張今君 夏慧麗 高海波 張芳芳

(臺州市食品檢驗檢測中心，浙江 臺州 318000)

水生蔬菜是一類在淡水中栽培的可供食用的維管束植物，是中國區(qū)域性特色明顯的優(yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品，屬于區(qū)域性栽培，全球性消費的蔬菜，被稱為“中國特菜”[1]。

抗生素作為一種廣譜殺菌劑被廣泛應用于人類醫(yī)療和動物養(yǎng)殖，抗生素在動物體內(nèi)不會被完全吸收代謝，大部分以母體或代謝物的形式隨糞便排出，進入土壤或水體環(huán)境，進而被農(nóng)作物吸收積累，帶來抗生素污染[2-5]。當前關于動物源性食品中抗生素污染問題已被廣泛關注[6-8]，有關植物源性食品中抗生素污染問題的研究也有相關報道[9-10]，但對于水生蔬菜中喹諾酮類、磺胺類、硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素的多殘留分析卻少有研究涉及。因此建立一種簡便快速、定量定性準確的水生蔬菜中抗生素殘留檢測方法對評估水生蔬菜中抗生素含量水平、污染特征具有重要的理論指導和現(xiàn)實意義。

有關蔬菜中抗生素的檢測方法主要是高效液相色譜法[11-12]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]。高效液相色譜法分析效率高，定量準確，但在定性上存在局限性，不適用于多種類化合物的同時檢測；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有高選擇性、高靈敏度的特點，被廣泛應用于抗生素殘留檢測中。三重四極桿復合線性離子阱質(zhì)譜(Q-TRAP/MS)技術具有多反應監(jiān)測—信息關聯(lián)采集—增強子離子掃描(SMRM-IDA-EPI)模式，一次進樣能同時獲得MRM數(shù)據(jù)及高靈敏度的二級碎片全譜信息。SMRM模式鎖定目標化合物保留時間分段掃描，有利于改善色譜峰形，提高定量準確性；EPI模式在常規(guī)液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜利用保留時間、離子比進行定性的基礎上，對可疑色譜峰通過標準譜庫檢索進一步確證，定性能力更強。研究擬在傳統(tǒng)液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜基礎上，采用三重四極桿復合線性離子阱質(zhì)譜(Q-TRAP/MS)技術，建立水生蔬菜中45種抗生素藥物殘留檢測的篩查確證和定量方法，以期實現(xiàn)對水生蔬菜中多種抗生素殘留的同時測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

45種抗生素標準品：純度90.0%～99.9%，德國Dr.Ehrenstrorfer公司和美國Sigma公司；

無水硫酸鈉(Na2SO4)、N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)：吸附劑，上海安譜實驗科技股份有限公司；

甲酸、甲醇、乙腈：色譜純，美國Merck公司；

氯化鈉：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

高效液相色譜—三重四極桿線性離子肼質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：QTRAP 4500型，美國Sciex公司；

渦旋振蕩器：Multi Reax M10087型，德國Heidolph公司；

冷凍離心機：Allegra X-30R型，美國貝克曼庫爾特公司；

離心機：Microfuge 20型，美國貝克曼庫爾特公司；

超聲儀：2150 TH型，上海安譜實驗科技股份有限公司；

電子天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確稱取標準品各10.0 mg置于10 mL容量瓶中，硝唑類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類化合物用甲醇溶解并定容，喹諾酮類化合物加甲酸0.2 mL，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL標準儲備液，-18 ℃保存。臨用時，根據(jù)需要用空白基質(zhì)溶液配制混合標準工作溶液。

1.2.2 樣品處理 稱取粉碎均勻的樣品10.00 g，置于50 mL 具塞離心管中，加入20 mL含0.1%甲酸的乙腈溶液，渦旋振蕩15 min，加入4 g氯化鈉，渦旋混合1 min，5 000 r/min 離心5 min，移取上層乙腈溶液1 mL置于裝有無水Na2SO450 mg、PSA 20 mg、C1820 mg的凈化管中，渦旋2 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 有機濾膜過濾后上機測試。

1.2.3 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速200 μL/min；柱溫35 ℃；進樣體積5 μL；流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，95% A；1.0～1.5 min，95%～85% A；1.5～6.0 min，85%～45% A；6.0～8.0 min，45%～2% A；8.0～10.0 min，2% A；10.0～10.1 min，2%～95% A；10.1～12.0 min，95% A。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI源)；掃描方式：SMRM-IDA-EPI，正離子掃描(ESI+)；電噴霧電壓(IS) 5 500 V；離子源溫度(TEM) 550 ℃；氣簾氣壓力(CUR) 241 kPa；霧化氣壓力(GS1) 345 kPa；輔助氣壓力(GS2) 345 kPa，各化合物定量離子、定性離子對及其碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 化合物的質(zhì)譜參數(shù)?

