林馥茗，孫威江

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362000；3.福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】肉桂是福建閩北烏龍茶的代表，因其濃郁的花果香而深受消費(fèi)者的喜愛，而烏龍茶加工過程中的做青工序是形成其品質(zhì)特征的關(guān)鍵工序。逆境脅迫能夠促進(jìn)物質(zhì)間的轉(zhuǎn)化，并誘導(dǎo)生成次生代謝產(chǎn)物。茶葉加工也是一種人為干預(yù)性脅迫，尤其在做青環(huán)節(jié)發(fā)生了復(fù)雜的代謝變化，從而產(chǎn)生并積累大量的芳香物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物，為此研究做青對烏龍茶品質(zhì)形成的作用機(jī)制，可為烏龍茶生產(chǎn)提供理論參考。代謝組學(xué)是研究生物體在受到外界刺激等條件下，其代謝產(chǎn)物的變化情況及代謝途徑，以闡述生物體對應(yīng)刺激的響應(yīng)機(jī)制[1-2]。運(yùn)用代謝組學(xué)分析技術(shù)可以獲得大量的生化數(shù)據(jù)，通過代謝組學(xué)分析技術(shù)探究加工工藝對茶葉品質(zhì)的影響機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】代謝組學(xué)分析技術(shù)能夠深入了解茶葉在加工過程中發(fā)生的化學(xué)變化，已在紅茶、綠茶、烏龍茶、白茶及黑茶方面均有相關(guān)研究[3-7]。Fraser等[8]利用LC-MS檢測技術(shù)分析烏龍茶加工過程中代謝物的變化，結(jié)果表明在殺青階段會導(dǎo)致主要生物化學(xué)物質(zhì)發(fā)生改變，如類黃酮、核苷、櫻草糖苷；做青過程中只有少量物質(zhì)被標(biāo)記，氨基酸和茉莉酸以及相關(guān)代謝物有顯著的增加。Chen等[9]在鐵觀音烏龍茶加工過程中，檢測到揮發(fā)性物質(zhì)及非揮發(fā)性代謝物，如黃酮醇苷、氨基酸、萜烯類化合物等。Liu等[10]分析烏龍茶制作過程中揮發(fā)性和酚類化合物的動態(tài)變化，黃酮醇、酚酸和黃嘌呤生物堿的變化相對穩(wěn)定，醛、酮、雜環(huán)化合物則主要是在烘焙過程中形成。通過代謝組學(xué)鑒別茶樹品種[11-12]、產(chǎn)地[13-14]、年份[15-16]及品質(zhì)評價[17-19]等均有報道，能夠?yàn)橹笇?dǎo)茶葉加工生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前多數(shù)研究主要集中在茶葉加工過程中次生代謝途徑及相關(guān)產(chǎn)物的變化，對初生代謝產(chǎn)物研究較少，而這些物質(zhì)在植物中對環(huán)境脅迫防御適應(yīng)起重要作用，同時也影響下游次生代謝物質(zhì)的合成。【擬解決的關(guān)鍵問題】為此本研究通過GC-TOF-MS非靶向代謝組學(xué)檢測技術(shù)，對做青前后及對照樣品中糖類、有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物的影響，篩選鑒定差異代謝物并探討可能影響的代謝通路，為深入了解烏龍茶品質(zhì)形成的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取同一片長勢一致的無性系肉桂茶園，采摘春季中開面3、4葉茶梢為試驗(yàn)材料，且取自同一采摘批次的鮮葉，試驗(yàn)地點(diǎn)為武夷星茶業(yè)有限公司九龍山基地。

