孫振平，于德龍，于 毓，仲 娜

（1. 青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266071 ；2. 青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院，山東 青島 266108）

銀黃滴丸是一種中成藥配方制劑，含有金銀花及黃芩的提取物等成分，臨床常用于治療上呼吸道感染、急慢性咽喉炎、肺熱咳嗽、目赤腫痛等病癥[1-3]。綠原酸（Chlorogenic Acid，CA）是金銀花提取物的主要成分，具有抗病原微生物、解熱、調(diào)脂、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[4-5]。CA 分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、多元酚等不穩(wěn)定部分，衰減較快，在水中極易水解，且對(duì)光、熱穩(wěn)定性均較差，常溫條件下保存，隨著時(shí)間的延長CA 含量會(huì)不斷下降[6-7]。在樣品提取過程中，往往因水解和分子內(nèi)酯基遷移發(fā)生異構(gòu)化等多種因素而導(dǎo)致有效成分的提取率明顯下降。本文通過相關(guān)試驗(yàn)，建立供試品溶液最優(yōu)制備方法，用以測(cè)定銀黃滴丸中CA 含量。

1 儀器與材料

LC-10Atvp 島津高效液相色譜儀；N2000 色譜工作站（浙江大學(xué)智達(dá)信息工程研究所）；TU1800S 型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KQ3200 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli Q 超純水機(jī)（法國Millipore 公司）；CA 對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110753 - 200212，供含量測(cè)定用）；銀黃滴丸（自制）；乙腈（色譜純）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4% 磷酸溶液（13:87），流速：1.0 mL/min ；檢測(cè)波長：327 nm；柱溫：30℃。理論板數(shù)為CA 峰計(jì)算不低于3000[8-9]。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取CA 對(duì)照品2.2 mg，置50 mL 棕色量瓶中，加50% 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為母液。精密量取母液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 至10 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖 勻， 即 得 濃 度 為4.4 μg/mL、8.8 μg/mL、17.6 μg/mL、26.4 μg/mL、35.2 μg/mL、44 μg/mL 的對(duì)照品溶液（10℃以下保存）。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖（見圖1），測(cè)定峰面積并進(jìn)行線性回歸（Y 表示峰面積，X 表示濃度），得回歸方程：Y=47128.82X-4952.86，r=0.99999 ；結(jié)果表明CA 在0.088 ～0.88 μg 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 對(duì)照品色譜圖

2.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，以峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果顯示RSD=0.22%。RSD 小于2%，表明儀器的精密度良好。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 提取方法的選擇 取本品，分別采用A. 超聲波提取、B. 回流提取、C. 冷浸提取三種方法比較提取率，具體如下：A. 超聲波提?。喝≈亓坎町愴?xiàng)下的本品，研細(xì)，分別取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇，定容至25 mL，超聲處理30 min，放至室溫，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL 棕色量瓶中，加50% 甲醇至刻度，搖勻，濾過（0.45 μm 濾膜），濾液作為供試品溶液。B. 回流提?。喊凑粘暡ㄌ崛》ú僮?，取樣品0.5 g，加50% 甲醇，定容至25 mL，加熱回流30 min，放至室溫，其余同A。C. 冷浸提取：按照超聲波提取法操作，取2 份樣品各0.5 g，加50% 甲醇，定容至25 mL，冷浸提取30 min，放至室溫，其余同A。按照上述色譜條件，分別測(cè)定上述三種提取液中CA 的含量，記錄色譜圖（見圖2），結(jié)果見表1。結(jié)果表明，超聲法提取率最高，主成分損失最小，故本文選擇超聲提取法。

圖2 樣品色譜圖

表1 不同提取方法CA 含量的比較（mg/g）

2.3.2 提取溶劑的選擇 分別取本品，研細(xì)，取2 份各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入50%甲醇、50%乙醇、甲醇、乙醇四種不同溶劑，定容至25 mL，分別超聲提取30 min，取出，放冷至室溫，其余同超聲波提取法。按上述色譜條件測(cè)定CA 含量，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，甲醇、乙醇提取分離不好，50% 甲醇提取含量最高，故本文選擇50%甲醇作為提取溶劑。

表2 提取溶劑考察結(jié)果（mg/g）

2.3.3 提取時(shí)間的選擇 取本品，研細(xì)，取2 份各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50% 甲醇，定容至25 mL，分別超聲提取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，取出，放冷至室溫，其余同超聲波提取法。按上述色譜條件測(cè)定CA 含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，超聲提取30 min 后，CA 含量不再增加，故本研究選擇超聲提取30 min。

表3 不同提取時(shí)間CA 含量的比較

2.3.4 制備方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件對(duì)提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間行ANOVA 分析，由表4 可見，提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間組間影響差異不顯著，經(jīng)方差分析，由方差大小可見影響提取的順序?yàn)锽 ＞A ＞C ；提取溶劑對(duì)提取效果影響最大，見表5。在CA 含量測(cè)定中，以50%甲醇超聲提取30 min 為供試溶液的最佳制備方法。

表4 ANOVA 統(tǒng)計(jì)分析

表5 方差分析

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以經(jīng)驗(yàn)證的制備方法制備供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h 分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)得供試品中CA 峰面積分別為820586.875、828743.813、828833.063、821822.875、821823.500、826982.438、828647.250，平均峰面積為825348.545，RSD=0.46%，表明本法穩(wěn)定性較好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取6 份銀黃滴丸樣品（批號(hào)為20190601），分別為0.5036 g、0.4994 g、0.5100 g、0.5024 g、0.5203 g、0.5321 g，按供試品溶液制備方法制備并測(cè)定CA 含量分別為6.28 mg/g、6.28 mg/g、6.38 mg/g、6.22 mg/g、6.27 mg/g、6.27 mg/g，平均6.28 mg/g，計(jì)算RSD= 0.8%（n=6），表明本法重復(fù)性較好。

2.6 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：20040401）約0.25 g，精密稱定，分別加入相當(dāng)樣品含量100% 的對(duì)照品，按照供試品制備方法操作，測(cè)定CA 含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表6。

表6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品測(cè)定

取本品10 個(gè)批次的樣品各0.5 g，分別按照上述制備方法制備供試品溶液并測(cè)定CA 含量，結(jié)果見表7。

表7 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

CA 分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、多元酚等不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，衰減較快，穩(wěn)定性差，在水中極易水解，在甲醇、乙醇中相對(duì)穩(wěn)定，且對(duì)光、熱均不穩(wěn)定。因此，樣品的前處理可直接影響CA 含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。本文比較了三種提取方法、四種提取介質(zhì)、五個(gè)提取時(shí)間對(duì)CA 含量測(cè)定的影響。經(jīng)方差分析，提取介質(zhì)對(duì)樣品制備影響最大，影響順序?yàn)樘崛∪軇?、提取方法、提取時(shí)間。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，用甲醇提取分離效果差，乙醇提取率較低，以50% 甲醇超聲提取30 min，樣品提取率高，方法穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好，可很好地控制銀黃滴丸中CA 的含量。