1.2.5 EPI譜庫建立和檢索 45種抗生素標準品在高、中、低3種碰撞能量下進行EPI掃描，建立EPI譜庫，實際樣品在同一條件下獲取EPI二級譜圖，進行譜庫篩查匹配。譜庫比對結果中，F(xiàn)it值(匹配值)表示可疑樣品譜圖與標準品譜圖對比相似度值；RevFit(反匹配值)表示可疑樣品譜圖與標準譜圖對比相似度值；Purity值(純度值)是綜合正反匹配得出的結果，Purity值越高，說明該化合物可能性越大，Purity值≥ 60%時，可判定可疑樣品為陽性檢出。

1.3 數(shù)據(jù)處理

譜圖在MultiQuant 3.0.2軟件上處理，可疑樣品通過EPI譜庫匹配進行定性確證，外標法計算各組分含量。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 目前磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類化合物的提取溶劑主要有乙腈水溶液[16]、甲酸乙腈溶液[14,17]、Mcllvaine緩沖溶液與乙腈的混合液[13,18]、堿性乙腈溶液[19-20]等。以茭白為代表性基質(zhì)，考察了純乙腈、含0.1%甲酸的乙腈溶液、含0.5%甲酸的乙腈溶液、含1.0%甲酸的乙腈溶液、含0.1%甲酸的Mcllvaine緩沖鹽乙腈溶液、含0.5%氨水的Mcllvaine緩沖鹽乙腈溶液6種溶劑對45種化合物提取的影響，添加質(zhì)量濃度20 μg/kg。結果顯示以純乙腈和0.5%氨水Mcllvaine緩沖鹽乙腈為提取液時，諾氟沙星、洛美沙星、依諾沙星等多個喹諾酮類化合物的回收率低于60%；4種酸性乙腈提取液中，44種目標化合物的回收率變化趨勢基本一致，紅霉素化合物僅在0.1%甲酸乙腈中回收率高于60%，具體結果見圖1。因此選用0.1%甲酸乙腈作提取溶劑。

2.1.2 凈化條件優(yōu)化 蔬菜中含有的有機酸、糖類、維生素、脂肪等物質(zhì)會干擾目標物分析，同時會造成質(zhì)譜污染，試驗選取PSA去除有機酸、糖類和脂類，C18去除脂類對樣品進行凈化。以茭白為基質(zhì)，在20 μg/kg添加水平下，考察填料加入量對45種抗生素回收率的影響。結果顯示，PSA、C18兩種吸附劑加入量為10～60 mg時，各目標化合物回收率均在63.5%～117.2%。試驗還比較了無水Na2SO4和無水MgSO4對回收率的影響，發(fā)現(xiàn)在PSA和C18中添加無水MgSO4時，喹諾酮類化合物回收率只有7.5%～35.3%，這是由于喹諾酮中羧基和酮羰基與Mg離子形成螯合物被吸附導致的；在PSA和C18中添加無水Na2SO4時，各目標化合物回收率變化不明顯，綜合考慮回收率及除雜效果，確定PSA、C18及無水Na2SO4的加入量分別為20，20，50 mg。

2.2 色譜條件優(yōu)化

流動相選擇時考慮分離及離子化效率，磺胺類、喹諾酮類為酸堿兩性物質(zhì)，流動相中加入甲酸能促進電離，改善峰形，因此試驗選擇含0.1%甲酸的水溶液為水相。試驗繼續(xù)考察甲醇和乙腈為有機相時對45種化合物分離和響應的影響，結果表明，在1.2.3梯度條件下，乙腈作有機相時磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪3種同分異構體不能分開，而甲醇作為有機相時，45種化合物具有良好峰形和較高響應；4組9個同分異構體均能達到基線分離，分離情況見圖2。因此，選擇甲醇—0.1%甲酸水溶液作為流動相。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.3.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化 正離子模式下，將100 ng/mL各化合物標準工作液經(jīng)針泵以7 μL/min流速進入離子源進行參數(shù)優(yōu)化，45種化合物在Q1全掃模式下均獲得較高的[M+H]+準分子離子峰。子離子模式對準分子離子進行二級質(zhì)譜掃描，從碎裂的離子中選取兩個特征離子作為定量和定性離子。通過MRM掃描優(yōu)化DP和CE值，使定量與定性離子響應最大，優(yōu)化后45種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3.2 SMRM-IDA-EPI掃描模式的選擇 采用峰面積進行定量計算時通常需要每個色譜峰采集12個點，同時測定45種化合物，同一時間段監(jiān)測的離子數(shù)量較多，每個離子通道可能因為駐留時間較短無法采集到足夠點數(shù)導致峰形失真，影響峰面積定量。為提高定量結果準確度和精密度，在梯度洗脫條件下，根據(jù)每個峰的保留時間，設定MRM檢測窗口時間60 s，進行分段時間掃描，SMRM可掃描模式滿足色譜峰采集點數(shù)。同時，SMRM作為IDA的預掃描，觸發(fā)EPI掃描，二級碎片在離子阱中富集可獲得高靈敏度的二級碎片全譜信息，樣品在常規(guī)三重四極桿比較離子比的基礎上進一步與EPI建立的標準譜庫進行篩查確證，提高定性準確性。

