黎 杰，陶惟一，李 霜

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院 江蘇 南京 211800)

微生物細(xì)胞工廠在生產(chǎn)過程中存在著一些不利環(huán)境因素，如，原料預(yù)處理帶來的有毒抑制物、高鹽、高溫、高濃度的底物或產(chǎn)物帶來的高滲透壓以及溶劑等，從而影響細(xì)胞工廠的生產(chǎn)效能[1]。近年來，利用微生物抗逆元件構(gòu)建高效細(xì)胞工廠成為研究熱點(diǎn)。微生物抗逆元件主要包括調(diào)控細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激、相容性溶質(zhì)、能量產(chǎn)生和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因以及外排泵、熱激蛋白和全局轉(zhuǎn)錄因子等[2-3]。其中全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程(global transcription machinery engineering,gTME)成為改變復(fù)雜細(xì)胞表型的一種重要策略[4]，該策略通過全局調(diào)控因子及其突變體調(diào)節(jié)宿主菌中數(shù)千個基因的表達(dá)，使得宿主菌激發(fā)出耐溶劑、耐酸、耐鹽、耐熱等優(yōu)勢表型[5-7]。這種針對多基因表達(dá)調(diào)控的代謝改造策略在一定程度上解決了載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化效率和篩選能力等方面的限制，成為提升細(xì)胞抗逆性能的重要策略之一。

IrrE也被稱為PprI，是廣泛存在于耐輻射極端微生物Deinococcus菌屬中的特異性全局調(diào)控蛋白，通過參與調(diào)控DNA修復(fù)蛋白基因recA的表達(dá)，提升細(xì)胞耐受高劑量UV輻射、電離輻射及干旱等不良環(huán)境[8-9]。鑒于RecA蛋白及類RecA蛋白廣泛存在于包括古細(xì)菌、真細(xì)菌、酵母、植物及動物等全部物種中，異源表達(dá)irrE是否能提升宿主對輻射的耐受性成為率先研究的對象。2003年，Gao等[10]在大腸桿菌中首次表達(dá)了來自耐輻射球菌的pprI基因(irrE)，結(jié)果表明，組成型表達(dá)irrE基因使得宿主對高劑量γ線的耐受性提高了1.6倍，其作用機(jī)制為IrrE蛋白顯著提高了宿主細(xì)胞中用于DNA修復(fù)的RecA蛋白表達(dá)量，并誘導(dǎo)提升過氧化氫酶(KatG)酶活，具有更好的清除胞內(nèi)游離基的能力。2009年，Pan等[11]將irrE基因分別在大腸桿菌和油菜中進(jìn)行了表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IrrE蛋白可以賦予宿主對抗高鹽、氧化壓力、高滲透壓以及高溫等不良環(huán)境的能力。

此后，隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)IrrE蛋白對不同種屬微生物的抗逆性能及作用機(jī)制的研究開始大量出現(xiàn)，IrrE開始成為合成生物學(xué)工具箱中一種重要的抗逆元件。筆者針對Deinococcus菌屬的全局調(diào)控蛋白IrrE在異源宿主細(xì)胞的全局調(diào)控作用機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，并通過其在微生物細(xì)胞工廠中的應(yīng)用案例展示IrrE作為抗逆元件的最新應(yīng)用進(jìn)展。

1 IrrE的結(jié)構(gòu)和功能

1956年，耐輻射極端微生物首次在高劑量γ線輻射后的肉罐頭中被發(fā)現(xiàn)[12]，并命名為耐輻射微球菌Micrococcusradiodurans，該菌株為革蘭氏陽性球菌，菌落及液體培養(yǎng)物均為紅色[13]。1981年，該菌株經(jīng)系統(tǒng)鑒定后，被更名為耐輻射奇球菌Deinococcusradiodurans[14]。1999年，D.radioduransR1菌株的基因組完成了測序[15]。為更清楚地認(rèn)識D.radioduransR1的電離輻射抗性，2002—2003年，先后有2個研究團(tuán)隊(duì)利用發(fā)生突變的電離輻射敏感菌株進(jìn)行抗性基因解析，其結(jié)果均指向DR0167編碼序列，隨后命名為irrE基因或pprI基因，證明該基因編碼蛋白可調(diào)控DNA修復(fù)功能蛋白基因recA的表達(dá)，對提高耐輻射抗性具有重要作用[16-17]。李新娜等[18]和張陳等[19]先后對耐輻射球菌DNA損傷修復(fù)重要功能蛋白進(jìn)行了總結(jié)，陳震等[13]總結(jié)了耐輻射球菌全局調(diào)控蛋白IrrE的研究進(jìn)展，對于國內(nèi)同行開展相關(guān)研究提供了較為詳盡的基礎(chǔ)知識。

