郭 宇 文詩雨 倪 策 歐曉暉 屈婷敏 吳 穎 賀舒雯 李虹輝 崔 波 程云輝, 文 李

(1. 長沙理工大學食品與生物工程學院，湖南 長沙 410000；2. 中國科學院大學生命科學學院，北京 101408；3. 齊魯工業(yè)大學〔山東省科學院〕食品科學與工程學院，山東 濟南 250353)

近年來，中國水產(chǎn)品產(chǎn)量激增，加工副產(chǎn)物亦增多，但因其組成成分多、處理困難等，只有少部分能用作養(yǎng)殖飼料，絕大部分被丟棄處理，造成大量優(yōu)質(zhì)資源浪費。海灣扇貝(Argopectenirradians)是一種高蛋白、低脂、食用價值高的海鮮產(chǎn)品[1]，其加工副產(chǎn)物富含蛋白質(zhì)，有研究[2]嘗試將其加工副產(chǎn)物應(yīng)用到食品、保健品等領(lǐng)域，這對扇貝加工副產(chǎn)物的深入研究具有重要的應(yīng)用價值[3]。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧自由基快速積累，但清除防御系統(tǒng)不能及時清除而導致的機體受損[4]。生物活性肽是蛋白質(zhì)中天然氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的不同肽類的總稱，是源于蛋白質(zhì)的多功能活性因子[5]。其中抗氧化多肽可消除體內(nèi)多余的氧自由基，減輕自由基對機體的損傷，因而可用于治療由自由基積累引發(fā)的疾病[6]。由于人工合成抗氧化肽的安全性仍受到廣泛質(zhì)疑，因而食源性抗氧化肽備受青睞[7]。從天然食物中獲得氧自由基清除劑或抗氧化劑，是未來預(yù)防氧化應(yīng)激潛在的有效治療策略。而利用天然植物或動物加工副產(chǎn)物蛋白來制備生物活性肽，既可以避免蛋白質(zhì)資源的浪費，又可以開發(fā)出新型的天然抗氧化劑[8-9]。

研究擬利用堿提酸沉法、堿提硫酸銨沉法和低溫乙醇變性沉淀法，從扇貝加工副產(chǎn)物中提取扇貝蛋白。采用胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風味蛋白酶對副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)進行酶解，并分析酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，以期更好地為扇貝加工副產(chǎn)物的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

扇貝加工副產(chǎn)物：煙臺東宇海珍品有限公司；

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶：生物試劑，北京索萊寶科技有限公司；

十二烷基硫酸鈉(SDS)、N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)：純度99%，上海麥克林生化科技有限公司；

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)：純度97%，上海麥克林生化科技有限公司；

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：純度98%，嘉興思誠化工有限公司；

谷胱甘肽(GSH)：純度≥98%，北京酷來搏科技有限公司；

其他化學試劑：分析純，中國醫(yī)藥集團有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9246A型，太倉精宏實驗設(shè)備有限公司；

超級水浴：HH-601型，常州金壇良友儀器有限公司；

電子天平：AX224ZH型，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

冷凍干燥機：LGJ-25C型，四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京市六一儀器廠；

磁力攪拌器：8S-1型，常州國字儀器制造有限公司；

快速混勻器：XH-C型，金壇市醫(yī)療儀器廠；

脫色搖床：TS-1000型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

臺式高速冷凍離心機：TGL-16M型，湘儀離心機有限公司；

分光光度計：島津UV1800型，島津國際貿(mào)易(上海)有限公司；

超微弱發(fā)光測量儀：BPCL-1-TGC型，廣州微光科技有限公司；

高效液相色譜系統(tǒng)：Waters e2695型，泰靈佳科技有限公司；

重金屬消解儀：SH230N型，濟南海能儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 扇貝加工副產(chǎn)物蛋白提取 采用低溫乙醇變性沉淀法、堿提酸沉法和堿提硫酸銨沉淀法3種方法進行蛋白質(zhì)的提取，并利用凱氏定氮法進行純度對比。

