孫 楊,李 佳,朱麗英,江 凌

(1.南京工業(yè)大學 食品與輕工學院,江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學 化學與分子工程學院,江蘇 南京 211800)

食品供應的全球化加劇了食品安全控制和可追溯性等研究的難度,每年約6億人因為食品污染問題而患病,并導致其中約42萬人死亡,從而引起人們的關注,并成為世界性問題[1]。美國營養(yǎng)標簽和教育法案、歐盟國家的新歐洲法規(guī)以及“蒙特利爾議定書”對食品實驗室提出了一定要求[2]。現(xiàn)行的《中華人民共和國食品安全法》對于食品中的添加劑、食源性致病菌、農(nóng)獸藥殘留、重金屬和生物毒素等有明確和嚴格的規(guī)定。為了應對這些挑戰(zhàn),這就要求科研人員開發(fā)出高效的檢測手段來檢測食源性致病菌,才能保障食品安全。

2020年諾貝爾化學獎頒給了對成簇間隔的短回文重復序列(CRISPR)做出創(chuàng)新性研究的Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna,從而使人們再次對她們所發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)產(chǎn)生了濃厚興趣并引起更多的關注。CRISPR及其相關Cas蛋白構成了古細菌和細菌中抵御外源核酸物質(zhì)入侵的適應性免疫系統(tǒng),該系統(tǒng)可以降解外源入侵的核酸[3-4],隨后被開發(fā)為基因編輯工具。然而,隨著Cas12a和Cas13a的反式切割活性被發(fā)現(xiàn),基于Cas13a的SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)和基于Cas12a的DETECTR(DNA endonuclease-targeted CRISPRtransreporter)相繼被開發(fā)為核酸檢測平臺,并成為分子診斷領域的熱點[5-6]。但是上述平臺在檢測非核酸物質(zhì)方面的缺陷限制了其更廣闊的應用。

作為一門新興學科,合成生物學在應對這種缺陷時表現(xiàn)出具有巨大的潛力。合成生物學家通過“設計—搭建—測試—學習”,開發(fā)了種類繁多的生物元件,構建了更加精密且智能的基因電路。核糖開關、轉錄因子、適配體等功能性核酸/蛋白作為元器件,結合CRISPR核酸檢測技術,在離子、氨基酸、輔酶、食源性致病菌、毒素和農(nóng)獸藥殘留等方面的檢測應用,為分子診斷學帶來了新的機遇。

筆者概述了CRISPR系統(tǒng)的分類及其代表蛋白的作用機制,如何利用不同的Cas蛋白的特性進行檢測分析,列舉了不同的元器件及其應用。筆者也分析了不同元器件和CRISPR系統(tǒng)的組合,并概述了該技術在食品檢測中的應用,同時展望了合成生物學和CRISPR檢測技術在食品檢測中的應用前景和未來研究方向。

1 CRISPR的概述

1987年,日本科學家首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)CRISPR,經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn),CRISPR系統(tǒng)是多數(shù)細菌和古細菌的一種適應性免疫防御系統(tǒng),通過適應、表達和干擾3個階段介導的免疫機制,用于抵制外源核酸及噬菌體的入侵[3-4]。該系統(tǒng)主要由DNA靶向間隔序列、非重復間隔序列和Cas效應蛋白組成。