圖1 45種抗生素在不同溶劑中的回收率Figure 1 Recoveries of the 45 kinds of antibiotics in different solvents

圖2 4組同分異構體的多反應監(jiān)測MRM色譜圖Figure 2 Multiple reaction monitoring chromatograms of 4 groups of isomers

2.4 基質(zhì)效應

分別以茭白、蓮藕、荸薺空白樣品配制1.0～100.0 μg/L 的基質(zhì)標準溶液和溶劑標準溶液，在1.2儀器條件下測定，以基質(zhì)標準曲線斜率對比溶劑標準曲線斜率評價基質(zhì)效應。結果顯示，45種抗生素均存在不同程度的基質(zhì)效應，其中磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、依諾沙星、諾氟沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星6種化合物存在較強基質(zhì)抑制效應，基質(zhì)效應為21.3%～38.2%。為降低基質(zhì)效應影響，采用基質(zhì)匹配標準溶液建立標準曲線對基質(zhì)效應進行校正。

2.5 方法學驗證

2.5.1 檢出限、定量限(LOQ)和線性范圍 配制1.0，2.0，5.0，10.0，50.0，100.0 μg/L一系列混合標準溶液，在1.2條件下測定，以各組分的峰面積對標準溶液濃度繪制標準曲線。結果表明45種抗生素在1.0～100.0 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.99，以3倍和10倍信噪比確定45種抗生素的檢出限和定量限，檢出限為0.3～1.0 μg/kg，定量限為1.0～3.0 μg/kg，具體見表2。

2.5.2 回收率及精密度 以茭白、蓮藕、荸薺為基質(zhì)，添加3個質(zhì)量濃度水平(分別為定量限的1，5，20倍)的標準溶液進行加標回收試驗，每個樣品平行測定6次，結果表明45種抗生素回收率均在60.4%～121.7%、相對標準偏差在0.9%～10.2%，具體見表2。

2.6 實際樣品測定

用建立的方法對市場采集的蓮藕、茭白、荸薺3個品種270批次水生蔬菜樣品中的45種抗生素殘留進行篩查分析。發(fā)現(xiàn)5批次茭白、2批次荸薺、1批次蓮藕樣品中篩查出含有洛美沙星、氟甲喹、雙氟沙星、氧氟沙星4種喹諾酮類殘留；3批次茭白和1批次蓮藕中篩查出磺胺二甲嘧啶殘留；2批次茭白分別篩查出羅紅霉素和克拉霉素。以上樣品中有1批次洛美沙星陽性可疑樣品，將可疑樣品EPI譜圖與標準譜庫進行匹配，結果見圖3、表3?？梢申栃詷悠分新迕郎承钦蚱ヅ渎蕿?8.554%，反相匹配率為98.554%，平均匹配率為98.554%，可確定該樣品為陽性檢出。

表2 45種抗生素的相關系數(shù)、檢出限、定量限、回收率及相對標準偏差

續(xù)表2

圖3 陽性可疑樣品的增強子離子掃描譜圖與譜庫中的洛美沙星標準譜圖的對比Figure 3 Comparison of EPI spectrum of a doubtful positive sample and the library spectrum of enroflfloxacin

表3 陽性可疑樣品的增強子離子掃描與譜庫匹配及低匹配度篩選結果

3 結論

研究建立了超高效液相色譜—三重四極桿復合線性離子肼質(zhì)譜同時測定水生蔬菜中45種抗生素的快速篩查和確證方法。該方法一次進樣同時獲得準確高質(zhì)量的MRM數(shù)據(jù)和EPI數(shù)據(jù)，快速簡便，定性定量能力強，檢測結果準確可靠，可推廣應用于其他類蔬菜中抗生素藥物殘留的檢測。方法建立的EPI譜庫為開放式譜庫，后續(xù)工作中可繼續(xù)添加其他抗生素，提高抗生素篩查和確證效率。