隨著越來越多的該屬其他菌株被分離鑒定和基因組測序，研究者發(fā)現(xiàn)，irrE基因廣泛存在于該屬菌株中，IrrE成為Deinococcus菌屬的種屬特異性調(diào)控蛋白。在已完成測序的Deinococcus菌株中共發(fā)現(xiàn)了7種不同來源的IrrE蛋白，這些IrrE蛋白的氨基酸序列同源性較高且具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，預(yù)示其功能上具有相似性。目前，已報道用于研究的3種IrrE蛋白分別來源于D.radioduransR1、D.deserti和D.gobiensisI-0這3個菌株；采用序列比對軟件分析表明，IrrE-D.radioduransR1與IrrE-D.gobiensisI-0、IrrE-D.deserti的同源性分別為65.22%和65.07%，IrrE-D.gobiensisI-0與IrrE-D.deserti同源性為73.02%(圖1)。

圖1 不同來源IrrE蛋白的序列同源性分析Fig.1 Sequence homology analysis of IrrE protein from different sources

圖2 D. deserti全局調(diào)控蛋白IrrE的二級結(jié)構(gòu) (源于PDB數(shù)據(jù)庫)Fig.2 Structure of global regulator IrrE from D. deserti(Originated from PDB database)

關(guān)于IrrE蛋白的功能結(jié)構(gòu)域及作用機(jī)制的研究當(dāng)前尚未有明確結(jié)論。針對D.deserti來源的IrrE蛋白結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)N端(鋅肽酶結(jié)構(gòu)域)和C端(GAF結(jié)構(gòu)域)是關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域[20]。最近對于IrrE蛋白N端功能的研究取得了一定的進(jìn)展。Blanchard等[26]解析了Deinococcus菌屬中IrrE/DdrO控制的耐輻射性狀的保守性和多樣性，同時還表明，DdrO蛋白具有多個DNA特異性結(jié)合位點(diǎn)。DNA損傷修復(fù)可以通過IrrE和DdrO共同調(diào)節(jié)[22,27-28]。在輻射應(yīng)激作用下，胞內(nèi)游離鋅含量增加，刺激IrrE作為金屬蛋白酶對阻遏蛋白DdrO的切割[29]，解除對DNA損傷修復(fù)相關(guān)功能基因的抑制作用，導(dǎo)致與DNA和RNA代謝相關(guān)的多個基因(ddrC、ddrD、pprA、recA、ssb、ssb、uvrD、ddrF等)轉(zhuǎn)錄表達(dá)[30]。IrrE對DdrO特定結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)的切割，使得DdrO結(jié)構(gòu)發(fā)生了動態(tài)平衡轉(zhuǎn)換，脫離了DNA結(jié)合位點(diǎn)，解除相關(guān)基因的阻遏作用[31]。而針對D.radiodurans來源的IrrE研究表明，THT結(jié)構(gòu)域的突變也能導(dǎo)致對輻射等不良環(huán)境敏感，推測THT結(jié)構(gòu)域?qū)NA修復(fù)也有重要影響。2015年，Zhang等[32]將2個不同種(D.radiodurans和D.gobiensis)來源的irrE進(jìn)行了突變和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，有助于明確THT結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵功能位點(diǎn)。D.gobiensisⅠ-0菌株比D.radiodurans菌株具有更好的耐輻射性能，有趣的是，當(dāng)針對D.radiodurans的ΔirrE菌株進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)時，來源于D.gobiensis的IrrE相較于出發(fā)菌株顯示了更高的耐輻射活性，表明不同來源的IrrE具有活性上的差異。將來源于D.radiodurans的IrrE的THT結(jié)構(gòu)域進(jìn)行單點(diǎn)突變A184S，突變體表現(xiàn)出活性增加，而針對D.gobiensis的IrrE同位點(diǎn)的突變(S131A)卻導(dǎo)致了活性的降低，推測THT結(jié)構(gòu)域的絲氨酸殘基可能是重要作用位點(diǎn)。

