安子賢，李宜軒，鄭友峰，肖 昉，王 樂，陳 何，賴鐘雄，牟建梅，劉生財(cái)*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 蘇州 215000）

0 引言

【研究意義】莧菜（Amaranthus tricolorL.）屬石竹目莧科莧屬富含甜菜色素的一年生雙子葉草本植物[1-3]，環(huán)境條件對莧菜的營養(yǎng)品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要影響。因此，探究非生物脅迫對莧菜產(chǎn)量及品質(zhì)的影響具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】TCP是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，由TB1（TEOSINTE BRANCHED1）、CYC（CYCLOIDEA）和PCFs（PCF1、PCF2）3個(gè)成員組成，含有59個(gè)氨基酸，其主要特征在于其N端含有一個(gè)高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域又稱為TCP結(jié)構(gòu)域[4]。在模式植物擬南芥中，TCP基因主要對花、芽和葉片的生長發(fā)育起到調(diào)控作用，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對細(xì)胞有一定的調(diào)控作用，同時(shí)響應(yīng)多種非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)柳枝稷TCP基因?qū)}脅迫有響應(yīng)，并且在鹽脅迫條件下表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜[5]；在菜豆研究中發(fā)現(xiàn)， TCP 基因與鹽脅迫相關(guān)[6]；李佳皓等[7]研究證實(shí)馬鈴薯TCP對鹽脅迫下馬鈴薯的生長發(fā)育有一定的調(diào)控作用。TCP基因與miR319二者對甘藍(lán)型油菜鹽脅迫均有響應(yīng)，TCP靶基因的表達(dá)受到miR319的控制進(jìn)而調(diào)控植株的耐鹽性[8]；TCP參與植物器官的形態(tài)發(fā)育及細(xì)胞分裂的調(diào)控等[9-10]；任麗[11]對白樺TCP基因的研究證實(shí)了BpTCP3在白樺的不同部位均有表達(dá)，尤其在根部表達(dá)量最為顯著。【本研究切入點(diǎn)】TCP在陸地植物、藻類植物和苔蘚植物當(dāng)中均有發(fā)現(xiàn)，并且對于植物中TCP基因的研究非常廣泛[12]。目前，在擬南芥[13]、馬鈴薯[14]、茄子[15]、水稻[16]、高粱[9]和玉米[17]等園藝植物中對TCP在其物種中的作用和功能均有研究。但TCP基因在莧菜中的表達(dá)情況及功能尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對莧菜TCP基因家族進(jìn)行篩選鑒定，探討不同條件下TCP基因表達(dá)情況，為探究該家族基因在非生物脅迫條件下對莧菜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響奠定基礎(chǔ)，為調(diào)控莧菜生長發(fā)育過程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

莧菜種子為蘇莧1號，由蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。采用紙床法，將種子播種在培養(yǎng)皿中，分別進(jìn)行NaCl鹽脅迫（0、50、100 、200 mmol·L-1）、不同銨硝比（二者濃度為0∶0、0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0），分 別 用 NCK、 N1、 N2、 N3、 N4、 N5表 示 ）[18]及黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25 ±2） ℃，除黑暗條件下培養(yǎng)外，其他處理光照時(shí)間為16 h/8 h（光/暗）。培養(yǎng)5 d后取整株莧菜進(jìn)行RNA提取用于后續(xù)試驗(yàn)。莧菜不同組織部位采用30 d盆栽苗，分別取根、莖、葉進(jìn)行RNA提取用于qRT-PCR分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)據(jù)來源及AtrTCP家族基因的鑒定 數(shù)據(jù)來源于大紅莧菜胚軸的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（登錄號SRA：SRR5930345），該數(shù)據(jù)庫由本實(shí)驗(yàn)室課題組獲得，基因篩選方法參考王樂等[19]基因鑒定方法，通過Nr、Nt、Swissprot和Pfam 4個(gè)數(shù)據(jù)庫篩選基因，在篩選時(shí)輸入“TCP”進(jìn)行篩選，得到初篩基因，并利用SMART（https://smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對初篩基因進(jìn)行篩選及鑒定。

1.2.2AtrTCP基因家族蛋白生物信息學(xué)分析及保守結(jié)構(gòu)域分析 利用ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）、SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、Plant-mPLoc Server（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）和 MEME Suite 5.1.0（http://meme-suite.org/tools/meme）等在線軟件對AtrTCP蛋白序列的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和保守基序進(jìn)行分析；利用TBtools、MEGA-X、DNAMAN生物信息學(xué)分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）在線軟件對miRNA進(jìn)行預(yù)測。具體分析方法參照王樂等[19]方法進(jìn)行基因家族分析。