1.1 CRISPR系統(tǒng)的分類

根據(jù)Cas效應蛋白可將CRISPR系統(tǒng)分為2大類,包含6小類、33個亞型(圖1)。

第一類CRISPR-Cas系統(tǒng)中的Cas蛋白具有多亞基效應器復合物,介導CRISPR RNA前體(pre-crRNA)加工和結合以及通過裂解進行干擾,主要有Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型蛋白,分別包括Cas3、Cas10和Csf1[7-9]。研究表明,大約90%的CRISPR-Cas系統(tǒng)屬于第一類,廣泛存在于真菌中,少數(shù)存在于細菌中[10]。Ⅰ型系統(tǒng)由多個效應蛋白協(xié)同作用:Cas6或Cas5介導CRISPR RNA(crRNA)解旋并與靶DNA結合,Cas7穩(wěn)定R環(huán),然后Cas3切割靶DNA[8,11]。Ⅲ型系統(tǒng)由Csm復合物(Ⅲ-A系統(tǒng))、Cmr復合物(Ⅲ-B系統(tǒng))和crRNA組成。該系統(tǒng)的Cas10可以產(chǎn)生環(huán)狀寡核苷酸-(A)核苷酸,激活Csm6的RNA酶活性,切割靶RNA[12-13]。Ⅳ型系統(tǒng)由于存在于質(zhì)粒中,暫時還不了解其作用機制[14],但是有研究表明Ⅳ型系統(tǒng)可能促進細胞內(nèi)和質(zhì)粒間的競爭,在調(diào)節(jié)質(zhì)粒之間的沖突方面發(fā)揮了作用,并且與Ⅰ型CRISPR-Cas系統(tǒng)之間存在串擾[15-16]。此外,有報道顯示Ⅳ-B型CRISPR核糖體核蛋白復合物由1個類Cas7絲和1個小亞單位(Cas11)絲纏繞而成,但該復合體缺乏RNA加工和靶DNA切割的亞基[17]。

圖1 CRISPR系統(tǒng)的分類Fig.1 Classification of the CRISPR system

第二類CRISPR-Cas系統(tǒng)中的Cas蛋白具有單個蛋白的效應器復合物,主要有Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型蛋白,主要存在于細菌中,由于其簡單高效的特點,已經(jīng)被研究人員開發(fā)應用于基因編輯和核酸檢測,其中典型的代表是CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas14a[18]。與第一類蛋白不同的是,第二類蛋白只需要一個多域,就能與crRNA形成復合物,從而切割靶標。這些蛋白的概述、相應特征效應蛋白和特性列于表1中。

表1 應用于基因編輯和核酸檢測領域的效應蛋白Table 1 Effector proteins used in gene editing and nucleic acid detection

1.2 基于CRISPR/Cas的檢測技術的原理

目前基于CRISPR/Cas的檢測技術根據(jù)不同Cas蛋白(表1)的不同作用機制主要分兩類(圖2):一類是在向?qū)NA(sgRNA)的引導下,利用酶促失活的Cas9 效應蛋白(dCas9)，具有識別靶標核酸的能力而開發(fā)的檢測方法。例如，通過使用一對dCas9蛋白各連接一半熒光素酶來進行檢測[19];另一類是Cas蛋白(Cas12a、Cas13a和Cas14a)與靶DNA或RNA結合,在crRNA的引導下，進入激活狀態(tài),不僅能切割特定的DNA或RNA,還能切割環(huán)境中的任何DNA或RNA。將其與熒光-猝滅基團偶聯(lián),進而開發(fā)為檢測方法,其中代表性的SHERLOCK和DETECTR檢測平臺已廣泛應用病毒、食源性致病細菌和食源性致病真菌的檢測當中[20]。

1.3 CRISPR-Cas9/dCas9

Cas9/dCas9是Ⅱ型蛋白家族中的特征蛋白,其核酸檢測主要依賴于特異性識別靶序列的能力,針對靶序列設計特異性的sgRNA,可實現(xiàn)對不同基因型的檢測[21]。dCas9由于缺乏執(zhí)行平末端鏈斷裂的能力，但可以識別雙鏈DNA(dsDNA)，被開發(fā)為檢測工具(圖2)。此外，基于Cas9的檢測方法NASBACC已經(jīng)被開發(fā)用于檢測Zika病毒[22]。諸多基于Cas9/dCas9的DNA傳感方法的研究的主要原理包括:由dCas9伴侶來引導重組分裂蛋白[19]、基于Cas9破壞含有PAM的位點[22]以及Cas9誘導的非靶向DNA鏈解離作為等溫擴增的靶點[23]。

NFluc—N端部分的熒光素酶;CFluc—C端部分的熒光素酶;crRNA-Cas—crRNA和Cas組成的復合物；sgRNA—向?qū)NA圖2 CRISPR/Cas系統(tǒng)檢測原理Fig.2 Principle of the CRISPR/Cas system for detection