因此,目前對于IrrE結(jié)構(gòu)的研究相對較為詳細(xì),但對于作用機(jī)制的研究還有所欠缺,主要的原因可能是IrrE結(jié)構(gòu)的特殊性賦予了其許多復(fù)雜的調(diào)控功能,導(dǎo)致研究受到阻力。而當(dāng)前研究部分表明,IrrE的3個結(jié)構(gòu)域都參與了調(diào)控作用,有基因與基因間的調(diào)控,基因與蛋白間的調(diào)控或蛋白與蛋白間的調(diào)控。而最近研究較多的是IrrE和DdrO的調(diào)節(jié),可以影響眾多基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),提高菌體耐輻射性能。但許多IrrE作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究,需要最大程度地挖掘IrrE的潛在價值。

2 IrrE對大腸桿菌的全局調(diào)控作用機(jī)制

作為Deinococcus菌屬的種屬特異性全局調(diào)控蛋白IrrE，是否能在其他非親緣種屬菌株中展現(xiàn)全局調(diào)控能力并提升細(xì)胞對環(huán)境壓力的耐受性，是科研工作者最為關(guān)注的內(nèi)容。來源于D.radioduransR1的IrrE是目前最為廣泛使用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，而大腸桿菌作為模式菌株，在研究全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白IrrE的作用機(jī)制中最為詳盡，多篇研究論文都證實(shí)了IrrE蛋白在大腸桿菌中具有全局調(diào)控能力，如圖3所示。

GadE—可結(jié)合HTH結(jié)構(gòu)域的調(diào)控因子；GadX—參與DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；PurR—嘌呤核苷酸合成阻遏物；AppY—含有ARAC型DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子；GadW—ARAC型調(diào)節(jié)因子；YhiF—可結(jié)合HTH結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子；RpoS—σs；BetI、CynR、MhpR、KdgR—轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；PrpR—含有AAA型ATP酶結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；TdcA—tdc操縱子的轉(zhuǎn)錄激活因子,TdcR—DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子；appBC—細(xì)胞色素bd型喹啉氧化酶基因；hyaABCDEF—?dú)浠富虼?；有機(jī)溶劑耐受性相關(guān)基因(iraD、iraM)—RpoS蛋白水解抑制基因；otsAB—海藻糖合成基因；treBC—海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)及降解基因；gldA、glpA、glpK—甘油降解基因；氮代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因narK—亞硝酸鹽外排蛋白基因；narGHIJ—硝酸還原酶有關(guān)基因；nirBD—亞硝酸還原酶 (NADH)基因；nirC—亞硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；tdcB—蘇氨酸脫水酶基因；tdcC—氨基酸滲透基因；tdcD—乙酸激酶基因；tdcE—丙酮酸-甲酸裂解酶基因；tdcF—翻譯起始抑制基因；tdcG—L-絲氨酸脫氨酶基因；prpB—PEP磷酸變位酶基因；prpC—檸檬酸合酶基因；prpD—參與丙酸分解代謝的未表征蛋白質(zhì)基因；prpE—?；o酶A合成酶/AMP-(脂肪)酸連接酶基因；betA—膽堿脫氫酶和相關(guān)黃素蛋白基因；betB—NAD依賴性醛脫氫酶基因；betT—膽堿-甘氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；dctA—C4-二羧酸、乳清酸和檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因;bfr—細(xì)菌鐵蛋白(細(xì)胞色素b1)基因；feoAB—亞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；fiu—兒茶酸鐵載體受體/預(yù)測的鐵外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；cirA—兒茶酸鐵外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；fhuE—鐵紅酵母酸外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；fecABER—檸檬酸鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因；fecl—RNA聚合酶σ19因子基因；fes—腸桿菌素/鐵腸桿菌素酯酶基因；fhuF—參與異羥肟酸鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的三價鐵還原酶基因；fepBC—鐵腸桿菌素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因；fhuA—鉻鐵外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因;kdgK—糖激酶基因；kdgT—2-酮-3-脫氧葡萄糖酸滲透基因；kdulD—葡萄糖代謝相關(guān)基因；yjgK—β-半乳糖苷酶β亞基基因；mhpA—3-羥苯基丙酸羥化酶基因；mhpD—2-酮-4-戊烯酸水合酶基因；mhpE—4-羥基-2-氧代戊酸醛縮酶基因；mhpT—3-羥苯基丙酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；cynS—氰酸裂解酶基因；cynT—碳酸酐酶基因；purB、purC、purEK、purF、purHD、purL、purMN—核苷酸合成過程有關(guān)基因；pyrD—二氫乳清酸脫氫酶基因；glyA—絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因；gadYXW—酸適應(yīng)性調(diào)控基因；hdeAB—周質(zhì)酸應(yīng)激伴侶蛋白基因；hdeD—抗酸膜蛋白基因；yhiD—假定的參與耐酸的一種膜蛋白基因；slp—一種外膜脂蛋白基因圖3 IrrE對大腸桿菌的全局調(diào)控作用機(jī)制[35-36,38]Fig.3 The global regulatory mechanism of IrrE on Escherichia coli[35-36,38]