1.2.3 不同條件處理莧菜幼苗及qRT-PCR分析 通過紙床法對莧菜幼苗在鹽脅迫、硝銨配比及黑暗和藍(lán)光下進(jìn)行處理，在培養(yǎng)皿中放置3層濾紙，分別加入5 mL處理液，以ddH2O為對照組，除黑暗和藍(lán)光處理外，其余處理均放在16 h/8 h（光/暗）培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)；莧菜放在黑暗和藍(lán)光下進(jìn)行處理，處理5 d后進(jìn)行取樣。使用天漠科技開發(fā)有限公司（北京）提供的總RNA提取試劑盒提取不同濃度鹽脅迫、硝銨配比以及黑暗、藍(lán)光處理?xiàng)l件下的莧菜總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，利用DNAMAN軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，該基因組定量引物及內(nèi)參引物（EF1a）設(shè)計(jì)見表1，該引物由鉑尚生物技術(shù)有限公司（福州）合成。qRT-PCR結(jié)果分析根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)量。

表1 AtrTCP定量引物Table 1 Quantitative primers of AtrTCP

2 結(jié)果與分析

2.1 莧菜TCP基因家族的鑒定

基于莧菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過SMART篩選以及NCBI比對后，最終得到14個(gè)TCP家族成員基因，依次命名為AtrTCP1~AtrTCP14（表2）。通過對TCP基因家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示AtrTCP蛋白質(zhì)長度在230~721 aa，相對分子量為25.25~78.57 kD，等電點(diǎn)為6.15~9.45；AtrTCP11為穩(wěn)定蛋白外，其余均為不穩(wěn)定蛋白；AtrTCP蛋白全部為親水蛋白（表2）。在對其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，無規(guī)卷曲比例最高，處于54.91%~71.63%；其次是α-螺旋，為 11.82%~24.23%；延伸鏈為 10.23%~21.33%；β-轉(zhuǎn)角比例最低，為1.69%~10.95%；對該基因家族亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)全部定位于細(xì)胞核中 （表3）。

表2 AtrTCP基因家族理化性質(zhì)分析Table 2 Physicochemical properties of AtrTCP family

表3 AtrTCP基因家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析Table 3 Protein secondary structures and subcellular localizations of AtrTCP family

2.2 莧菜AtrTCP家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

根據(jù)TCP基因家族進(jìn)化關(guān)系，將TCP基因家族劃分為2個(gè)亞族：Class I和Class II；Class I為PCF，而Class II劃分2個(gè)分支CYC/TB1和CIN。通過MEGA-X軟件，對篩選得到的14個(gè)AtrTCP基因家族成員進(jìn)行基因家族進(jìn)化樹的構(gòu)建，根據(jù)莧菜AtrTCP基因與模式植物擬南芥AtTCP基因聚類分析發(fā)現(xiàn)，Class I亞族中，含有22個(gè)TCP家族成員，其中擬南芥12個(gè)，莧菜10個(gè)；Class II亞族中，CIN分支含有12個(gè)TCP家族成員，其中擬南芥8個(gè)，莧菜4個(gè)；CYC/TB1分支含有4個(gè)TCP家族成員，全部為擬南芥。AtrTCP1與AtTCP20、AtrTCP4與AtTCP2、AtrTCP8與AtTCP19、AtrTCP10與AtTCP11和AtrTCP12與AtTCP13基因親緣關(guān)系較近（圖1)，表明這5個(gè)莧菜AtrTCP基因與擬南芥AtTCP基因具有相似功能。

2.3 莧菜AtrTCP蛋白保守基序分析

通過MEME對AtrTCP蛋白進(jìn)行保守基序分析，共獲得了15個(gè)保守基序，依次命名為Motif1~Motif15。所有AtrTCP都含有Motif1基序，Motif1高度保守；除AtrTCP2、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP12外，其余AtrTCP均含有Motif2基序，Motif5出現(xiàn)6次，Motif12出現(xiàn)5次，其余蛋白保守基序均少于5次（圖2）。結(jié)合聚類分析發(fā)現(xiàn)，PCF（Class I）亞族成員包含特有的Motif2基序；CIN（Class II）亞族成員均含有Motif3基序（圖1、2）。

