徐林生

（武漢市黃陂區(qū)人民醫(yī)院，江漢大學(xué)附屬黃陂區(qū)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430300）

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC) 是近年來臨床上發(fā)病率持續(xù)升高的一種疾病。在發(fā)生該疾病的期間，腫瘤血管生成會為腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)提供一定的基礎(chǔ)[1]。血管生成理論認(rèn)為，當(dāng)實(shí)體腫瘤直徑大于2 mm 時(shí)需要誘導(dǎo)生成新的血管來獲取血供，否則腫瘤就會因?yàn)槿毖毖醢l(fā)生壞死。腫瘤誘導(dǎo)的血管生成主要步驟包括：腫瘤經(jīng)過無血管的緩慢生長期后( 指體積小于2 mm 時(shí)期)，便釋放多種血管生成因子，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變，基底膜及周圍的細(xì)胞外基質(zhì)降解，內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖，血管形成、改建。目前抗血管生成已經(jīng)成為腫瘤治療的一種新手段。在1999 年有學(xué)者根據(jù)對人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究，首次提出了一種與經(jīng)典腫瘤血管生成途徑不同，不依賴機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞的全新腫瘤微循環(huán)模式，即血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM) 的概念。血管生成擬態(tài)是一種腫瘤細(xì)胞供血模式，在形成血管生成擬態(tài)時(shí)會有多種因子參與，比如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α) 等[2]。組織蛋白酶D(cathepsinD,CTSD) 是一種天門冬氨酸水解酶，它的作用是降解細(xì)胞基膜、降解細(xì)胞外基質(zhì)等，它在腫瘤發(fā)生、發(fā)展期間起到了非常重要的作用[3]。此次我院對食管鱗狀細(xì)胞癌中HIF-1α、CTSD 表達(dá)和血管生成擬態(tài)的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)HIF-1α 與CTSD 表達(dá)存在一定的關(guān)系，CTSD 表達(dá)和血管生成擬態(tài)也存在一定的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年2 月至2018 年2 月我院收治的食管鱗狀細(xì)胞癌患者130 例，對患者的HIF-1α、CTSD 表達(dá)水平進(jìn)行檢測與分析。主要是收集了在我院進(jìn)行食管鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本的患者130 例，選取標(biāo)準(zhǔn)：1）患者在術(shù)前接受了活檢，無相關(guān)家族病史；2）均是在我院接受食管鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除的患者；3）術(shù)后經(jīng)病理診斷確診為食管鱗狀細(xì)胞癌；4）年齡均在40 ～80 歲之間；5）腫瘤無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；6）術(shù)前未進(jìn)行過放化療；7）隨訪患者死于食管癌或者是相關(guān)疾病；8）患者均知曉同意此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）術(shù)前接受放化療治療的患者；2）精神異常的患者；3）合并有其他惡性腫瘤的患者；4）術(shù)后病理未確診為食管癌；5）蠟塊保存不完整；6）隨訪資料不完整。130 例患者中有男88 例，女42 例；年齡43 ～78 歲，平均年齡（67.4±4.1）歲；腫瘤分化程度：低分化27 例，中分化65 例，高分化38 例。腫瘤浸潤程度：浸潤至深肌層及外膜層55 例，浸潤至黏膜層及淺肌層75 例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：無轉(zhuǎn)移80 例，轉(zhuǎn)移50 例。病理分級：共3 級，光鏡檢查下特征為：Ⅰ級：存在明顯的癌珠或者是角化；Ⅱ級：存在少許癌珠或者是角化，形狀為多角形、圓形、卵圓形，最常見的為核分裂；Ⅲ級：無癌珠或者是角化，癌細(xì)胞為規(guī)則形、卵圓形、索形，索形較少，最常見的為核分裂。Ⅰ級為高分化，Ⅱ級為中分化，Ⅲ級為低分化。其中Ⅰ級34 例、Ⅱ級56 例、Ⅲ級40 例。腫瘤分期：Ⅰ期26 例，Ⅱ期47 例，Ⅲ期57 例。無脈管癌栓形成72 例，脈管癌栓形成58 例，經(jīng)過病理檢查排除腫瘤累及。研究在我院倫理委員會得到了批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑HIF-1α、CTSD、鼠抗人單克隆抗體CD34（北京中杉金橋公司生產(chǎn)），PAS 染色試劑盒（上海貝索生物公司生產(chǎn)），二抗試劑盒、DAB 顯色試劑盒（福州邁新公司生產(chǎn)）[4]。