潘婕[33]和周正富[34]率先開展了基于轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的分析，研究了IrrE對大腸桿菌的影響。Zhou等[35]研究了IrrE蛋白對E.coliJM109在非壓力環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組影響；結(jié)果表明，IrrE蛋白對大腸桿菌的1個EvgSA(具有傳感和調(diào)節(jié)作用的兩種蛋白)雙組分系統(tǒng)、3個主調(diào)控因子GadE、GadX和PurR以及10個轉(zhuǎn)錄因子(AppY、GadW、YhiF、AsnC、BetI、CynR、MhpR、PrpR、TdcA和KdgR)起到了調(diào)控作用，可以導(dǎo)致數(shù)百個基因表達(dá)差異，包括海藻糖合成、核苷酸合成、碳源代謝、氨基酸代謝等代謝途徑以及細(xì)胞運(yùn)輸系統(tǒng)。為了進(jìn)一步探索IrrE對大腸桿菌耐鹽脅迫的全局調(diào)控作用機(jī)制，Zhao等[36]考察了IrrE蛋白對于宿主(E.coliJM109)在受到鹽脅迫(1 mol/L NaCl)條件的基因表達(dá)差異，得到了相對直觀和明確的結(jié)果。IrrE蛋白可以使宿主的100～300個左右的基因差異表達(dá)，影響宿主胞內(nèi)海藻糖、甘油、核酸、碳源、氨基酸、抗酸性，以及一些依賴于轉(zhuǎn)錄因子RpoS(σS)的相關(guān)基因，如，海藻糖合成基因otsAB、抗酸基因gadABC和uspB、高滲透壓和氧化響應(yīng)基因katE和osmBC等，導(dǎo)致胞內(nèi)相容性物質(zhì)如海藻糖和甘油濃度的顯著上升。而進(jìn)一步分析表明，IrrE并沒有影響rpoS的轉(zhuǎn)錄，只是過表達(dá)一些基因阻止了RpoS蛋白的降解，使得轉(zhuǎn)錄因子RpoS蛋白得到了積累，從而影響了眾多基因的表達(dá)。這些研究結(jié)果表明，IrrE蛋白可以在大腸桿菌中發(fā)揮全局調(diào)控功能。