1.4 CRISPR-Cas12a

Cas12a(也被稱為Cpf1)是第二大類Ⅴ型系統(tǒng)的代表蛋白,由RNA引導,靶向 DNA的Cas蛋白,其RuvC核酸內(nèi)切酶域介導單鏈DNA(ssDNA)或dsDNA的切割,但基于dsDNA切割需要5'-(T)TTN PAM[24]。Cas12a-crRNA復合物結合并切割靶序列后,會激活Cas12a非特異性的ssDNA反式切割活性,根據(jù)Cas12a的這個特性,引入重組酶聚合酶等溫擴增技術(RPA)和可進行熒光猝滅的ssDNA探針,開發(fā)了DETECTR核酸檢測平臺,該平臺省去了DNA轉錄到RNA的過程,可以檢測≤6個堿基[6]。

1.5 CRISPR-Cas13a

CRISPR-Cas Ⅵ型(Cas13)家族的大小為900～1 300個氨基酸,由于存在2個高等真核生物和原核生物核苷酸(HEPN)結合域,Cas13-RNA切割不需要PAM[25]。Cas13檢測順式構象中的ssRNA,并在體外顯示出對ssRNA的側向反式切割活性[25-26]。在基于Cas13的分析平臺SHERLOCK中,分別用RPA或逆轉錄RPA(RT-RPA)等溫擴增DNA或RNA。在RNA的擴增過程中要添加帶有T7啟動子的正向引物，該啟動子允許靶標DNA轉錄RNA。當LwaCas13a蛋白與sgRNA、靶序列形成效應復合物時,通過順式切割靶標RNA,并通過側向反式切割以靶標依賴的方式切割ssRNA報告分子。一旦由熒光團和猝滅劑組成ssRNA報告分子被切割,熒光團從猝滅劑中分離出來,從而釋放出信號，達到檢測效果[5]。迭代升級后的SHERLOCKv2可以進行多路檢測,并且信號靈敏度提高了3.5倍。在此基礎上,引入免疫層析分析,使得檢測真正做到“儀器自由”[27]。

1.6 CRISPR-Cas14a

Cas14是報道的最小的Cas蛋白,能夠靶向和切割任何具有隨機序列的ssDNA,且無需PAM序列。Cas14a與其他Cas蛋白相比具有諸多優(yōu)勢[28]:1) 質(zhì)量緊湊,大小僅為Cas9的一半。2)Cas14a無需PAM序列即可進行切割,Cas12a的PAM序列是富含T的PAM,而Cas9更喜歡富含G的PAM 進行基因組切割,這一發(fā)現(xiàn)拓寬了其在檢測分析方面的應用。3)對ssDNA序列的識別和辨別能力更高,Cas14a的所有這些優(yōu)勢提高了從病原體檢測ssDNA的可能性,有助于建立高保真分子檢測平臺。4)此外,Cas14在檢測單核苷酸多態(tài)性方面表現(xiàn)出更好的特異性和活性。

2 CRISPR檢測系統(tǒng)的元器件挖掘

合成生物學工具箱需要不同的元器件及其文庫,如，核糖開關、轉錄因子、適配體來建立人工生物系統(tǒng),構建智能的基因電路。

2.1 核糖開關

在細菌中,核糖開關作為非編碼元件,通常存在于信使RNA(mRNA)的前導區(qū),通過控制轉錄終止位點的形成或影響翻譯起始的效率來調(diào)節(jié)基因表達[29]。核糖開關的適配子結構域與其同源配體(如，RNA聚合酶)特異性結合,形成特定的二級RNA結構,停止并釋放RNA聚合酶,從而中止RNA合成[30]。基于此,將核糖開關作為生物傳感系統(tǒng)進行快速和現(xiàn)場診斷,串聯(lián)CRISPR檢測系統(tǒng),對于構建新型食品檢測裝備具有啟示作用(圖3(a))。到目前為止,基于遺傳和基于計算的方法已經(jīng)被用來表征大約40種可以響應不同的代謝物或離子的天然核糖開關,用來調(diào)節(jié)代謝途徑[31](表2)。Weinberg等[32]通過開發(fā)一種計算算法來分析已知的核糖開關,以發(fā)現(xiàn)改變其配體特異性的其他變體。因此，可以發(fā)現(xiàn)某類已知核糖開關的其他成員以及可能的變體，來豐富信號分子庫。Thavarajah等[33]在2020年發(fā)表的一篇論文描述了一種調(diào)節(jié)蠟樣芽孢桿菌CrcB(氟外排泵表達)的氟化物響應型核糖開關,該傳感器由1個包含DNA模板的無細胞系統(tǒng)組成,該模板編碼一種氟化物響應的核糖開關,調(diào)節(jié)產(chǎn)生熒光或比色輸出的基因,并在實驗室和現(xiàn)場條件下檢測到超過2×10-6的氟化物水平。Weiss等[34]以yfp為報告基因,開發(fā)了感應環(huán)二腺苷酸(c-di-GMP)的核糖開關,該系統(tǒng)將YFP(yellow fluorescent protein)融合到核糖開關上,可以對活細胞進行快速成像,允許對枯草芽孢桿菌細胞亞群之間的c-di-GMP水平進行相對分析。

