龔 霄 陳廷慧 胡小軍 范威威,3 李亞軍 趙新強(qiáng)

(1. 嶺南師范學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 湛江 524048; 2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524001; 3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070; 4. 寧夏西班酒莊，寧夏 銀川 751605)

果釀啤酒，又稱為果啤，為精釀啤酒的一個(gè)重要品類，是在淡色啤酒釀造過(guò)程中添加果汁或可食性部分釀造而成的一種特殊啤酒[1]。果釀型啤酒既保留了啤酒自身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如碳水化合物、氨基酸、維生素等，又融合了果汁中豐富的維生素、礦物質(zhì)及生物活性物質(zhì)等，無(wú)論是在風(fēng)味上還是在口感上都較傳統(tǒng)啤酒優(yōu)越[2]。揮發(fā)性化合物是影響果啤風(fēng)味的關(guān)鍵物質(zhì)，主要包括酯類、醇類、酸類、醛類、酮類和烷烴等[3]，具有含量低、易揮發(fā)和不易萃取的特點(diǎn)[4-5]。氣相色譜—離子遷移譜(GC-IMS)是近年來(lái)興起的一項(xiàng)用于分析食品風(fēng)味的新技術(shù)，將GC的高效分離優(yōu)勢(shì)與IMS的快速響應(yīng)等特點(diǎn)相結(jié)合，能夠有效提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度[6]，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、揮發(fā)性化合物損失少等優(yōu)點(diǎn)，近幾年被廣泛應(yīng)用于酒類分析中[7]。Yang等[8]利用該技術(shù)對(duì)不同果啤中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，篩選出不同果啤產(chǎn)品中的特征性風(fēng)味化合物。但GC-IMS技術(shù)在百香果果啤風(fēng)味分析中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

研究擬采用GC-IMS技術(shù)對(duì)百香果果啤釀造過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析初步確定百香果果啤中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，為百香果果啤的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

皮爾森麥芽：威海德科生物科技有限公司；

青島大花啤酒花：甘肅天馬酒花股份有限公司；

西楚啤酒花：山東博朗生物科技有限公司；

艾爾啤酒酵母S-04、US-05、S-33：濟(jì)南魯豐啤酒有限公司；

啤酒酵母CS31和CN36：安琪酵母股份有限公司；

百香果原汁：糖度14.3 °Brix，pH 2.93，生產(chǎn)日期20210721，廣西果朝食品有限公司；

C4～C9正構(gòu)酮：98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

4-甲基-2戊醇：98.5%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

現(xiàn)代工業(yè)經(jīng)濟(jì)不斷提升，為我國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了重要的貢獻(xiàn)，同時(shí)環(huán)保問(wèn)題隨之顯現(xiàn)，成為了重大的環(huán)境污染源之一，所以，必須踐行制造生產(chǎn)、環(huán)保優(yōu)先的和諧發(fā)展理念［6］。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜—離子遷移譜：FlavourSpec?型，德國(guó)GAS公司；

MXT-WAX色譜柱：30 m×0.53 mm，1.0 μm，北京瑞斯特科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 GC-IMS分析 將百香果果啤樣品輕輕打開(kāi)，在酒體中部快速吸取2 mL并轉(zhuǎn)移至20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，半密封狀態(tài)，4 ℃超聲水浴(28 kHz)脫氣30 s，1 g樣品中加入內(nèi)標(biāo)4-甲基-2-戊醇10 μL。頂空進(jìn)樣體積100 μL；孵育時(shí)間10 min；孵育溫度60 ℃；進(jìn)樣針溫度65 ℃；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；載氣為高純度氮?dú)?≥99.999%)；清洗時(shí)間0.5 min。GC條件：柱溫60 ℃；高純度氮?dú)?≥99.999%)；載氣流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min，8 min內(nèi)線性增至100 mL/min，10 min 內(nèi)線性增至150 mL/min，運(yùn)行時(shí)間20 min；IMS 條件：漂移管長(zhǎng)度98 mm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為高純度氮?dú)?≥ 99.999%)；漂移氣流速150 mL/min；放射源為β射線(氚，3H)；正離子模式。

1.2.3 定性定量 通過(guò)比較GC-IMS圖書(shū)館搜索軟件中標(biāo)準(zhǔn)的RI和漂移時(shí)間(DT)進(jìn)行揮發(fā)性化合物的定性分析；采用4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標(biāo)[9]，根據(jù)揮發(fā)性化合物的出峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，按式(1)計(jì)算其含量。