(1) 低溫乙醇變性沉淀法：在胡昂等[10]方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化。將扇貝加工副產(chǎn)物洗凈，凍干48 h后，用研缽研磨2 h磨成粉末。將扇貝副產(chǎn)物粉和95%乙醇分別置于4 ℃冰箱預(yù)冷4 h，按m扇貝副產(chǎn)物粉∶V乙醇=1∶10 (g/mL) 的物料比將95%乙醇加入扇貝副產(chǎn)物粉中，調(diào)節(jié)pH值至7.0，置于4 ℃冰箱反應(yīng)24 h。將混合液于5 000 r/min下離心20 min，收集沉淀，并按1∶2 (g/mL)的物料比加入95%乙醇，再次置于4 ℃冰箱反應(yīng)24 h。取出混合液在上述條件下離心，收集沉淀于-20 ℃冰箱凍存。

(2) 堿提酸沉法：在李麗等[11]方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化。將扇貝副產(chǎn)物粉與0.1 mol/L NaOH按m扇貝副產(chǎn)物粉∶VNaOH=1∶30 (g/mL)的物料比混合，攪拌均勻，并調(diào)節(jié)pH值至12，超聲處理30 min。將混合液置于40 ℃水浴鍋中攪拌9 h，8 000 r/min離心15 min，收集上清。用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.4，8 000 r/min離心15 min，收集沉淀于-20 ℃冰箱凍存。

(3) 堿提硫酸銨沉淀法：在劉泰標等[12]方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化。將扇貝副產(chǎn)物粉與0.1 mol/L NaOH按m扇貝副產(chǎn)物粉∶VNaOH=1∶40 (g/mL)的物料比混合，攪拌均勻，并超聲處理30 min，置于30 ℃水浴鍋中反應(yīng)11 h。于4 ℃，10 000 r/min離心10 min，收集上清。加入過飽和硫酸銨，置于4 ℃冰箱中過夜。于上述條件下離心，取沉淀，袋透析48 h后收集透析液，置于-20 ℃冰箱中凍存。

將以上3種方法提取的蛋白質(zhì)置于提前預(yù)凍1 h的真空冷凍干燥機中-60 ℃凍干48 h，得到固體粉末，分別密封保存。

1.2.2 扇貝加工副產(chǎn)物蛋白含量分析 按GB/T 6432—2018執(zhí)行。

1.2.3 SDS-PAGE凝膠電泳 根據(jù)O'Sullivan等[13]的方法，修改如下：濃縮膠和分離膠含量分別為5%和12%，上樣體積為20 μL。20 mA恒流進樣15 min，40 mA恒流電泳至溴酚藍指示劑距離凝膠底部1 cm。

1.2.4 酶解物的制備 稱取堿提硫酸銨沉淀法制備的扇貝蛋白1.500 0 g，按料液比m扇貝蛋白∶V去離子水=1∶50 (g/mL) 加入去離子水，水化2 h。按表1分別加入4種酶進行酶解，酶解時加入0.1 mol/L HCl或NaOH使pH值穩(wěn)定在設(shè)定值，并記錄所消耗的酸堿體積，計算水解度(DH)。酶解結(jié)束后，將酶解產(chǎn)物置于99 ℃滅活8 min。冷卻后，10 000 r/min離心15 min，取上清液凍干(-60 ℃，48 h)。上述試驗均設(shè)置3個平行試驗。

表1 不同蛋白酶的反應(yīng)條件

1.2.5 酶解物的抗氧化活性檢測

(1) DPPH自由基清除率：根據(jù)GB/T 39100—2020。取3支試管，按表2添加試劑。

1號管為試驗組(As)，2號管為對照組(Ac)，3號管為空白組(Ab)，混勻后避光反應(yīng)30 min，517 nm下檢測吸光值。其中，使用樣品溶劑調(diào)零，谷胱甘肽作陽性對照，進行3次平行試驗。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