2.2 轉錄因子

轉錄因子參與轉錄過程的復雜機制,從上游途徑收集信息,例如,感知和響應各種小分子和其他刺激,然后與特定的DNA序列結合以觸發(fā)轉錄促進或者轉錄抑制[35]。細菌已經(jīng)進化出幾個變構轉錄因子(allosteric transcription factor,aTF)家族,它們通常包括一個DNA結合結構域和效應結合結構域。當小分子效應配體與aTF結合后,導致其構象的改變,以此來增強或者減弱DNA位點結合的親和力[35-36]。因此,大量研究報道重新設計aTF來改變它們的配體特異性,并作為合成生物學工具用來實時檢測、選擇和調(diào)節(jié)細胞代謝[37-38]。然而,受aTF響應大量效應物導致構象改變的啟發(fā),也有研究表明aTF可以被開發(fā)用于體外檢測各種小分子的生物傳感器,尤其是那些無法被傳統(tǒng)識別元件(如,酶、抗體和適配體)。Voyvodic等[39]利用轉錄因子BenR及其效應物創(chuàng)建了一個通用的、模塊化的無細胞生物傳感器檢測器,該檢測器可以檢測商業(yè)飲料中的苯甲酸以及人尿中的馬尿酸和可卡因。華東理工大學張立新課題組Cao等[40]開發(fā)了一種基于aTF 的帶切口DNA模板輔助信號轉導的體外生物傳感平臺(aTF-based nicked DNA template-assisted signal transduction system,aTF-NAST),通過利用T4 DNA連接酶和aTF之間的競爭性結合帶切口的DNA,該系統(tǒng)可以穩(wěn)定并靈敏地檢測4-羥基苯甲酸。這種設計可能為將aTF和CRISPR系統(tǒng)的組合應用于食品檢測提供了一種新方法(圖3(b))。

表2 核糖開關多樣性Table 2 Riboswitch diversities

2.3 適配體

適配體是指通過指數(shù)富集系統(tǒng)進化配體的新技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),從隨機生成的DNA或RNA文庫中多次循環(huán)篩選出的一定序列的寡核苷酸,通常含有20～80個核苷酸,與其靶標具有高親和力,也被稱為“化學抗體”[41-42]。但是與抗體相比,適配體具有易操作、高穩(wěn)定性、高重復性、通用性等諸多優(yōu)勢。更重要的是,適配體在其結構設計中提供了顯著的靈活性和便利性,加上它可以與細胞、病毒、毒素等靶標結合,可以用來開發(fā)具有高靈敏度和選擇性的新型生物傳感器,在食品檢測領域發(fā)揮作用[43-44]。而將其與啟動子和引物設計在一起,在未識別靶標(細菌)的時候,“適配體-啟動子-引物”復合物形成一個“包裹”狀態(tài),而當識別到靶標時,該復合物“舒展”開來,露出啟動子-引物模塊,擴增Cas蛋白識別的靶序列,觸發(fā)Cas蛋白的反式切割活性,激發(fā)熒光[45](圖3(c))。近年來,許多研究報道了適配體在食品檢測中的應用。Kim等[46]利用非SELEX技術分離出了大腸桿菌O157:H7的適配體,該方法省去了SELEX所必需的反復的結合孵化、分離和擴增。Nosrati等[47]將機器學習和PseKNC(pseudo k-tuple nucleotide composition)相結合,對大腸桿菌O157:H7的ssDNA適配子進行電子篩選,結果表明,篩選出的核酸適配體具有合適的結構性質(zhì),且核酸適配體折疊沒有熱力學限制。此外,Sun等[48]針對副溶血性弧菌的原適配體序列進行截短和定點突變,獲得檢測性能更優(yōu)的適配體?？傊?適配體作為一種新型仿生識別元件,受到廣泛關注。將其與CRISPR檢測系統(tǒng)進行整合,并開發(fā)為食品檢測設備,可以實現(xiàn)信號轉換,具備快速、高效、廉價、易攜帶等優(yōu)勢。