清華大學(xué)林章凜團(tuán)隊(duì)針對IrrE蛋白開展了突變和定向進(jìn)化研究，進(jìn)一步拓展了IrrE的適用性。Chen等[37]首次構(gòu)建了IrrE的突變體文庫，以E.coliDH5α為宿主，篩選突變體對乙醇、丁醇和乙酸的選擇耐受性，發(fā)現(xiàn)部分IrrE突變體可以讓宿主的生物量增加2～50倍，同時大幅降低宿主的胞內(nèi)活性氧(ROS)。針對突變位點(diǎn)的分析表明，這些突變位點(diǎn)分布于IrrE的所有結(jié)構(gòu)域，并沒有顯著的結(jié)構(gòu)特征。此后，Chen等[38]進(jìn)一步分析了野生型IrrE和突變體對宿主的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的影響；結(jié)果表明IrrE突變體對宿主的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的影響更顯著，總計有1 196個基因在轉(zhuǎn)錄水平上有顯著改變，上調(diào)和下調(diào)的蛋白斑點(diǎn)數(shù)均達(dá)到100多個，特別是硝酸鹽、色氨酸、Fe離子和甘油以及與氧化磷酸化和非編碼RNA相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上調(diào)或下調(diào)。Wang等[39]將IrrE突變體用于提升大腸桿菌對木質(zhì)纖維素水解液抑制物的耐受性，在體積分?jǐn)?shù)為0.2%糠醛的條件下,IrrE突變體的重組菌生物量是其對照組的4～16倍，且對5-羥甲基糠醛、香蘭醛以及纖維素水解液均具有顯著的耐受性。此后，駱健美等[40]將irrE基因及其突變體在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)，也獲得類似的結(jié)果，IrrE及其突變體能夠不同程度提高宿主菌在各種脅迫條件下(3 mol/L山梨醇、pH 2和pH 12、體積分?jǐn)?shù)為10%甲醇、體積分?jǐn)?shù)為12%乙醇和體積分?jǐn)?shù)為1% H2O2)的存活能力。

這些研究結(jié)果均表明,IrrE在大腸桿菌中具有很好的全局調(diào)控能力,引起眾多基因的差異表達(dá),激發(fā)宿主耐受各種極端環(huán)境。這些引起宿主的差異變化主要表現(xiàn)在抗氧化還原,提高有機(jī)溶劑耐受性、抗?jié)B透壓、耐酸、氮代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)、碳代謝、氨基酸代謝、Fe離子轉(zhuǎn)運(yùn)、核苷酸合成等。而且,通過突變或定向進(jìn)化篩選,可以獲得應(yīng)對不同極端環(huán)境的IrrE。因此,IrrE比其他全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有更廣泛的應(yīng)用價值,可應(yīng)用于耐受多種極端環(huán)境。

3 IrrE作為抗逆元件在工業(yè)微生物中的應(yīng)用

在工業(yè)微生物的發(fā)酵體系以及發(fā)酵進(jìn)程中，高濃度底物/產(chǎn)物導(dǎo)致的高滲透壓、代謝產(chǎn)物或副產(chǎn)物積累導(dǎo)致的酸、堿、溶劑等容易導(dǎo)致微生物處于不利于生長或代謝產(chǎn)物積累的環(huán)境，進(jìn)而限制了產(chǎn)物濃度、轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)速率等指標(biāo)的提升。目前，廣泛地將耐輻射奇球菌的IrrE蛋白作為抗逆元件應(yīng)用到含有醇、酸、滲透壓、電場等環(huán)境，提高宿主菌在各種環(huán)境中的耐受性，其中涉及應(yīng)用的宿主菌有革蘭氏陽性菌(乳酸菌、節(jié)桿菌)、革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、運(yùn)動單胞菌、鞘氨醇單胞菌、假單胞菌等)以及釀酒酵母等，這是近年來將IrrE蛋白從原始菌株到各種宿主菌作為抗逆元件應(yīng)用的熱門研究方向。

3.1 irrE在燃料乙醇生產(chǎn)菌株中的應(yīng)用

利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇是生物能源的重要研究課題。木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理產(chǎn)生的糠醛類抑制物和高濃度的乙醇及副產(chǎn)物等會對生產(chǎn)菌產(chǎn)生損傷，從而影響乙醇的生產(chǎn)速率和轉(zhuǎn)化率[41]。全局調(diào)控因子IrrE及其突變體在各種乙醇生產(chǎn)菌株(大腸桿菌、運(yùn)動單胞菌、釀酒酵母)中均可激發(fā)宿主菌獲得耐受脅迫環(huán)境的新表型，如圖4所示。