(1)

式中：

Ci——揮發(fā)性成分含量，μg/kg；

Ai——各物質(zhì)峰面積；

Astd——內(nèi)標(biāo)物峰面積；

Cstd——內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，mg/mL；

Vstd——內(nèi)標(biāo)物體積，mL；

ρ——內(nèi)標(biāo)物密度，g/mL；

m——加入樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010和SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組樣品重復(fù)3次，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(P<0.05)。通過(guò)Simca 14.1對(duì)香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果果啤釀造階段揮發(fā)性物質(zhì)分析

由圖1和表1可知，不同釀造階段的百香果果啤中共鑒定出63種揮發(fā)性有機(jī)物(同一化合物單體與二聚體視為一種)，其中酯類26種，醇類10種，醛類9種，酸類2種，酮類7種，烷烴類6種，呋喃類2種和醚類1種。揮發(fā)性酯對(duì)啤酒風(fēng)味的影響最為顯著，其組成、氣味閾值和相互作用對(duì)酒體整體的風(fēng)味感知具有重要影響[10]。除(Z)-3-己烯基己酸酯和癸酸乙酯外，麥汁中其他酯類含量均低于其他釀造階段。酯類物質(zhì)大都在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生，且百香果果汁的添加可以促進(jìn)酯的積累。己酸乙酯(甜香、香蕉、青蘋(píng)果香味)、乙酸異戊酯(香蕉、梨、蘋(píng)果香味)、丁酸乙酯(香蕉、菠蘿、草莓香味)、乙酸異丁酯(花香)、丙酸乙酯(蘋(píng)果香味)、乙酸乙酯(菠蘿香味)和乙酸丙酯(梨香味)等在百香果果啤中含量較為豐富。

揮發(fā)性酸是造成pH值變化的主要因素，并呈現(xiàn)出典型的醋味和過(guò)熟水果味[11]。百香果果啤中測(cè)定出兩種主要揮發(fā)酸(乙酸和丙酸)，發(fā)酵過(guò)程中乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，在初始麥汁中含量為(404.14±21.03) μg/kg，發(fā)酵前期含量增加至(1 218.14±62.81) μg/kg，約是麥汁中的3倍。

圖1 百香果果啤釀造過(guò)程中香氣物質(zhì)熱圖Figure 1 Heat map of flavor substances in passion beer during the brewing process

成品酒貯藏1個(gè)月后乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)[(1 186.96±75.60) μg/kg]較成品酒的[(1 354.57±16.82) μg/kg]顯著下降。丙酸是麥汁中糖降解的產(chǎn)物，在啤酒發(fā)酵過(guò)程中間接影響乙醇的生成，同時(shí)也為酯的合成提供前體，在貯藏過(guò)程中快速上升，約是貯藏前[(241.00±14.98) μg/kg]的13倍。

乙醇是酒精發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，果汁的添加會(huì)提高可發(fā)酵糖含量，隨之產(chǎn)生的乙醇量就會(huì)增加。乙醇對(duì)最終果啤中的風(fēng)味有較大影響，當(dāng)乙醇未很好地平衡時(shí)，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激性氣味和雜醇味[12]。麥汁中甲醇[(1 288.19±28.68) μg/kg]質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，可能和糖化酶的使用有關(guān)。但在酵母發(fā)酵過(guò)程中，甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸下降到(231.99±15.67) μg/kg，低于啤酒中限量標(biāo)準(zhǔn)(50 mg/kg)。1-己醇[(506.39±8.71) μg/kg]、1-戊醇[(147.88±2.37) μg/kg]、正丁醇[(203.07±2.30) μg/kg]、異戊醇[(1 380.51±14.48) μg/kg]和2-甲基丙醇[(528.19±9.67) μg/kg]在成品酒中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加(P<0.05)。整個(gè)釀造過(guò)程中，(Z)-3-己烯-1-醇和1-戊醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，與酵母代謝相關(guān)性較弱有關(guān)。異戊醇和2-甲基-1-丙醇與啤酒的可飲性密切相關(guān)，除乙醇外，異戊醇在啤酒中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是2-甲基-1-丙醇。