1.2.2 免疫組化方法 選取我院2016 年2 月至2018 年2月手術(shù)切除的食管癌標(biāo)本，對新鮮食管鱗狀細(xì)胞癌切除標(biāo)本進(jìn)行固定（10% 中性福爾馬林），采用常規(guī)石蠟對組織進(jìn)行包埋，對組織進(jìn)行連續(xù)切片（4μm 厚），常規(guī)對其進(jìn)行烘烤、蠟脫水、抗原修復(fù)，后嚴(yán)格按照試劑盒說明書對食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的HIF-1α、CTSD 表達(dá)情況進(jìn)行檢測，將已知陽性切片作為參考，PBS 代替一抗作為陰性對照[5]。具體的免疫組化圖片見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖2 免疫組化組織中存在角化珠（標(biāo)尺：4 倍）

圖3 免疫組化組織中存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象（標(biāo)尺：20 倍）

圖4 免疫組化組織中存在胞漿內(nèi)陽性表達(dá)（標(biāo)尺：40 倍）

1.2.3 CD34、PAS 染色應(yīng)用免疫組化法 對CD34 進(jìn)行染色，并進(jìn)行DAB 顯色。按照PAS 試劑盒說明書依次加入1 滴0.5% 的高碘酸，對其進(jìn)行還原，時(shí)間為10min ；后應(yīng)用水流對其進(jìn)行沖洗10min，之后將切片放置到避光濕盒內(nèi)，再加入1 滴Schiff 試劑，將其放到37℃溫箱中孵育20min。待組織變成紅色后使用蒸餾水對其進(jìn)行沖洗20min，后加入1 滴Mayer 蘇木精染液對細(xì)胞核復(fù)染2min，再使用溫水對其返藍(lán)1min 后進(jìn)行脫水、封固[6]。

1.2.4 結(jié)果分析免疫組化染色后CTSD 陽性信號主要存在于細(xì)胞質(zhì)，HIF-1α 陽性信號主要存在于細(xì)胞核[7]。按照陽性染色強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行評估：0 分：陰性；1 分：淡黃色；2 分：深黃色；3 分：棕色。按照陽性細(xì)胞 數(shù) 評 估：0 分：≤10%；1 分：11% ～30% ；2 分：31% ～69%；3 分：≥70%。陽性：兩項(xiàng)乘積≥3 分；陰性：兩項(xiàng)乘積＜3 分[8]。具體見圖5、圖6。

圖5 HIF-1α 在食管鱗癌組織中陽性表達(dá)于細(xì)胞核

圖6 HIF-1α 在食管鱗癌組織中陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)

1.2.5 CD34、PAS 染色判斷標(biāo)準(zhǔn) 通過顯微鏡觀察，食管鱗狀細(xì)胞無內(nèi)皮細(xì)胞，有腫瘤細(xì)胞圍成管腔；腔內(nèi)有無紅細(xì)胞；PAS 全部或者是部分陽性；食管鱗狀細(xì)胞癌：免疫組化CD34 陰性[9]。判斷時(shí)由三位經(jīng)驗(yàn)豐富、高年資的醫(yī)生進(jìn)行盲法讀片。

1.3 觀察指標(biāo)

1）分析患者的HIF-1α、CTSD 表達(dá)情況與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床特征情況。2）分析患者食管鱗狀細(xì)胞癌中CTSD 與血管生成擬態(tài)的相關(guān)性。3）分析患者食管鱗狀細(xì)胞癌中CTSD 與HIF-1α 的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS18.0 進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α、CTSD 表達(dá)情況與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床特征情況分析

130 例食管鱗狀細(xì)胞癌患者中，HIF-1α 陽性57 例，CTSD 陽性66 例；HIF-1α、CTSD 陽性表達(dá)情況與年齡、性別無明顯關(guān)系（P=0.071），但是HIF-1α、CTSD 陽性表達(dá)情況與脈管癌栓、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度明顯有關(guān)（P=0.023）。見表1。

表1 HIF-1α、CTSD 表達(dá)情況與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床特征情況分析[例(%)]

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌中CTSD 與血管生成擬態(tài)的相關(guān)性分析

130 例患者中存在血管生成擬態(tài)患者的CTSD 陽性率高于無血管生成擬態(tài)患者，CTSD 與血管生成擬態(tài)呈正相關(guān)（P=0.017），見表2。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌中CTSD 與血管生成擬態(tài)的相關(guān)性分析

2.3 食管鱗狀細(xì)胞癌中CTSD 與HIF-1α 的相關(guān)性分析

130 例患者中HIF-1α 陽性患者的CTSD 陽性率高于HIF-1α 陰性患者，CTSD 與HIF-1α 呈正相關(guān)（P=0.022），見表3。

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌中CTSD 與HIF-1α 的相關(guān)性分析

3 討論

食管鱗狀細(xì)胞癌是臨床消化科常見的惡性腫瘤。該腫瘤容易發(fā)生局部轉(zhuǎn)移、浸潤，且臨床致死率極高，而在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移與浸潤期間，血管生成發(fā)揮了重要的作用[10]。血管生成擬態(tài)是一種腫瘤細(xì)胞供血模式，它不需要依賴內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行供血[11]。血管生成擬態(tài)的形成與腫瘤惡性程度有很大的關(guān)系。腫瘤生長速度越快，惡化程度就越高。腫瘤的侵襲能力越強(qiáng)，越容易形成血管生成擬態(tài)，臨床上可以將血管生成擬態(tài)作為判斷腫瘤患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)[12]。

