)相比，M.buryatense5GB1在甲醇上生長(zhǎng)，NADH脫氫酶表達(dá)較低且通過(guò)NADH氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP偏少。為進(jìn)一步平衡ATP代謝，M.buryatense5GB1菌在甲醇生長(zhǎng)時(shí)改變中心代謝通量分布，代謝流主要去往產(chǎn)生能量較少的2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸途徑(Entner-Doudoroff，ED途徑),而不是糖酵解途徑(Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP途徑)?；谏鲜鲅芯?，2021年,Nguyen等[42]進(jìn)一步闡明ED途徑是M.buryatense5GB1一個(gè)重要的代謝途徑。當(dāng)以甲烷作為碳源和能源時(shí)，研究者嘗試敲除ED途徑中編碼磷酸葡萄糖酸脫水酶和2-酮基-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖醛酸酯酶的基因edd和eda，但無(wú)法成功敲除，這證明了ED途徑對(duì)M.buryatense5GB1以甲烷為碳源生長(zhǎng)的重要性。隨后研究者用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換了edd-eda的天然啟動(dòng)子動(dòng)態(tài)調(diào)控ED途徑的edd和eda表達(dá)水平，通過(guò)生長(zhǎng)表型、酶活分析以及代謝通量模擬(flux balance analysis，F(xiàn)BA)，進(jìn)一步證明了加強(qiáng)ED途徑代謝流會(huì)導(dǎo)致合成ATP的減少，使得細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，但細(xì)胞仍需要edd-eda低水平表達(dá)以平衡細(xì)胞的能量和還原力合成通量。雖然到目前為止，還沒(méi)有成熟的機(jī)制解釋 ED 途徑的重要性，但ED途徑在維持中心代謝通量平衡方面確實(shí)具有重要的調(diào)節(jié)作用。

在甲烷氧化菌中除了以上關(guān)于能量和還原力方面的研究外，在碳轉(zhuǎn)化效率方面的研究也有一些進(jìn)展。前人研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型甲烷氧化菌的代表性菌株M.trichosporiumOB3b在固定CO2方面具有更高效的能力。2013年,Yang等[48]和Matsen等[49]基于轉(zhuǎn)錄組、代謝組和13C標(biāo)記代謝通量等分析策略，發(fā)現(xiàn)了M.trichosporiumOB3b(以甲烷為碳源，比生長(zhǎng)速率為(0.038±0.004) h-1)，其中有超過(guò)60%的生物量來(lái)自CO2固定，明顯高于M.extorquensAM1中約50%的生物量來(lái)源于CO2(以甲醇為碳源，比生長(zhǎng)速率為(0.118±0.004)h-1)。研究者推測(cè)M.trichosporiumOB3b通過(guò)有效利用中心代謝途徑的羧化酶，如，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PEPC)、丙酰輔酶A羧化酶(PCC)、NADP+依賴性蘋果酸酶(ME)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、丙酮酸羧化酶(PCX)，在同化6分子亞甲基四氫葉酸(methylene-tetrahydrofolate，Meh4F)的過(guò)程中固定8分子CO2，因此相比于M.extorquensAM1具有更強(qiáng)的CO2固定效力。上述研究為其他研究者改造M.trichosporiumOB3b催化甲烷合成3-羥基丙酸等產(chǎn)品的研究提供了借鑒[42]。

總之，甲烷氧化菌作為一個(gè)極具開(kāi)發(fā)前景的C1細(xì)胞平臺(tái)，對(duì)其生理生化特性、代謝網(wǎng)絡(luò)以及調(diào)控機(jī)制的深入認(rèn)知，將為甲烷氧化菌的代謝工程改造提供了新的思路。

3 甲醇利用菌中心代謝改造的新策略

甲醇利用菌的代表性模式菌是M.extorquensAM1，其中心代謝存在反應(yīng)步驟多、能量和還原力消耗水平較高、同化效率偏低等制約問(wèn)題[50]，因此將其作為甲基細(xì)胞工廠，在合成高附加值化學(xué)品(如，3-羥基丙酸[19,51]、甲羥戊酸[22,52]、蛇麻烯[53]、1-丁醇[54]、異丁醇[55]、丁二烯[56]等)方面存在著前體物供給不足、能量和還原力受限、生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成速率偏低等限制問(wèn)題，制約其作為高效甲基細(xì)胞工廠的發(fā)展?jié)摿27,52]。目前對(duì)于甲醇利用菌中心代謝網(wǎng)絡(luò)改造主要有以下策略：利用同化途徑轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子突變體庫(kù)耦合生物傳感器高通量篩選，強(qiáng)化中心代謝途徑中關(guān)鍵前體物的供給，提高下游產(chǎn)品產(chǎn)量[22,51]；引入CBB循環(huán)，將中心代謝同化途徑和異化途徑解耦聯(lián)，嘗試?yán)肅O2合成生物量而甲醇提供能量和還原力的混合營(yíng)養(yǎng)型生長(zhǎng)[20]；引入乙醛酸循環(huán)途徑替代EMC途徑[21]；整合天然甲基同化途徑，構(gòu)建更加高效、節(jié)能的協(xié)同同化途徑[19](圖3)。