P——清除率，%；

As——待測溶液與DPPH溶液混合液的吸光度；

Ac——待測溶液與無水乙醇溶液混合液的吸光度；

Ab——DPPH溶液與樣品溶劑溶液混合液的吸光度。

(2) ABTS自由基清除率：根據(jù)GB/T 39100—2020。取2支試管，按表3添加試劑。

表3 ABTS 試劑添加量

1號管為試驗組(As)，2號管為空白組(Ab)，混勻后避光反應(yīng)5 min，734 nm下檢測吸光值。其中，使用樣品溶劑調(diào)零，谷胱甘肽作陽性對照，進行3次平行試驗。按式(2)計算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：

P——清除率，%；

Ab——ABTS+溶液與樣品溶劑溶液混合液的吸光度；

As——待測溶液與ABTS+溶液混合液的吸光度。

(3) 羥自由基清除率：利用紫外超微弱發(fā)光測量儀檢測羥自由基清除能力[14]。用硼砂溶液潤洗測量管，按表4 加入溶液。將混合液放入反應(yīng)池，設(shè)置反應(yīng)時間為900 s，每0.1 s測定一次發(fā)光強度，記錄峰值，平行測定3次。以蒸餾水為空白對照，谷胱甘肽為陽性對照。

按式(3)計算羥自由基清除率。

(3)

式中：

P——清除率，%；

Lb——樣品溶劑溶液混合液的發(fā)光強度；

Ls——待測溶液與樣品溶劑溶液混合液的發(fā)光強度。

表4 羥自由基試劑添加量

(4) 還原能力：在Wang等[15]方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化，將1 mL扇貝肽、2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL 1.0 g/100 mL鐵氰化鉀溶液混合。50 ℃下反應(yīng)25 min。混合物中加入0.5 mL 1.0 g/100 mL TCA，6 500 r/min 離心10 min。取2.5 mL上清液與2.5 mL 去離子水和0.5 mL 1.0 g/100 mL氯化鐵溶液混合。反應(yīng)10 min后，700 nm處測定吸光度。使用樣品溶劑調(diào)零，谷胱甘肽做陽性對照。

1.2.6 中性酶解產(chǎn)物的分子量分布分析 采用高效凝膠過濾色譜法分析中性酶解產(chǎn)物的相對分子量分布[16]。以多孔性填料為固定相，依據(jù)酶解混合物中肽分子大小進行分離。在肽鍵的紫外吸收波長220 nm處檢測吸光度，使用Empower軟件對色譜圖及其數(shù)據(jù)進行處理。通過計算肽的相對分子質(zhì)量大小及分布范圍，得出不同分子量大小的肽所占百分比。

1.2.7 中性酶解產(chǎn)物的氨基酸組分測定

(1) 氨基酸含量：利用鹽酸將中性酶解產(chǎn)物徹底水解成游離氨基酸(色氨酸在酸水解過程中幾乎完全被破壞，因此無法測定其含量)，經(jīng)過離子交換柱分離，分離產(chǎn)物與茚三酮溶液反應(yīng)變色，通過可見光—分光光度檢測器測定氨基酸含量[17]。

按式(4)計算樣品測定液氨基酸含量。

(4)

式中：

Ci——扇貝肽液中氨基酸濃度，nmol/mL；

Ai——扇貝肽液中氨基酸的峰面積；

As——氨基酸標準液的峰面積；

Cs——氨基酸標準液濃度，nmol/mL。

按式(5)計算試樣中各氨基酸含量。

(5)

式中：

Xi——扇貝肽氨基酸的含量，g/100 g；

F——稀釋倍數(shù)；

V——定容體積， mL；

M——氨基酸摩爾質(zhì)量，g/mol；

m——稱樣量，g。

(2) 羥脯氨酸含量：在105 ℃下用硫酸水解扇貝肽，水解結(jié)束后過濾并稀釋。羥脯氨酸與氯胺T發(fā)生反應(yīng)后，一定條件下可以與對二甲基氨基苯醛生成紅色產(chǎn)物，在550 nm處有最大吸收值[18]。按式(6)計算羥脯氨酸含量。

(6)