圖3 不同元器件偶聯(lián)CRISPR/Cas技術的檢測原理Fig.3 Schematic mechanism of CRISPR/Cas technology combined with different components

2.4 內(nèi)源性CRISPR

CRISPR-Cas系統(tǒng)由于其可編程性和通用性已成為一種精確基因組編輯工具,通過crRNA引導Cas蛋白識別靶標核酸序列,裂解侵入核酸。雖然有諸多研究報道了CRISPR-Cas系統(tǒng)在工程細菌基因組編輯方面的應用,但Cas蛋白作為一種異源蛋白由于其固有的毒性,容易導致宿主死亡,使得基因組編輯仍然具有挑戰(zhàn)性。然而,最近的一些突破性研究成果展示了如何在細菌中利用內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng),例如，Hidalgo-cantabrana等[49]利用卷曲乳桿菌的內(nèi)源性I-E系統(tǒng)進行包括插入、缺失和單核苷酸替換等一系列遺傳操作,并將其開發(fā)為基因編輯平臺。類似的,Xu等[50]基于Ⅰ型CRISPR-Cas,開發(fā)了一個可轉移和整合的基因編輯技術,該系統(tǒng)可以從宿主基因組中輕松去除靶基因,從而在宿主細胞中進行無疤痕、高效(>80%)和簡便的基因組編輯。Sui等[51]利用內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng),開發(fā)了一種適用于運動發(fā)酵單胞菌進行快速基因組編輯和必需基因鑒定的工具。該工具只需要構建一個帶有mini-CRISPR的自靶向質(zhì)粒,即可實現(xiàn)靶基因和長片段的敲除,上述案例說明了內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng)如何易于實現(xiàn)和可編程地利用宿主進行基因組編輯。由于大部分原核生物都有內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng),將其利用起來為食源性致病菌進行基因編輯提供了另一條靈活方便的途徑。值得注意的是,Jia等[52]設計了針對大腸桿菌O157∶H7志賀毒素的引導RNA,并利用雙質(zhì)粒平臺將對志賀毒素編碼基因具有特異性的CRISPR-Cas9系統(tǒng)導入細菌細胞,以特異性殺滅產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌。總之,這些研究說明了基于CRISPR的基因組編輯如何廣泛應用于食源性致病菌的工程設計的一種可行性思路。

3 CRISPR介導功能性核酸/蛋白在食品檢測中的應用

利用合成生物學工具耦合CRISPR檢測技術,開發(fā)新型食品檢測平臺,可以廣泛應用于食源性致病菌、食品摻假、離子、食品防腐劑、農(nóng)獸藥/抗生素殘留等方面的檢測。

3.1 食源性致病菌

食源性致病菌(表3),如,沙門氏菌、結核分枝桿菌、蠟狀芽孢桿菌等會污染食物,引起食源性疾病,導致通過攝食引起嘔吐、腹瀉以及腹痛等癥狀。因此,對于食源性致病菌的防治顯得尤為重要。Shen等[45]提出了一種基于核酸的變構探針和CRISPR-Cas13a組分的組合檢測系統(tǒng)(APC-Cas),該方法有能選擇性地、靈敏地定量檢測牛奶等各類試樣中的腸炎沙門氏菌細胞(1～105CFU)。Zhang等[19]使用一對dCas9蛋白各連接一半熒光素酶,當一對dCas9定位到由一對sgRNA確定的大約44 bp的靶序列時，便會誘導發(fā)光,開發(fā)了一種體外DNA檢測系統(tǒng)。用該體系檢測結核分枝桿菌DNA具有較高的特異性和敏感性。Zhang等[53]構建了一種發(fā)光RNA適配子-CRISPR-Cas13a組合,能夠監(jiān)測病原體RNA的存在,該方法允許對RNA靶標和活的病原菌進行無反轉錄、無核酸擴增和無標記的定量,同時檢測出低至10 CFU的蠟狀芽孢桿菌。最近,Song等[54]開發(fā)了一種通用的核酸磁-DNA納米顆粒系統(tǒng)，可以用于病原細菌的檢測。在該系統(tǒng)中,目標核酸被擴增,并通過鏈霉親和素包被的磁珠從混合物中分離,激活CRISPR-Cas14a的反式切割活性。