E.coliMG1655是研究有機(jī)酸和乙醇代謝的模式菌株。Ma等[42]發(fā)現(xiàn)在MG1655中表達(dá)irrE基因后，宿主菌對高滲透壓(250 g/L的葡萄糖/木糖)和酸脅迫(pH 2)的耐受性顯著增強(qiáng)，且宿主菌的乙醇積累能力也顯著提升；以100 g/L葡萄糖或木糖為碳源時，宿主菌的乙醇積累量分別為39.63和34.53 g/L，相比對照菌株產(chǎn)量分別提高了14.7%和26.3%；在發(fā)酵過程中，宿主菌中與乙醇合成途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶PDC(丙酮酸脫羧酶)和ADHB(乙醇脫氫酶)的活性均持續(xù)性顯著高于對照組的活性。

圖4 IrrE作為抗逆元件在乙醇生產(chǎn)菌株中的應(yīng)用Fig.4 Application of IrrE as tolerance element in ethanol production strains

運(yùn)動單胞菌Zymomonasmobilis可通過其特有的ED(2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸裂解途徑)途徑高效積累乙醇，是具有工業(yè)應(yīng)用潛力的乙醇生產(chǎn)菌株。Zhang等[43]在Z.mobilis10232中表達(dá)了irrE基因，發(fā)現(xiàn)重組菌提高了對乙醇、酸、高滲透壓及高溫等不良環(huán)境的耐受性和存活率，尤其值得關(guān)注的是，在初始pH 3.8和體積分?jǐn)?shù)為12%的乙醇環(huán)境下，重組菌乙醇積累量分別為18.8和14.59 g/L，而對照組的乙醇積累量分別為14.2和8.75 g/L，且重組菌中轉(zhuǎn)錄因子RpoE(一種σ因子)的轉(zhuǎn)錄水平分別較對照組提升了8.2倍和6倍，提示該菌株中與耐受性相關(guān)基因可能受到轉(zhuǎn)錄因子RpoE的調(diào)控。

釀酒酵母是當(dāng)前燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的主要生產(chǎn)菌株。2018年，Luo等[44]在SaccharomycescerevisiaeAS2.489中表達(dá)irrE突變體獲得了對糠醛的耐受性，同時對5-羥甲基糠醛、甲酸、乙酸等木質(zhì)纖維素預(yù)處理體系抑制物都具有抗性的重組菌；在含2 g/L糠醛的合成培養(yǎng)基(200 g/L葡萄糖)中，重組菌的乙醇產(chǎn)量(88 g/L)沒有顯著差異，但生產(chǎn)速率提升了37%。2020年，Wang等[45]發(fā)現(xiàn)IrrE突變體可以將S.cerevisiaeBY4742在木質(zhì)纖維素水解液抑制物及高溫(42 ℃)等不良環(huán)境下的乙醇發(fā)酵速率提升3倍以上；并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母胞內(nèi)IrrE作為全局調(diào)控因子，可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活子及轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平，從而實(shí)現(xiàn)在基因組尺度上對轉(zhuǎn)錄進(jìn)行擾動。Helalat等[46]在野生型酵母S.cerevisiaeINS中異源表達(dá)pprI(irrE)獲得的重組菌也可以提高細(xì)胞對鹽(70 g/L)、乙醇(體積分?jǐn)?shù)為11%)、丁醇(體積分?jǐn)?shù)為1%)的耐受性。

這些研究結(jié)果表明,全局調(diào)控因子IrrE可以激發(fā)各種燃料乙醇生產(chǎn)菌株的抗逆能力,提高菌株的生產(chǎn)性能。目前做過相關(guān)嘗試的菌株主要有大腸桿菌、運(yùn)動單胞菌、釀酒酵母。IrrE在這些菌株中都表現(xiàn)出了較好的全局調(diào)控能力,激發(fā)了菌株耐受滲透壓、乙醇、高溫和纖維素水解抑制物等不利環(huán)境因素的能力,提高了菌體的存活率和乙醇的生產(chǎn)性能。因此,IrrE調(diào)控蛋白作為抗逆元件,可以有效地突破菌體自身極限,提高菌體生產(chǎn)性能。