式中：

X——扇貝肽中羥脯氨酸含量，%；

C——利用標準方程計算得出扇貝肽液中羥脯氨酸質(zhì)量濃度，μg/mL；

m——扇貝肽的質(zhì)量，g；

v——在250 mL容量瓶中吸取的濾液體積，mL。

1.2.8 統(tǒng)計分析 用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，設(shè)置最小顯著水平為0.05，進行分析及差異顯著性檢驗。對不同處理數(shù)據(jù)進行Duncan多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白分析

2.1.1 蛋白質(zhì)含量 如圖1所示，3種方法所提蛋白含量均超過80%。李麗等[11]利用堿提酸沉法提取扇貝蛋白，蛋白含量為77.97%；在此法基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，提取過程中增加超聲波處理，并將酸沉的pH值由4.1提高到4.4，增加了蛋白質(zhì)的沉淀量，因而所提取蛋白含量有所提高，達82.95%。劉泰標等[12]利用堿提硫酸銨沉法從牡蠣中提取含硒蛋白質(zhì)，含硒蛋白量為44.90%；對該提取方法進行優(yōu)化，增加超聲波處理并將堿提的時間由9 h延長至11 h，獲得扇貝蛋白含量達(91.16±1.36)%。經(jīng)比較，優(yōu)化后的堿提硫酸銨沉淀法最適合從扇貝副產(chǎn)物中提取蛋白質(zhì)。

字母不同表示差異顯(P<0.05)圖1 3種提取方法所獲蛋白含量

2.1.2 SDS-PAGE分析 如圖2所示，乙醇變性法所提取的蛋白降解嚴重，而堿提酸沉法只能提取部分蛋白質(zhì)，無法獲得全蛋白。堿提硫酸銨沉法所提取的蛋白質(zhì)分子量分布最廣，電泳分離條帶清晰，說明提取過程中蛋白質(zhì)未被降解且雜質(zhì)干擾少。

綜合蛋白提取純度和電泳條帶效果，對堿提硫酸銨沉法所提蛋白進行酶解。

M. 分子量標記 1. 乙醇變性沉淀法 2. 堿提硫酸銨沉法3. 堿提酸沉法圖2 不同提取方法所獲蛋白質(zhì)SDS-PAFGE電泳圖譜

2.2 4種酶酶解物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除率 如圖3所示，陽性對照谷胱甘肽對DPPH自由基的清除率為(95.67±0.09)%；4種扇貝肽中，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率最高，為(29.20±0.73)%。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 4種酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率

2.2.2 ABTS自由基清除率 如圖4所示，酶解物和谷胱甘肽濃度相同，谷胱甘肽的ABTS自由基清除率高達(99.80±0.01)%，而樣品中清除力最強的是堿性蛋白酶酶解物，清除率為(69.75±0.79)%，其次是中性蛋白酶酶解物和風味蛋白酶酶解物；而胃蛋白酶對ABTS自由基清除率最低。Wang等[4]在分析不同酶解產(chǎn)物的抗氧化活性時也發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解物的ABTS自由基清除率最高，不過清除率僅為40%。研究中，除胃蛋白酶酶解產(chǎn)物外，所獲得的其他3種酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除率均高于50%，具有較強的抗氧化能力。

比較圖3和圖4，研究制備的4種扇貝蛋白酶酶解物對ABTS自由基的清除力整體高于對DPPH自由基的，說明從扇貝加工副產(chǎn)物中提取的蛋白質(zhì)，經(jīng)4種蛋白酶水解后，產(chǎn)生了更多有利于清除ABTS自由基的肽段。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 4種酶解物的ABTS自由基清除率

2.2.3 羥自由基清除率 如圖5所示，4種扇貝蛋白酶解物中，清除效果最佳的是中性蛋白酶酶解物和風味蛋白酶酶解物，二者無顯著差異，清除率均超過80%，而堿性蛋白酶酶解物的清除率最低。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 4種酶解物的羥自由基清除率