2017年，Liang等[22]、Zhu等[52]以M.extorquensAM1作為細(xì)胞底盤工廠，引入異源基因構(gòu)建了甲羥戊酸合成途徑，但由于其前體物乙酰輔酶A是絲氨酸循環(huán)、TCA循環(huán)和EMC途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，導(dǎo)致難以理性改造提高其胞內(nèi)濃度，不利于為下游產(chǎn)品合成提供充足前體碳流。基于此，研究者開(kāi)發(fā)基于甲羥戊酸生物傳感器的轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程策略，調(diào)控中心代謝通量重新分配。轉(zhuǎn)錄因子QscR能夠調(diào)控絲氨酸循環(huán)中多個(gè)順?lè)醋觭ga-hpr-mtdA-fch(分別編碼絲氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶-羥基丙酮酸還原酶-NADP依賴性亞甲基四氫甲蝶呤/亞甲基四氫葉酸脫氫酶-次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶)、mtkA-mtkB-ppc-mclA(分別編碼果酸硫激酶-磷酸烯醇丙酮酸羧化酶-蘋果酰輔酶A裂解酶)和glyA(編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)的表達(dá)。研究者利用易錯(cuò)PCR(polymerase chain reaction)方法對(duì)QscR進(jìn)行隨機(jī)突變，導(dǎo)致胞內(nèi)中心代謝通量發(fā)生改變，進(jìn)而通過(guò)甲羥戊酸生物傳感器進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)了使乙酰輔酶A含量提升7%的QscR突變序列，從而導(dǎo)致甲羥戊酸產(chǎn)量提高1.6倍。應(yīng)用類似生物傳感器策略，未來(lái)可通過(guò)對(duì)中心代謝通量的動(dòng)態(tài)擾動(dòng)，尋找提高相應(yīng)下游產(chǎn)物合成的重要突變位點(diǎn)，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

G6P—葡萄糖-6-磷酸；6PGL—6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯;Ri5P—核糖-5-磷酸；S7P—景天庚酮糖-7-磷酸；E4P—赤蘚糖-4-磷酸；2PG—2-磷酸甘油酸；3PG—3-磷酸甘油酸；OAA—草酰乙酸；Malyl—CoA-蘋果酰輔酶A；Pyruvate—丙酮酸；Citrate—檸檬酸；Succinyl—CoA-琥珀酰輔酶A ；Mesaconyl-CoA—中康酰輔酶A；3HB-CoA—3-羥基丁酰輔酶A；EMC Pathway—乙基丙二酰輔酶A途徑圖3 甲基營(yíng)養(yǎng)菌協(xié)同同化途徑Fig.3 Synergistic assimilation pathway of methylotrophs

2018年，Schada等[20]在M.extorquensAM1中異源表達(dá)用于CO2固定的CBB循環(huán)途徑，嘗試構(gòu)建混合營(yíng)養(yǎng)型甲基細(xì)菌。通過(guò)敲除甲醇同化途徑必需基因ftfL(編碼甲酸四氫葉酸連接酶)，將同化途徑和異化途徑解耦聯(lián)。敲除基因ftfL導(dǎo)致突變菌不能在甲醇上生長(zhǎng)，作者進(jìn)而引入驅(qū)動(dòng)CBB循環(huán)的必需基因prk(編碼核酮糖磷酸激酶)和ruBiosCO(編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶)，使菌體生物量合成源于CO2的固定，能量和還原力由甲醇氧化供給。通過(guò)生長(zhǎng)表型測(cè)定、13C示蹤分析和蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)[20]，證明了該方法可以實(shí)現(xiàn)固定CO2合成生物量，但由于CBB途徑不足以合成充足的乙醛酸、甘氨酸和絲氨酸等生長(zhǎng)所需的前體物，使得同化效率低，不能維持菌體的持續(xù)生長(zhǎng)。未來(lái)還需通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化(ALE)等策略進(jìn)一步強(qiáng)化CBB循環(huán)重要底物核酮-1,5-二磷酸的供給以及CBB產(chǎn)物向生物量的轉(zhuǎn)化。