醛類物質(zhì)是酒精發(fā)酵過(guò)程中的中間代謝物，主要來(lái)源于Strecker降解或酵母代謝副產(chǎn)物，與啤酒老化有關(guān)[13]。當(dāng)啤酒中某些醛類化合物含量超過(guò)氣味閾值時(shí)，通常會(huì)呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的未成熟、硬紙板和腐爛的香氣。百香果果啤發(fā)酵中期丙醛(氧化蘋(píng)果味)、正丁醛(香瓜、綠麥芽味)、3-甲基-2-丁烯醛(杏仁香味)和戊醛(青草、蘋(píng)果、奶酪味)顯著增加。

2.2 主成分分析

由圖2可知，同一平行樣品聚類良好，但與其他樣品組被很好地區(qū)分，說(shuō)明百香果果啤中揮發(fā)性物質(zhì)的組成在釀造過(guò)程中發(fā)生了顯著變化。PC1和PC2貢獻(xiàn)率分別為62.1%和19.1%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為81.2%，表明其可以代表百香果果啤中整體的風(fēng)味組成。在PC1方向上，麥汁與其他發(fā)酵階段能夠很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明PC1與麥汁發(fā)酵前后引起的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的變化密切相關(guān)，主要的化合物有2-甲基丁酸丁酯(果香)、丁酸乙酯(香蕉、菠蘿、草莓香味)、丙酸乙酯(蘋(píng)果香味)、1-戊醇(柑橘、檸檬香味)和γ-萜品烯(檸檬香味)等，其多是在酵母參與發(fā)酵后產(chǎn)生的；在PC2方向上，發(fā)酵前期、中期、成品酒與后貯果啤產(chǎn)品有效區(qū)分開(kāi)，表明PC2與果啤發(fā)酵過(guò)程引起的揮發(fā)性代謝物變化密切相關(guān)，主要的化合物有乙酸甲酯(溶劑、果香味)、異丁酸乙酯(蘋(píng)果、柑橘、菠蘿香味)、2-甲基丙醛(果香、香蕉、甜瓜香味)、戊醛(堅(jiān)果氣味)、丙酸(酸腐，醬油味)和2-戊酮(茉莉、天竺葵香味)等。2-甲基丙醛、丙酸和2-戊酮含量在后貯過(guò)程中顯著增加，其中，2-甲基丙醛被認(rèn)為是啤酒老化的標(biāo)志物[14]。

圖2 百香果果啤釀造過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)主成分分析Figure 2 Principal component analysis of flavor substances during the brewing of passion beer

2.3 正交偏最小二乘法判別分析

由圖3可知，麥汁風(fēng)味與2-甲基丁酸丁酯-D、甲醇、3-羥基丁酮的相關(guān)性較強(qiáng)；發(fā)酵前期風(fēng)味與乙酸丁酯-M、3-甲基丁酸乙酯、甲酸乙酯、正丙醇、苯甲醛、乙醇、檸檬烯和乙酸甲酯-M具有較強(qiáng)的相關(guān)性；發(fā)酵中期風(fēng)味與丁酸丁酯-M、乙酸異戊酯-M、正丁醇-M、3-甲基-1-丁醇-D、2-甲基丙醇-D、乙酸-M和1-戊烯-3-酮具有較強(qiáng)的相關(guān)性；成品酒風(fēng)味與乙酸異戊酯-D、乙酸異丁酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、1-戊醇、4-甲基-3-戊烯-2-酮和莰烯-M具有較強(qiáng)的相關(guān)性；后貯酒風(fēng)味與丁酸己酯-M、乙酸丁酯-D、4-萜烯醇、1-己醇-M、丙酸和2-辛酮-M的相關(guān)性較強(qiáng)。

為了避免小樣本量帶來(lái)的誤差，對(duì)200個(gè)樣本進(jìn)行隨機(jī)排列測(cè)試，以驗(yàn)證模型的穩(wěn)定性。Q2和R2的截距分別為-0.716和0.321，表明該模型未出現(xiàn)過(guò)度擬合現(xiàn)象，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15]。在代謝組學(xué)中，VIP值通常被用來(lái)評(píng)估X變量對(duì)OPLS-DA模型的貢獻(xiàn)率，VIP值>1通常被認(rèn)為是關(guān)鍵變量。在OPLS-DA模型中共有30種化合物的VIP值>1，依次為四氫呋喃-D、3-甲基丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙醛、丙酸、二甲硫醚、2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、四氫呋喃-M、丁酸乙酯-D、丙醛-D、正丙醇、戊醛、甲酸乙酯、乙醇、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸丙酯、乙酸異戊酯-M、乙酸異戊酯-D、2-甲基丙醇-D、丙酸乙酯、1-戊烯-3-酮、1-戊醇、乙酸-M、甲醇、2-丁基呋喃、乙酸甲酯-D、乙酸甲酯-M、丁酸乙酯-M、丁酸己酯-M和異戊醇-D。