表3 基于CRISPR/Cas技術的食品檢測應用Table 3 Applications of food detection based on CRISPR/Cas technology

3.2 食品摻假

隨著食品產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展、產(chǎn)業(yè)鏈不斷延長和復雜化,食品摻假等問題嚴重損害消費者權益,危害消費者健康,已經(jīng)成為一個不可忽視的問題。Wu等[55]針對清真食品摻假的風險問題,以豬肉細胞色素b基因為靶標,設計并優(yōu)化了gRNA,允許從豬肉成分中特異性鑒定目標細胞色素b基因,然后激活Cas12蛋白的反式切割活性來檢測食品摻假問題。Liu等[56]建立一種結合重組酶聚合酶擴增和CRISPR-Cas12a的食品安全檢測技術(RPA-Cas12a-FS),可用于食源性致病菌、轉基因作物和肉類摻假的分子鑒定。該系統(tǒng)可以在37 ℃下、在45 min內(nèi)特異性地檢測到低至10個拷貝的目的基因水平。Qiao等[57]基于CRISPR/Cas12a生物傳感技術,開發(fā)了一種將適配體與之相結合的三聚氰胺靈敏快速檢測方法。該方法在20 min內(nèi)可檢測出全脂牛奶試樣中的三聚氰胺,檢測限低至38 nm,同時對三聚氰胺等4種類似物顯示出較高的選擇性。

3.3 離子

隨著食品工業(yè)技術的發(fā)展,導致一些金屬離子進入食品當中,形成高毒性化合物,長期食用這類產(chǎn)品會導致慢性中毒現(xiàn)象。因此,食品當中的一些過量離子的檢測也變得日趨重要。Xiong等[58]報道了一種受功能性DNA分子調(diào)控的基于CRISPR-Cas12a的檢測系統(tǒng),對有機小分子和金屬離子的檢測具有選擇性。使用該方法,可以在環(huán)境溫度(25 ℃)下簡單快速(兩步和15 min)地定量檢測ATP和Na+?？梢詫⑦@種CRISPR-Cas傳感器系統(tǒng)顯著地擴展到許多其他目標,從而提供了一個新的工具箱來顯著地將CRISPR-Cas系統(tǒng)擴展到食品檢測應用領域。Li等[59]利用LbaCas12a作為信號放大器,在功能核苷酸(脫氧核酶和適配體)的輔助下,開發(fā)了一個通用的CRISPR-Cas12a平臺來檢測范圍廣泛的超低濃度分析物,該平臺能夠?qū)崿F(xiàn)對Pb2+的超靈敏生物檢測,檢測下限約為0.053 nmol/L。Ma等[60]通過串聯(lián)傳感器利用氟化物核糖開關來調(diào)節(jié)體外轉錄，并生成可被CRISPR-Cas13a識別的全長轉錄RNA,觸發(fā)熒光團-淬滅劑標記的RNA探針的側鏈裂解，并產(chǎn)生熒光信號輸出。該系統(tǒng)可以在室溫下定量檢測水溶液中的氟化物,靈敏度高(檢測下限≈1.7 μmol/L)、動態(tài)范圍寬(0～800 μmol/L)、檢出時間短(30 min),對其他常見陰離子有較高的選擇性。