2.4 調(diào)控莧菜AtrTCP的miRNA預(yù)測

通過psRNATarget在線軟件，以莧菜small RNA數(shù)據(jù)庫為參考，AtrTCP核苷酸序列為待測序列，將篩選得到的14個(gè)AtrTCP家族成員進(jìn)行miRNA預(yù)測，結(jié)果顯示，只有4個(gè)AtrTCP家族成員受到miRNA的調(diào)控，AtrTCP6和AtrTCP2受到miR319_1、miR319_2、miR319a-3p和 miR319a_1的調(diào)控；AtrTCP11和AtrTCP13受到 miR5658的調(diào)控（表4）。miRNA的表達(dá)趨勢結(jié)果顯示，AtrTCP6和AtrTCP2總體表現(xiàn)為上調(diào)趨勢。

表4 莧菜AtrTCP基因家族miRNA的預(yù)測及差異表達(dá)分析Table 4 Prediction and differential expressions of AtrTCP family miRNA

2.5 不同處理下莧菜AtrTCP實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

2.5.1 鹽脅迫下莧菜AtrTCP家族成員qRT-PCR分析NaCl鹽溶液處理下的莧菜AtrTCP基因家族各成員qRT-PCR結(jié)果顯示，AtrTCP2在50 mmol·L-1的處理下表達(dá)量最高，隨著濃度升高，該基因表達(dá)量呈下調(diào)趨勢；AtrTCP6、AtrTCP11和AtrTCP12的表達(dá)量隨著鹽溶液濃度的升高呈上調(diào)趨勢，在100 mmol·L-1的處理下表達(dá)量達(dá)到最高值，而后呈下調(diào)趨勢；AtrTCP8、AtrTCP9和AtrTCP14的表達(dá)量隨著鹽溶液濃度的升高呈下調(diào)趨勢；AtrTCP1在200 mmol·L-1的處理下表達(dá)量達(dá)到最大值；隨著濃度的升高，AtrTCP3和AtrTCP10的表達(dá)量呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢；AtrTCP7和AtrTCP13的表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢；在不同鹽濃度處理下AtrTCP5的表達(dá)量無明顯變化（圖3）。

2.5.2 光質(zhì)處理下莧菜AtrTCP基因家族qRT-PCR分析 藍(lán)光和黑暗處理下的莧菜AtrTCP基因家族qRT-PCR分析結(jié)果顯示，AtrTCP1、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP10在藍(lán)光條件下表達(dá)呈上調(diào)趨勢，其余成員的表達(dá)均呈下調(diào)趨勢，其中，AtrTCP10基因在藍(lán)光條件下，表達(dá)量顯著上調(diào)；AtrTCP2、AtrTCP3、AtrTCP8、AtrTCP9、AtrTCP11和AtrTCP13表達(dá)量下調(diào)達(dá)到了顯著水平（圖4）。

2.5.3 不同銨硝比處理下莧菜AtrTCP基因家族成員qRT-PCR分析 不同銨硝比處理下的莧菜AtrTCP基因家族成員qRT-PCR結(jié)果顯示，AtrTCP2、AtrTCP3、AtrTCP9和AtrTCP10在銨硝比為0∶10和3∶7的表達(dá)量顯著高于銨硝比為10∶0和7∶3的表達(dá)量，其中AtrTCP3在不同銨硝比處理下與NCK對照發(fā)現(xiàn)，各處理表達(dá)量均上調(diào)，且均與NCK有顯著差異，參與整個(gè)氮代謝；而AtrTCP1則在銨硝比為10∶0和7∶3的表達(dá)量更高；AtrTCP4、AtrTCP7、AtrTCP8、AtrTCP10、AtrTCP11、AtrTCP12、AtrTCP13和AtrTCP14在不同銨硝比處理下表達(dá)量均下調(diào)；AtrTCP5隨著銨態(tài)氮配比的增大，表達(dá)量呈現(xiàn)先下降再上升再下降的趨勢，其中，在銨硝比為0∶0的處理下表達(dá)量最高，但在0∶10、3∶7、7∶3 和 10∶0 處理下無顯著差異（圖5）。

2.5.4 莧菜不同組織部位qRT-PCR分析 通過對莧菜不同部位的TCP家族成員進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示，AtrTCP家族成員AtrTCP3、AtrTCP12在葉部的表達(dá)量較高，其余家族成員均在根部的表達(dá)量較高（圖6）。