六邊形代表不同的樣品，3個(gè)相近六邊形為同一酒樣的平行處理，圓點(diǎn)代表?yè)]發(fā)性化合物

2.4 相對(duì)氣味活度值計(jì)算

為進(jìn)一步探究各化合物對(duì)果啤香氣成分的貢獻(xiàn)，對(duì)檢測(cè)到的化合物ROAV值進(jìn)行計(jì)算。由表1可知，麥汁的關(guān)鍵香氣物質(zhì)為4-萜烯醇、苯甲醛、乙酸己酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、丙酮、3-甲基丁醛、3-甲基丁酸乙酯、二甲硫醚、異丁酸乙酯和乙酸香茅酯等；發(fā)酵前期關(guān)鍵香氣物質(zhì)為4-萜烯醇、苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、乙酸己酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、丙酮、正丙醇、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚和異丁酸乙酯等；發(fā)酵中期關(guān)鍵香氣物質(zhì)4-萜烯醇、苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸己酯、丙酮、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、1-戊烯-3-酮、異丁酸乙酯和乙酸香茅酯等；成品酒中關(guān)鍵香氣物質(zhì)為4-萜烯醇、苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、乙酸己酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸異丁酯、丙酮、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、異丁酸乙酯、乙酸香茅酯、戊醛和正丁醛等；后貯酒關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)為丙酸、4-萜烯醇、苯甲醛、丁酸己酯、(E)-2-庚烯醛、乙酸己酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸異丁酯、丙酮、3-甲基丁醛、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、異丁酸乙酯、乙酸香茅酯和戊醛等。

表1 基于GC-IMS的百香果果啤釀造過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)及其含量?

續(xù)表1

續(xù)表1

將ROAV與VIP值結(jié)合，兩者均≥1的物質(zhì)有丁酸己酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸異丁酯、3-甲基丁醛、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯和二甲硫醚，共9種。以酯類化合物居多，是果啤香氣的主要貢獻(xiàn)者，如乙酸己酯(蘋(píng)果、櫻桃)、乙酸異戊酯(香蕉香味)、丁酸乙酯(香蕉、菠蘿香味)、乙酸異丁酯(花香)、3-甲基丁酸乙酯(蘋(píng)果香味)和乙酸丙酯(特殊的水果香氣)。

3 結(jié)論

采用GC-IMS技術(shù)分析了百香果果啤釀造過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)變化，共鑒定出63種風(fēng)味化合物，其中酯類26種，醇類10種，醛9種，有機(jī)酸類2種，酮類7種，烷烴類6種，呋喃類2種，醚類1種。百香果果啤發(fā)酵過(guò)程中，酯類物質(zhì)主要是通過(guò)?；⒖s合和酯化等生化反應(yīng)生成；醇類物質(zhì)主要是酵母代謝的副產(chǎn)物；醛酮類物質(zhì)主要與Strecker降解、美拉德反應(yīng)和氧化有關(guān)，此外，還與醇的氧化、酮酸脫羧、氨基酸脫氨及脫羧反應(yīng)有關(guān)。主成分分析結(jié)果表明，PC1和PC2累計(jì)差異貢獻(xiàn)率為81.2%，說(shuō)明百香果果啤釀造過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生顯著變化。采用正交偏最小二乘判別分析(VIP值>1)、結(jié)合相對(duì)氣味活度值(ROAV值≥1)，初步確定百香果果啤釀造過(guò)程中的15種潛在的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，包括丙酸、丁酸己酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸異丁酯、3-甲基丁醛、異戊醇、2-甲基丙醇、正丙醇、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、3-甲基-2-丁烯醛和戊醛。鑒于試驗(yàn)條件的限制，尚未進(jìn)行百香果果啤的中試生產(chǎn)放大試驗(yàn)。因此，生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量的一致性還有待深入研究。