惡性腫瘤血管生成擬態(tài)形成期間，除腫瘤自身發(fā)生形變外，細(xì)胞外基質(zhì)降解重塑也是重要的一部分。因此，臨床上一般認(rèn)為血管生成擬態(tài)形成與HIF-1α 誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)，然后通過各級信號對級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行激活有關(guān)，最終會使細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解，從而使得腫瘤細(xì)胞游離并形成了血管生成擬態(tài)。缺氧是惡性腫瘤中比較常見的微環(huán)境，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展期間，缺氧導(dǎo)致CTSD 水平明顯升高。另外，CTSD 會參與細(xì)胞外基質(zhì)降解，發(fā)揮重塑作用。本研究顯示，130 例食管鱗狀細(xì)胞癌患者中，HIF-1α 陽性57 例，CTSD 陽性66 例；HIF-1α、CTSD 陽性表達(dá)情況與年齡、性別無明顯關(guān)系（P=0.071），但是HIF-1α、CTSD 陽性表達(dá)情況與脈管癌栓、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度明顯有關(guān)（P=0.023）。這說明，HIF-1α、CTSD 參與了食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤與轉(zhuǎn)移。缺氧狀態(tài)在實(shí)體腫瘤環(huán)境中屬于基本狀態(tài)，腫瘤對微環(huán)境缺氧有適應(yīng)與調(diào)節(jié)功效，而這種調(diào)節(jié)機(jī)制需要依賴于HIF-1α 因子的介導(dǎo)來完成，在這個過程中涉及侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞生存、血管生成[13-14]。在食管鱗癌中HIF-1α 因子的水平較高，且與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移、血管生成擬態(tài)有很大的關(guān)系。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌中HIF-1α 因子的表達(dá)是判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)。有研究顯示，血管生成擬態(tài)與HIF-1α因子的表達(dá)呈正相關(guān)，且與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有很大的關(guān)系，這可能與腫瘤惡性程度高、瘤細(xì)胞生長繁殖速度較快、變形能力較強(qiáng)、對周圍組織產(chǎn)生壓力、瘤組織內(nèi)的間質(zhì)液體量顯著升高有關(guān)。同時(shí)，腫瘤處于缺氧狀態(tài)會誘導(dǎo)HIF-1α 因子水平升高，HIF-1α 會通過調(diào)節(jié)多種血管生成因子表達(dá)情況來刺激血管新生，其中發(fā)揮作用最大、特異度最高的因子為血管內(nèi)皮生長因子。當(dāng)新生的血管無法滿足生長繁殖需要時(shí)，部分腫瘤細(xì)胞就會分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)來促使基質(zhì)重塑，模擬血管結(jié)構(gòu)使其與正常的血管相通，從而促進(jìn)了血管生成擬態(tài)的形成，最終為腫瘤自身的生長提供了血氧。HIF-1α 因子水平升高會促使血管生成擬態(tài)的形成。本研究顯示，130 例患者中存在血管生成擬態(tài)患者的CTSD 陽性率高于無血管生成擬態(tài)患者，CTSD 與血管生成擬態(tài)呈正相關(guān)（P=0.017）；130 例患者中HIF-1α 陽性患者的CTSD 陽性率高于HIF-1α 陰性患者，CTSD 與HIF-1α 呈正相關(guān)（P=0.022）。這說明，腫瘤的惡性程度越高，腫瘤的繁殖生長速度就越快，且瘤體不斷增大會對周圍組織造成壓迫，使腫瘤出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，使HIF-1α 水平顯著提高，而HIF-1α 水平與CTSD 呈正相關(guān)，HIF-1α 水平越高，CTSD 水平就越高。HIF-1α 會通過調(diào)節(jié)多種血管生成因子來刺激心血管的生成，整個過程為后期血管生成擬態(tài)的形成都奠定了基礎(chǔ)[15]。因此，血管生成擬態(tài)的形成與HIF-1α、CTSD 緊密相關(guān)。

綜上所述，對食管鱗狀細(xì)胞癌中HIF-1α、CTSD表達(dá)和血管生成擬態(tài)的關(guān)系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，CTSD 表達(dá)與血管生成擬態(tài)存在一定的聯(lián)系，而HIF-1α 與CTSD表達(dá)存在一定的聯(lián)系。