3.4 食品防腐劑、農(nóng)獸藥/抗生素殘留

食品防腐劑是一類能抑制微生物繁殖、防治食品腐敗變質(zhì)的食品添加劑,農(nóng)獸藥/抗生素則在預防動物疾病及植物病蟲害方面應用廣泛。近年來,隨著食品防腐劑、農(nóng)獸藥/抗生素的廣泛使用,使得上述物質(zhì)在食品中殘留超標,嚴重危害人類身體健康[61]。因此,建立一套快速、靈敏的檢測方法是保障食品安全的重要環(huán)節(jié)。Liang等[62]將aTF和CRISPR-Cas12a串聯(lián),開發(fā)了簡單、超靈敏、快速和高通量小分子檢測平臺CaT-SMelor(CRISPR-Cas12a-and aTF-mediated small molecule detector),該平臺可以檢測不同類型的小分子,例如，涉及代謝性疾病診斷、抗生素殘留和食品防腐劑的小分子。Iwasaki等[63]基于Cas13a開發(fā)了SPRINT(SHERLOCK-based profiling of in vitrotranscription)方法以在單批分析中檢測小分子。該方法利用核糖開關或蛋白質(zhì)通過特定的效應器分子來體外調(diào)節(jié)轉錄,將效應器濃度轉換為熒光強度的耦合分析。作者定量了試樣中的8種不同的化合物,包括輔因子、核苷酸、氨基酸代謝物、四環(huán)素和單原子離子,并且在幾個小時得到結果。Hu等[64]開發(fā)了一種基于元素探針的CRISPR/Cas14檢測平臺,在室溫(25 ℃)下,可在45 min內(nèi)實現(xiàn)微量氨芐青霉素水溶液的定量檢測,檢測下限為2.06 nmol/L。

4 總結和展望

CRISPR系統(tǒng)不僅因為其強大的基因編輯能力而受到研究者的關注,最近它還被設計被生物傳感器,感知食品當中的有毒有害物質(zhì):dCas9由于缺失核酸酶活性,但是保留了識別靶標的能力而被開發(fā)為檢測器[19],Cas12a、Cas13a、Cas14a在識別靶標后,觸發(fā)了其反式切割活性,切割帶熒光基團的ssDNA/ssRNA,通過熒光信號就能使得檢測出靶標的存在[5,25-26,28]。因此,基于CRISPR的檢測技術具有靶標靈活性、簡單性以及可編程性。然而,基于CRISPR的檢測方法目前研究領域主要集中于核酸檢測,對于非核酸分子的檢測應用有限,而且,非核酸分子總是以復雜的基質(zhì)存在食品中。功能性核酸/蛋白,例如，核糖開關[33-34]、轉錄因子[39-40]、適配體[47-48]等已經(jīng)成為研究熱點,并逐漸在現(xiàn)場、實時檢測和診斷當中作為首要選擇。盡管取得了進展,但是這些核酸/蛋白傳感器缺乏通用的信號放大方法是限制靈敏生物測定的瓶頸,這也對準確定量提出了挑戰(zhàn)。二者優(yōu)勢互補,CRISPR系統(tǒng)的信號放大能力和可編程性以及功能性核酸/蛋白在非核酸物質(zhì)檢測方面的突出表現(xiàn)為構建新型信號傳感器提供了一個有用的工具箱。

由于元器件和配體之間的親和力的不同,元器件和CRISPR串聯(lián)后，對目標檢測物的靈敏度也不盡相同,這就需要篩選突變文庫獲得親和力更好的元器件,例如，利用噬菌體輔助進化[65]、點突變[66]和飽和突變[66]等技術對現(xiàn)有變構轉錄因子連續(xù)進化。此外,已有的元器件還遠遠不能滿足食品中各類有害物質(zhì)的檢測,需要使用新興方法，進一步大規(guī)模篩選與不同有毒有害物質(zhì)結合的元器件,并建立詳細的數(shù)據(jù)庫,例如，利用機器學習方法[67]篩選更多新的蛋白和核糖開關。最后,可以通過多學科交叉融合的方式,迭代升級生物傳感器的性能,實現(xiàn)檢測信號的放大和儀器設備的便攜性。未來食品檢測,不僅僅局限于檢測,應該構建“檢測-清除”體系,對于一些食源性致病菌,可以嘗試構建內(nèi)源性CRISPR進行殺滅,徹底保障食品安全。