1.2 樣品收集

為盡可能保證樣品的代表性，本試驗(yàn)按照“看青做青”的原則，按照武夷巖茶的制作工藝（鮮葉→曬青→做青→殺青→揉捻→干燥），采用手工搖青的方式制作樣品。取20 kg鮮葉經(jīng)適度曬青后平均分為2組，一組進(jìn)行手工搖青，具體操作如下：第1次搖青10轉(zhuǎn)，第2次搖青20轉(zhuǎn)，第3次搖青40轉(zhuǎn)，第4次搖青60轉(zhuǎn)，第5次搖青80轉(zhuǎn)，第6次搖青120轉(zhuǎn)，第7次搖青300轉(zhuǎn)，中間晾青1 h，做青時間歷時8 h左右；同時在相同環(huán)境條件下另一組茶青為對照組，即無搖青的攤放處理（攤青），攤放時間與做青時間一致；做青間溫度23～25 ℃，相對濕度60%～70%。待做青結(jié)束后2組茶青經(jīng)殺青、揉捻、烘干后制成毛茶，處理組與對照組除做青工序外，其余工藝參數(shù)均一致，試驗(yàn)重復(fù)3次。本試驗(yàn)分別對曬青葉（SYM）、做青葉（LY7M）及對照組攤青葉（CK7M）進(jìn)行隨機(jī)取樣，取茶梢駐芽第2葉，用液氮迅速冷卻固定，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與設(shè)備

本試驗(yàn)的主要試劑包括：核糖醇（≥99%，SIGMA）、甲氧銨鹽（AR，TCI）、吡啶（HPLC，Adamas）、甲醇（HPLC，Adamas）、飽和脂肪酸甲酯（Dr.Ehrenstorfer）、BSTFA（with 1% TMCS，V/V，REGIS Technologies）、純水等。本試驗(yàn)所用儀器與設(shè)備主要有真空干燥儀（TNG-T98，太倉市華美生化儀器廠）、超聲儀（PS-60AL，深圳市雷德邦電子有限公司）、研磨儀（JXFSTPRP-24，上海凈信科技有限公司）、固相微萃取頭（65UM PDMS/DVB，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）、多功能進(jìn)樣器（MPS，德國Gerstel公司）、離心機(jī)（Heraeus Fresco17，賽默飛）、色譜柱（DB-5MS 30 m×250 μm×0.25 μm，美國LECO公司）、質(zhì)譜儀（PEGASUS HT，美國LECO公司）、氣相色譜（7890A，Agilent）、超低溫冰箱（Forma 900 series，賽默飛）等。

1.4 代謝物的提取

取樣品（50 ±1 ）mg 于 2 mL EP 管中，以體積比V（甲醇）：V（水）=3∶1加入0.45 mL 提取液和10 μL 核糖醇，渦旋30 s；再加入瓷珠，用研磨儀（45 Hz）處理4 min，超聲5 min（冰水浴），重復(fù)3次；將樣品于4 ℃、12 000 g離心15 min，取0.3 mL上清液于1.5 mL EP 管中，在真空濃縮器中干燥，向干燥后的代謝物加入90 μL 甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg·mL-1），輕輕混勻后，放入80 ℃烘箱中，孵育30 min；向每個樣品中加入100 μL BSTFA，將混合物在70 ℃孵育1.5 h，再隨機(jī)順序上機(jī)檢測。每個樣本均有6個生物學(xué)重復(fù)。

1.5 代謝物的檢測

GC- TOF-MS非靶向分析條件如下：進(jìn)樣量為1 μL；隔墊吹掃流速為3 mL·min-1；分流模式為Splitless Mode；載氣為氦氣；柱箱升溫程序?yàn)?0 °C保持1 min，再以 10 °C·min-1升到 310 °C，保持 5 min；柱流速為 1 mL·min-1；離子源溫度為250 °C；傳輸線溫度為280 °C；前進(jìn)樣口溫度為280 °C；電離電壓為-70 eV；掃描速率為 20光譜·s-1；質(zhì)量范圍為50～500 m/z；溶劑延遲為6.27 min。每個樣本均設(shè)6個生物學(xué)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用ChromaTOF 軟件（V 4.3x，LECO）對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析。使用了 LECO-Fiehn Rtx5 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物質(zhì)定性，包括質(zhì)譜匹配及保留時間指數(shù)匹配。利用歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，并利用多元統(tǒng)計(jì)分析（OPLS-DA） 和單變量統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的方法篩選差異代謝物，將差異代謝物進(jìn)行代謝通路KEGG 富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品間代謝物統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

由于加工取樣影響因素較復(fù)雜，用無監(jiān)督的主成分分析法（PCA）對組間樣品分離效果不理想（圖1），本試驗(yàn)采用正交偏最小二乘判別法（OPLSDA）對樣品間進(jìn)行分析，去除組內(nèi)不相關(guān)差異，結(jié)果如圖2~4所示，樣品SYM與CK7M、SYM與LY7M、CK7M與LY7M間都顯示出一定分離度，說明樣品間代謝物具有差異。