3 討論與結(jié)論

TCP轉(zhuǎn)錄因子在N段端有著高度保守的結(jié)構(gòu)域，是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。植物的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量差異也很大，研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)植物中存在TCP基因，玉米52個(gè)[20]、小麥28個(gè)[21]、水稻27個(gè)[16]、高粱27個(gè)[9]、棉花73個(gè)[22]、谷子26個(gè)[23]、擬南芥24個(gè)[24]和牡丹18個(gè)[25]等，而在莧菜中鑒定出14個(gè)成員，少于已報(bào)道的物種，這說明植物TCP轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量在不同物種間差異比較大，這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是由于莧菜TCP基因來源于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，部分基因沒有表達(dá)，而其他物種均來源于全基因組數(shù)據(jù)庫。

在對不同物種進(jìn)行生物信息學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同物種中聚類關(guān)系越緊密，說明兩者很大可能上具有相似的功能，在進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)，AtrTCP1與AtTCP20、AtrTCP4與AtTCP2、AtrTCP8與AtTCP19、AtrTCP10與AtTCP11和AtrTCP12與AtTCP13等5對可能具有相似的功能，其中，AtrTCP1可能與AtTCP20功能相似，參與調(diào)控細(xì)胞擴(kuò)增、細(xì)胞分裂及細(xì)胞分化等[26]；AtrTCP4可能與AtTCP2功能相似，在調(diào)控植物葉片形態(tài)和大小上發(fā)揮著重要作用[27]；AtrTCP8可能與AtTCP19功能相似，參與植物防御[28]；AtrTCP10與AtTCP11具有相似的功能，在調(diào)控維管束的發(fā)育方面發(fā)揮著重要的作用[29]；AtrTCP12可能在調(diào)控細(xì)胞分裂素信號途徑應(yīng)答方面發(fā)揮作用[30]。microRNA（miRNA）作為一種調(diào)控植物生長發(fā)育以及響應(yīng)脅迫的內(nèi)源性小RNA分子存在[31]。miRNA預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AtrTCP基因家族大多均受到miR319的調(diào)控，這與芥菜[32]、蝴蝶蘭[33]等多種植物相同，miRNA319對植物TCP基因家族的調(diào)控具有重要作用，并且已經(jīng)證實(shí)miR319靶向TCP基因[5]，而miRNA和TCP基因家族主要參與葉片的生長發(fā)育，對葉片有多層次的調(diào)控[34]。本研究發(fā)現(xiàn)AtrTCP2和AtrTCP6受多種miRNA調(diào)控，主要為miR319。有研究表明，藍(lán)光對于甜菜色素的合成有促進(jìn)作用[35]，莧菜AtrTCP基因家族成員AtrTCP1、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP10在藍(lán)光條件下表達(dá)量上調(diào)，推測AtrTCP1、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP10促進(jìn)莧菜中甜菜色素的合成，但是TCP轉(zhuǎn)錄因子參與甜菜色素的合成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

對莧菜的不同部位qPCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，AtrTCP基因家族中的不同成員對莧菜不同組織部位具有不同表達(dá)模式，各成員在根部的表達(dá)量均較高，說明TCP直接作用到根部，進(jìn)而影響整株植物的生長發(fā)育。而在莖部中，AtrTCP5表達(dá)量最高，其次是AtrTCP3，研究表明，芥菜中ClassⅠ亞族成員在莖的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[32]。AtrTCP12在葉部的表達(dá)量最高，AtrTCP2、AtrTCP3和AtrTCP4在葉部也具有較高的表達(dá)趨勢，這也進(jìn)一步印證不同物種中親緣關(guān)系較近的植株之間存在相似的功能，TCP基因家族中部分成員在調(diào)控植物葉片生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

對鹽脅迫下莧菜TCP基因定量結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，高濃度的鹽脅迫對莧菜的生長發(fā)育有明顯的抑制作用，高濃度下植物改變體內(nèi)通路；而低濃度的鹽脅迫對莧菜的生長發(fā)育的抑制作用較弱，低濃度下植物體內(nèi)自身防御系統(tǒng)起作用，而王廷芹等[36]對莧菜幼苗和曾泳怡等[37]對水稻幼苗等對生理研究結(jié)果相一致。AtrTCP基因在不同光質(zhì)、不同硝銨配比處理中發(fā)現(xiàn)，AtrTCP對光、非生物脅迫等有不同程度的響應(yīng)，這與谷子等[23]植物鹽脅迫相關(guān)研究結(jié)果相一致。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究TCP基因家族提供依據(jù)，并為TCP基因在莧菜生長過程中的作用機(jī)制及對莧菜非生物脅迫及發(fā)育的影響提供參考。