2.2.4 還原能力 如圖6所示，4種酶解產(chǎn)物中，中性蛋白酶酶解物的還原能力最強。由于試驗采用的扇貝蛋白酶解混合物，未對特定抗氧化肽進行純化，產(chǎn)物中含有多個不同氨基酸序列的寡肽，因而其還原力低于純肽——谷胱氨肽。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 4種酶解物的還原能力Figure 6 Reduction capacity of four kinds of enzymatic hydrolysates (n=9)

中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性高于其他酶解物。為了解該酶解產(chǎn)物的營養(yǎng)特性，進一步對其氨基酸組分及羥脯氨酸含量進行分析。

2.3 中性蛋白酶水解產(chǎn)物分子量分布及氨基酸組分

2.3.1 分子量分布 如圖7所示，根據(jù)出峰時間和峰面積，利用Empower軟件處理中性蛋白酶水解物的分子量分布(表5)。扇貝肽相對分子量主要分布在200～5 000 Da，總占比達(95.17±1.49)%，說明中性蛋白酶對扇貝加工副產(chǎn)物的酶解較充分，可以獲得大量的小分子肽產(chǎn)物。

2.3.2 氨基酸組分分析 如圖8和表6所示，由中性蛋白酶制備的扇貝肽中含天冬氨酸等15種氨基酸，總量達84 g/100 g。研究制備的扇貝肽中含蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸6種必需氨基酸，含量為(10.61±0.30) g/100 g；且扇貝肽中潛在抗氧化氨基酸有Ala、Tyr、Pro 3種，含量達(14.78±0.32) g/100 g，具有很高的營養(yǎng)價值。

圖7 中性蛋白酶水解產(chǎn)物分子量分布的HPLC圖Figure 7 HPLC map of dispase hydrolysates

表5 中性蛋白酶水解產(chǎn)物分子量分布

2.3.3 羥脯氨酸含量 經(jīng)測定，中性蛋白酶水解物的吸光度為0.41，羥脯氨酸含量為(11.82±0.09)%。Liu等[19]研究表明，膠原蛋白中含有較多羥脯氨酸，每天攝入膠原蛋白水解物可改變?nèi)梭w血液中肽的組成比例，并保持較高水平肽含量。羥脯氨酸是一種亞氨基酸，可使膠原肽衍生為低聚肽，對蛋白酶產(chǎn)生高抗性，防止被機體的蛋白酶水解。這類肽經(jīng)口服至腸道吸收并進入血液過程中，能始終以肽形式存在。因此含羥脯氨酸的小分子肽能完整通過腸細胞中肽轉(zhuǎn)運體系，進而吸收入血液，更穩(wěn)定、高效地發(fā)揮肽的生物活性[20-21]。

圖8 中性蛋白酶水解產(chǎn)物氨基酸分析色譜圖Figure 8 Amino acid analysis chromatogram of dispase hydrolysates

表6 中性蛋白酶水解產(chǎn)物中氨基酸組分及其含量?

3 結(jié)論

利用優(yōu)化的堿提硫酸銨沉法，在物料比(m扇貝副產(chǎn)物粉∶VNaOH)1∶40 (g/mL)、30 ℃沉淀11 h的條件下，從扇貝加工副產(chǎn)物中提取蛋白質(zhì)，可獲得純度高達(91.16±1.36)%的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。不同酶解物對于不同自由基清除效果不同，但總體上利用中性蛋白酶制備的扇貝肽的DPPH自由基清除力、羥自由基清除力及還原能力更佳。對中性蛋白酶物的氨基酸組分分析結(jié)果表明，扇貝肽中富含多種氨基酸，包括6種人體必需氨基酸，且羥脯氨酸含量達(11.82±0.09)%，營養(yǎng)價值高。含羥脯氨酸的小分子肽在人體內(nèi)可穩(wěn)定高效地發(fā)揮其生物活性，這是今后將進一步探討的課題。此外，借鑒Wen等[8]和Qu等[22]報道的生物信息學研究手段，有望篩選出潛在的特定氨基酸序列的扇貝源生物活性肽。