2.2 樣品間差異代謝物篩選

根據(jù)多元統(tǒng)計(jì)分析OPLS-DA的VIP值，并結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)分析t檢驗(yàn)P值篩選不同比較組間的顯著差異代謝物，以VIP≥1 且t-testP＜0.05為篩選條件確定差異顯著的代謝物；通過公共數(shù)據(jù)庫與公司自建數(shù)據(jù)庫對代謝物進(jìn)行定性，鑒定出的差異代謝物如表1所示，處理間差異代謝物變化倍數(shù)＞1。與曬青葉SYM相比，對照CK7M與做青葉LY7M差異顯著的代謝物中上調(diào)者居多，分別有19個和14個，下調(diào)的產(chǎn)物分別有2個和0個，說明長時間的機(jī)械力和細(xì)胞失水的脅迫作用使葉片內(nèi)代謝途徑發(fā)生顯著變化；與對照CK7M相比，做青葉LY7M中呈顯著上調(diào)的差異代謝物有9個，顯著下調(diào)的差異代謝物有3個。

表1 樣品間差異代謝物的篩選Table 1 Differential metabolites in samples

2.3 樣品間差異代謝物KEGG富集分析

將所得到的全部差異代謝物進(jìn)行KEGG富集分析，如圖5所示，差異代謝物主要涉及到的代謝途徑有糖類代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、其他次生代謝的生物合成、能量代謝、核苷酸代謝、其他氨基酸代謝及萜類和聚酮類化合物代謝等。

2.4 樣品間 GC-TOF-MS非靶向差異代謝物比較

通過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，能夠比對上通路的差異代謝物不多，通過GC檢測到的差異代謝物主要是有機(jī)酸與糖類物質(zhì)，曬青葉SYM與對照攤青葉CK7M間比對上的差異代謝物是硫磺酸、琥珀酸、莽草酸、檸檬酸、蘋果酸、苯丙氨酸、蘇糖酸、肌醇、熊果苷、棉子糖；曬青葉SYM與做青葉LY7M間比對上了7個差異代謝物，分別是琥珀酸、苯丙氨酸、D-甘油酸、蘇糖酸、蘋果酸、肌醇、麥芽糖；對照攤青葉CK7M與做青葉LY7M間比對上8個差異代謝物，分別是硫磺酸、琥珀酸、檸檬酸、莽草酸、苯丙氨酸、D-甘油酸、蘇糖酸、棉子糖。

通過熱圖展示比較組間差異代謝物情況，如圖6~8所示，肉桂鮮葉經(jīng)做青及攤青后，大部分代謝物含量要高于曬青葉，其中琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸是三羧酸循環(huán)途徑的中間產(chǎn)物。三羧酸循環(huán)是糖、脂類和氨基酸代謝的最后共同途徑，該循環(huán)的中間體可參與到其他代謝途徑中，直接利用三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的生物合成途徑有葡萄糖生物合成、脂類生物合成、氨基酸生物合成[20]。做青及攤青過程的機(jī)械損傷與失水作用可以增加三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，能夠?yàn)榇紊x產(chǎn)物的合成提供前體物質(zhì)和化學(xué)動力。做青結(jié)束時，葉片中琥珀酸和檸檬酸含量高于對照攤青葉，莽草酸含量明顯減少。莽草酸是莽草酸途徑中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，莽草酸在酶的催化下可以生成苯丙氨酸[21]。苯丙氨酸代謝途徑是茶樹次生代謝重要的途徑之一，能夠合成苯甲醇、苯乙醇等芳香族化合物[22]。本試驗(yàn)中檢測到做青葉中苯丙氨酸含量有一定程度增加。另外，在試驗(yàn)中還檢測到部分糖類物質(zhì)，參與蔗糖代謝和半乳糖代謝，均在做青與攤青后明顯增加，糖類物質(zhì)是植物體初生代謝合成的重要物質(zhì)，而環(huán)境脅迫作用能夠在一定程度上促進(jìn)糖類代謝活動。