3.2 irrE在其他微生物細(xì)胞工廠中的應(yīng)用

近年來，來源于D.radiodurans的全局調(diào)控蛋白IrrE在利用微生物發(fā)酵產(chǎn)有機(jī)酸、生物聚合物、甾體轉(zhuǎn)化以及燃料電池、生物修復(fù)等領(lǐng)域進(jìn)行了應(yīng)用嘗試[47，48-54]，如表1所示。從應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，野生型IrrE在革蘭氏陽性菌(乳球菌、節(jié)桿菌)和革蘭氏陰性菌(鞘氨醇單胞菌、假單胞菌、大腸桿菌)中都能提高宿主細(xì)胞對特定環(huán)境的耐受性，大幅提升生產(chǎn)效率和產(chǎn)量；且相應(yīng)的研究表明IrrE可擾動宿主中多基因表達(dá)差異，從而影響宿主表型，賦予宿主更加優(yōu)異的生產(chǎn)性能。

在有機(jī)酸發(fā)酵中，酸、滲透壓、鹽以及氧化壓力等對生產(chǎn)菌株的脅迫是一個比較常見的問題。Dong等[47]在乳酸菌中異源表達(dá)irrE，發(fā)現(xiàn)可以提高菌株耐滲透壓和抗氧化壓力，提高高鹽脅迫下的乳酸產(chǎn)量。朱興貴等[49]、Zhang等[50]發(fā)現(xiàn)IrrE可提升大腸桿菌耐鹽性能和發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸(提升1.24倍)的性能，使得利用海水代替淡水發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸成為可能。

表1 IrrE在微生物工廠中的應(yīng)用Table 1 Application of IrrE in microbial cell factoryies

在甾體生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，添加溶劑(乙醇)可以提高底物溶解度，有助于提升轉(zhuǎn)化效率。Song等[51]、Luo等[52]以簡單節(jié)桿菌A.simplexCPCC 140451轉(zhuǎn)化醋酸可的松生成醋酸潑尼松為模式體系，發(fā)現(xiàn)表達(dá)irrE后的重組菌可提升對乙醇的耐受性，在高濃度乙醇作為助溶劑時，其產(chǎn)物生成速率和最終產(chǎn)量都有顯著提高，通過對irrE表達(dá)水平的優(yōu)化，可以獲得耐脅迫能力最佳菌株，類固醇產(chǎn)量提高了261.8%。最為有趣的是，irrE基因也在A.globiformisATCC 8010和E.coli中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個重組菌對有機(jī)溶劑和氧化壓力都提升了耐受性；但是，只在E.coli中表現(xiàn)出提升了對酸/堿休克的耐受性，只在A.simplex中表現(xiàn)出對熱休克更好的耐受性。這些研究表明IrrE作為抗逆元件，其表達(dá)量會影響宿主的抗逆性能及生產(chǎn)性能，在不同宿主或應(yīng)對不同壓力環(huán)境時也會有差異性。

鞘氨醇單胞菌Sphingomonas是威蘭膠、結(jié)冷膠、定優(yōu)膠等生物聚合物的主要生產(chǎn)菌株。最近，Liu等[48]在威蘭膠生產(chǎn)菌株中表達(dá)了irrE，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)擾動了1 000多個基因(雙組分系統(tǒng)、細(xì)菌趨化性、鞭毛組裝、生物膜形成和細(xì)胞周期)表達(dá)，使得重組菌可以耐熱、耐pH等脅迫壓力，從而降低生產(chǎn)能耗和成本。

假單胞菌屬微生物代謝能力強(qiáng)，在降解有毒化合物方面具有廣泛應(yīng)用。Zhou等[54]發(fā)現(xiàn)表達(dá)irrE可提升惡臭假單胞菌S16的耐酸性能，使得其可以在低pH的條件下降解污染物(苯甲酸或尼古丁)。Luo等[53]將irrE引入銅綠假單胞菌PAO1菌株，發(fā)現(xiàn)IrrE對宿主的轉(zhuǎn)錄組可產(chǎn)生擾動，菌株的產(chǎn)電性能提高71%。