2018年，Schada等[21]在M.extorquensAM1中又引入了乙醛酸循環(huán)途徑，阻斷了本源乙醛酸合成的EMC途徑，嘗試?yán)肊MC途徑的中心代謝物合成目標(biāo)產(chǎn)品巴豆酸。作者通過(guò)過(guò)表達(dá)異檸檬酸裂解酶(aceA)和蘋果酸合酶(aceB)引入了異源的乙醛酸循環(huán)途徑，但在阻斷了EMC途徑的突變株中驗(yàn)證，均不能在甲醇上生長(zhǎng)。酶活分析表明，甲醇氧化途徑中的關(guān)鍵酶MeDH(甲醇脫氫酶)和FDH(甲酸脫氫酶)活性不足是造成甲醇生長(zhǎng)缺陷的原因之一。作者進(jìn)一步嘗試添加乙酸作為碳源，強(qiáng)化了TCA循環(huán)，實(shí)現(xiàn)了基于乙醛酸循環(huán)的細(xì)胞生長(zhǎng)，進(jìn)而在敲除編碼巴豆酰輔酶A 羧化酶/還原酶基因ccr的菌株中，異源表達(dá)CoA-硫酯酶，實(shí)現(xiàn)了提高巴豆酸的合成量。該研究證明了M.extorquensAM1中心代謝重塑的潛力，并為未來(lái)利用甲基營(yíng)養(yǎng)菌 EMC途徑的中間代謝物合成下游產(chǎn)品提供了一定的借鑒。

M.extorquensAM1利用絲氨酸循環(huán)同化甲醛時(shí)存在著代謝反應(yīng)步驟多、高耗能、高耗還原力等缺陷，每生成1分子乙酰輔酶A時(shí)，消耗3分子ATP和3分子NAD(P)H，不利于高還原度產(chǎn)品的合成。而Ⅰ型甲基營(yíng)養(yǎng)菌的RuMP途徑耦合非氧化性磷酸戊糖途徑(non-oxidative pentose phosphate pathway)及EMP途徑時(shí)，每生成1分子乙酰輔酶A時(shí)，產(chǎn)生1分子ATP和2分子NADH，比絲氨酸循環(huán)具有明顯的還原力和能量合成優(yōu)勢(shì)，但也存在同化過(guò)程中產(chǎn)生CO2導(dǎo)致三分之一的碳損失問(wèn)題。2021年,Yuan等[19]基于基因組尺度的代謝通量分析預(yù)測(cè)，將RuMP途徑引入M.extorquensAM1菌中，構(gòu)建與絲氨酸循環(huán)協(xié)同同化甲醛的細(xì)胞底盤，顯著提高菌體的生長(zhǎng)效率，結(jié)果見(jiàn)圖3。研究者首先在M.extorquensAM1中敲除絲氨酸循環(huán)相關(guān)基因hprA(編碼羥基丙酮酸還原酶)，構(gòu)建了甲醇同化缺陷型菌株，進(jìn)而引入RuMP途徑必需基因hps(編碼己酮糖-6-磷酸合成酶，HPS)和phi(編碼己酮糖-6-磷酸異構(gòu)酶，PHI)，通過(guò)甲醇和琥珀酸雙碳源體系篩選出hps-phi的最佳組合。為進(jìn)一步提高RuMP途徑同化甲醛的效率，增加前體物Ru5P的供給，研究者過(guò)表達(dá)氧化型磷酸戊糖途徑關(guān)鍵基因zwf(編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，并引入異源磷酸果糖激酶(PFK)，使代謝通量能夠從F6P去往C3中間代謝物，使得協(xié)同同化途徑進(jìn)一步加強(qiáng)，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率提高了16.5%，甲醇消耗速率提高13.1%，還原力NADPH含量提高了1.3倍。以該底盤細(xì)胞生產(chǎn)3-羥基丙酸，搖瓶產(chǎn)量是對(duì)照菌產(chǎn)量的3.1倍，初步發(fā)酵罐放大培養(yǎng)后，產(chǎn)量達(dá)到0.857 g/L。該研究證明構(gòu)建協(xié)同同化途徑是提升甲基營(yíng)養(yǎng)菌中心代謝碳效率以及還原力水平的有效策略，但是目前構(gòu)建的協(xié)同同化菌株RuMP途徑同化效率仍然較低，未來(lái)需要進(jìn)一步的優(yōu)化改造。