3 討論與結(jié)論

茶葉加工過程中不同程度的非生物脅迫和生物脅迫等防御作用是誘導(dǎo)和促進(jìn)各類化合物合成的重要因素[23-25]，尤其是在烏龍茶做青過程中，因機(jī)械損傷和失水的雙重脅迫下，葉片內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生了顯著變化，最終形成了烏龍茶的品質(zhì)特征。Liu等[10]分析了肉桂烏龍茶加工過程中揮發(fā)性和酚類化合物的變化，在做青過程中78% 左右的黃烷醇被氧化形成茶黃素等產(chǎn)物，而黃酮醇、酚酸和黃嘌呤生物堿保持穩(wěn)定，醛、酮和雜環(huán)化合物等主要是在烘烤過程中形成。唐邦明等[26]通過UPLC-QTOF/MS檢測技術(shù)分析了烏龍茶加工過程中代謝物的變化，篩選出的差異代謝物包括牡荊素-2-O-鼠李糖苷、14,15-脫氫還陽參油酸、3-甲基黃嘌呤、麥黃酮、7-甲基黃嘌呤、枸橘苷、葡萄糖-6-磷酸，富集到的代謝途徑主要是氨基酸合成、淀粉與蔗糖代謝、類黃酮生物合成等。本研究通過KEGG富集分析表明差異代謝物涉及的途徑主要是糖類代謝、氨基酸代謝、脂類代謝等，與前人研究基本一致。在制茶環(huán)節(jié)中，非生物脅迫作用能夠促進(jìn)葉片中的多糖轉(zhuǎn)化為雙糖、單糖，隨后進(jìn)入次級代謝途徑[27]；蛋白質(zhì)可以水解形成氨基酸，而氨基酸類又參與氧化還原調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)、其他次級代謝產(chǎn)物的合成等[28]，對茶葉風(fēng)味品質(zhì)的形成有重要作用。

本研究結(jié)果顯示在相同環(huán)境及時間條件下，做青工序能夠明顯增加三羧酸循環(huán)途徑的中間產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物能夠參與糖類、氨基酸、脂類等物質(zhì)合成，從而間接影響茶葉的品質(zhì)。與對照相比，做青后葉片中莽草酸含量呈下調(diào)趨勢，而苯丙氨酸含量有所增加。莽草酸是合成苯丙氨酸的前體物質(zhì)，苯丙氨酸則參與生成了苯甲醇、苯乙醇等芳香族化合物。莽草酸途徑連接了初生代謝與次生代謝，也是芳香族化合物合成的必經(jīng)途徑。本試驗(yàn)中武夷肉桂經(jīng)做青后葉片中芳香族香氣物質(zhì)有顯著增加（其含量是對照組的1.67～2.94倍），與前人研究結(jié)果基本一致[29-30]。芳香族化合物是烏龍茶具有花果香特征的重要物質(zhì)，因此，推測做青工序能夠增強(qiáng)莽草酸的代謝速度，為次生代謝物質(zhì)的合成提供前體物，同時也促進(jìn)苯丙氨酸代謝，生成芳香族化合物，其機(jī)理有待進(jìn)一步明確。

烏龍茶是福建省特色茶類，具有愉悅的花果香和醇厚、回甘的口感，做青是品質(zhì)形成的重要工序。前人研究主要是關(guān)注做青過程次生代謝產(chǎn)物的變化，本試驗(yàn)則從初生代謝角度探討做青對烏龍茶品質(zhì)形成的影響；不足之處是做青過程初生代謝產(chǎn)物的變化尚不明確，后續(xù)可結(jié)合多組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組）聯(lián)合研究分析技術(shù)，深入研究做青對茶葉初級代謝與次級代謝的影響，明確做青對茶葉品質(zhì)形成的作用機(jī)制，為茶葉加工工程基礎(chǔ)研究和工藝的改良提升提供可靠的理論依據(jù)。目前做青方式仍以搖青與晾青交替進(jìn)行，操作較復(fù)雜且難掌握，結(jié)合前人研究結(jié)果可知做青過程中的機(jī)械作用能夠增強(qiáng)糖類、氨基酸、脂類、芳香物質(zhì)等代謝合成，因此可采用連續(xù)慢速搖青方式對做青工序進(jìn)行改良，既能促進(jìn)烏龍茶品質(zhì)形成，也能簡化工序、節(jié)約成本[31]。