上述研究表明,全局調(diào)控蛋白IrrE及其突變體已經(jīng)應(yīng)用到了各領(lǐng)域中,可以普遍地和多種微生物中的基因建立聯(lián)系,引起轉(zhuǎn)錄擾動,激發(fā)宿主菌耐受(滲透壓、鹽、酸、熱、氧化壓力、有機(jī)溶劑等)不利環(huán)境因素的能力。其中,IrrE調(diào)控蛋白對宿主的碳氮源代謝、能量代謝、細(xì)胞膜形成、甘油、海藻糖等相關(guān)途徑的基因擾動最受關(guān)注,但也將視野拓展到了次級代謝途徑及QS調(diào)控因子,例如,吩嗪生物合成、細(xì)菌趨化性、鞭毛組裝等基因[47-48,53]。未來,隨著IrrE應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)寬,新的應(yīng)用宿主和表型會更加豐富。

4 結(jié)論與展望

由于極端微生物在長期的自然脅迫條件下進(jìn)化出了一套特殊、高效的脅迫響應(yīng)機(jī)制,因此其往往成為挖掘抗逆元件的資源庫。來源于耐輻射極端微生物Deinococcus菌屬的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白IrrE大約已有20多年的研究歷程,其應(yīng)用性范圍不再局限于提高菌體的耐輻射能力。從2009年發(fā)現(xiàn)IrrE蛋白可以賦予宿主抗逆表型(抗高鹽、抗氧化壓力、抗高滲透壓以及高溫)開始,IrrE蛋白成為一種可跨越種屬的限制與廣泛宿主建立起全基因組尺度的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,通過復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組水平上的調(diào)控差異,激發(fā)出新的表型。例如,IrrE蛋白可以激發(fā)各類(乳酸菌、節(jié)桿菌、大腸桿菌、運(yùn)動單胞菌、鞘氨醇單胞菌、假單胞菌和釀酒酵母等)菌體對極端環(huán)境的耐受能力,提高細(xì)胞自身的生產(chǎn)性能。因此,IrrE蛋白用于提高菌體耐輻射能力的同時,也可以打破物種的限制,用于提高各類菌體耐極端環(huán)境(抗高鹽、抗氧化壓力、抗高滲透壓和抗高溫等)的能力,提高菌體的生產(chǎn)性能。而且,由于IrrE蛋白比其他全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有更廣泛的應(yīng)用范圍,因此,IrrE蛋白作為一種抗逆元件是近幾年的研究熱門。

耐輻射極端微生物Deinococcus菌屬的菌株在分類學(xué)上已達(dá)20余種,作為該屬菌株中普遍存在的irrE基因,這些不同來源的野生型irrE基因是極其豐富的資源。在針對特定宿主及抗逆表型的應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn),不同來源irrE基因?qū)λ拗鞯淖饔眯Ч嬖诓町?而且IrrE蛋白的表達(dá)量也對宿主表型產(chǎn)生影響。因此,可以通過篩選IrrE蛋白突變體賦予宿主細(xì)胞對抗特定環(huán)境的能力。同時,如果野生型IrrE蛋白不能滿足宿主的抗逆性能需求,通過定向進(jìn)化方式獲得“適配”的突變體可以進(jìn)一步豐富抗逆元件“工具箱”。

因此,總結(jié)前期的一些研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),盡管來源于耐輻射極端微生物的抗逆元件IrrE蛋白在不同物種中的作用機(jī)制還不夠清晰,但卻不影響人們對它的應(yīng)用和嘗試。而且,隨著IrrE蛋白作為抗逆元件在各類細(xì)胞中的廣泛應(yīng)用嘗試,未來可能會出現(xiàn)具有針對性的或多樣化的IrrE抗逆元件“工具箱”。IrrE蛋白的廣泛適用范圍和可以激發(fā)宿主許多優(yōu)良的抗逆表型使其在合成生物學(xué)領(lǐng)域具有豐富的應(yīng)用前景。