4 展望

雖然人們發(fā)現(xiàn)了稀土元素對(duì)于甲基營(yíng)養(yǎng)菌的甲醇和甲烷代謝存在調(diào)控作用，也發(fā)現(xiàn)了其中參與的一些關(guān)鍵元件，但其確切調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步挖掘，例如，甲基營(yíng)養(yǎng)菌是如何感知并轉(zhuǎn)運(yùn)稀土元素，以及稀土元素如何通過(guò)MxcQE/MxbDM調(diào)控系統(tǒng)對(duì)xoxF、mxaF基因啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控[29]，xoxF如何對(duì)mxaF轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控[17]等。稀土元素對(duì)于甲基營(yíng)養(yǎng)菌調(diào)控機(jī)制的系統(tǒng)闡明，將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)甲基營(yíng)養(yǎng)菌對(duì)于甲醇和甲烷代謝的調(diào)控機(jī)制，拓展其在金屬富集冶煉和化學(xué)品生物合成等[58]領(lǐng)域的應(yīng)用。

目前，關(guān)于甲基營(yíng)養(yǎng)菌中心代謝的工程優(yōu)化改造仍存在一些問(wèn)題，首先將 C1利用的異源途徑(如，RuMP途徑)引入天然底盤菌中構(gòu)建協(xié)同同化途徑[19]，雖然加快了菌體生長(zhǎng)速率，促進(jìn)了胞內(nèi)代謝物合成，但未能明顯加強(qiáng)碳轉(zhuǎn)化率，且引入的異源同化途徑和本源同化途徑適配性不高，產(chǎn)品合成效率偏低，因此如何進(jìn)一步提高RuMP和絲氨酸循環(huán)途徑的協(xié)同性，強(qiáng)化RuMP關(guān)鍵底物核酮糖-5-磷酸的供給，仍然是亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。未來(lái)通過(guò)對(duì)中心代謝路徑更加優(yōu)化的理性設(shè)計(jì)，以及結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化策略，從而對(duì)菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行更合理改造是行之有效的解決思路。

近年來(lái)，隨著對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)菌的深入研究，遺傳改造工具得到快速開(kāi)發(fā)利用，如,2019年，Carrillo等[59]以M.extorquensAM1為宿主，成功構(gòu)建出不同表達(dá)水平的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該系列啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)為未來(lái)甲基營(yíng)養(yǎng)菌深入工程改造提供一個(gè)備選的工具；2020年，筆者實(shí)驗(yàn)室和清華大學(xué)邢新會(huì)課題組合作，Mo等[60]首次在甲醇利用菌M.extorquensAM1中構(gòu)建CRISPRi(短回文重復(fù)序列)技術(shù),為挖掘M.extorquensAM1的潛在功能基因以及從甲醇中生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品提供了另一個(gè)有用的改造工具。Small regulatory RNA(小調(diào)控核糖核酸，sRNA) 作為細(xì)菌中一個(gè)重要的調(diào)控因子，已被應(yīng)用于多種菌株的基因抑制，2021年，Zhu等[61]以M.extorquensAM1為宿主，構(gòu)建了一個(gè)與大腸桿菌MicC和內(nèi)源性Hfq結(jié)合的sRNA系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過(guò)靶向干擾類胡蘿卜素合成相關(guān)基因crtl，減少類胡蘿卜素的產(chǎn)生。此外針對(duì)甲烷氧化菌異源基因表達(dá)，大多數(shù)方法還是通過(guò)菌菌結(jié)合方式實(shí)現(xiàn)，耗時(shí)較長(zhǎng)、操作復(fù)雜，而且需要幫助菌株進(jìn)行輔助[62]。2021年，Hu等[63]優(yōu)化了甲烷氧化菌M.buryatense5GB1的電擊轉(zhuǎn)化技術(shù)，顯著提高了轉(zhuǎn)化效率。這些遺傳改造工具的開(kāi)發(fā)，為促進(jìn)甲基營(yíng)養(yǎng)菌的細(xì)胞工廠構(gòu)建提供了有效技術(shù)支撐。

當(dāng)今甲基營(yíng)養(yǎng)菌已經(jīng)成為直接或間接催化轉(zhuǎn)化溫室氣體(甲烷、CO2)及其衍生物(甲醇、甲酸)生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的重要細(xì)胞工廠之一，未來(lái)隨著對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)菌的深入研究及其遺傳改造工具的日趨完善，將會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)甲基營(yíng)養(yǎng)菌在生物化工領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。