龔 霄 陳廷慧 胡小軍 范威威,3 李亞軍 趙新強

(1. 嶺南師范學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 湛江 524048; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 湛江 524001; 3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070; 4. 寧夏西班酒莊，寧夏 銀川 751605)

果釀啤酒，又稱為果啤，為精釀啤酒的一個重要品類，是在淡色啤酒釀造過程中添加果汁或可食性部分釀造而成的一種特殊啤酒[1]。果釀型啤酒既保留了啤酒自身的營養(yǎng)物質(zhì)，如碳水化合物、氨基酸、維生素等，又融合了果汁中豐富的維生素、礦物質(zhì)及生物活性物質(zhì)等，無論是在風(fēng)味上還是在口感上都較傳統(tǒng)啤酒優(yōu)越[2]。揮發(fā)性化合物是影響果啤風(fēng)味的關(guān)鍵物質(zhì)，主要包括酯類、醇類、酸類、醛類、酮類和烷烴等[3]，具有含量低、易揮發(fā)和不易萃取的特點[4-5]。氣相色譜—離子遷移譜(GC-IMS)是近年來興起的一項用于分析食品風(fēng)味的新技術(shù)，將GC的高效分離優(yōu)勢與IMS的快速響應(yīng)等特點相結(jié)合，能夠有效提高檢測的準確度[6]，具有操作簡單、檢測時間短、揮發(fā)性化合物損失少等優(yōu)點，近幾年被廣泛應(yīng)用于酒類分析中[7]。Yang等[8]利用該技術(shù)對不同果啤中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分析，篩選出不同果啤產(chǎn)品中的特征性風(fēng)味化合物。但GC-IMS技術(shù)在百香果果啤風(fēng)味分析中的應(yīng)用還未見報道。

研究擬采用GC-IMS技術(shù)對百香果果啤釀造過程中的風(fēng)味物質(zhì)進行測定，結(jié)合多元統(tǒng)計分析初步確定百香果果啤中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，為百香果果啤的標準化生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量標準制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

皮爾森麥芽：威海德科生物科技有限公司；

青島大花啤酒花：甘肅天馬酒花股份有限公司；

西楚啤酒花：山東博朗生物科技有限公司；

艾爾啤酒酵母S-04、US-05、S-33：濟南魯豐啤酒有限公司；

啤酒酵母CS31和CN36：安琪酵母股份有限公司；

百香果原汁：糖度14.3 °Brix，pH 2.93，生產(chǎn)日期20210721，廣西果朝食品有限公司；

C4～C9正構(gòu)酮：98%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

4-甲基-2戊醇：98.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司。

現(xiàn)代工業(yè)經(jīng)濟不斷提升，為我國的經(jīng)濟發(fā)展做出了重要的貢獻，同時環(huán)保問題隨之顯現(xiàn)，成為了重大的環(huán)境污染源之一，所以，必須踐行制造生產(chǎn)、環(huán)保優(yōu)先的和諧發(fā)展理念［6］。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜—離子遷移譜：FlavourSpec?型，德國GAS公司；

MXT-WAX色譜柱：30 m×0.53 mm，1.0 μm，北京瑞斯特科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 GC-IMS分析 將百香果果啤樣品輕輕打開，在酒體中部快速吸取2 mL并轉(zhuǎn)移至20 mL頂空進樣瓶中，半密封狀態(tài)，4 ℃超聲水浴(28 kHz)脫氣30 s，1 g樣品中加入內(nèi)標4-甲基-2-戊醇10 μL。頂空進樣體積100 μL；孵育時間10 min；孵育溫度60 ℃；進樣針溫度65 ℃；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；載氣為高純度氮氣(≥99.999%)；清洗時間0.5 min。GC條件：柱溫60 ℃；高純度氮氣(≥99.999%)；載氣流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min，8 min內(nèi)線性增至100 mL/min，10 min 內(nèi)線性增至150 mL/min，運行時間20 min；IMS 條件：漂移管長度98 mm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為高純度氮氣(≥ 99.999%)；漂移氣流速150 mL/min；放射源為β射線(氚，3H)；正離子模式。

1.2.3 定性定量 通過比較GC-IMS圖書館搜索軟件中標準的RI和漂移時間(DT)進行揮發(fā)性化合物的定性分析；采用4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標[9]，根據(jù)揮發(fā)性化合物的出峰面積與內(nèi)標峰面積的比值，按式(1)計算其含量。

(1)

式中：

Ci——揮發(fā)性成分含量，μg/kg；

Ai——各物質(zhì)峰面積；

Astd——內(nèi)標物峰面積；

Cstd——內(nèi)標物質(zhì)量濃度，mg/mL；

Vstd——內(nèi)標物體積，mL；

ρ——內(nèi)標物密度，g/mL；

m——加入樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010和SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，每組樣品重復(fù)3次，結(jié)果以平均數(shù)±標準偏差表示(P<0.05)。通過Simca 14.1對香氣物質(zhì)進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果果啤釀造階段揮發(fā)性物質(zhì)分析

由圖1和表1可知，不同釀造階段的百香果果啤中共鑒定出63種揮發(fā)性有機物(同一化合物單體與二聚體視為一種)，其中酯類26種，醇類10種，醛類9種，酸類2種，酮類7種，烷烴類6種，呋喃類2種和醚類1種。揮發(fā)性酯對啤酒風(fēng)味的影響最為顯著，其組成、氣味閾值和相互作用對酒體整體的風(fēng)味感知具有重要影響[10]。除(Z)-3-己烯基己酸酯和癸酸乙酯外，麥汁中其他酯類含量均低于其他釀造階段。酯類物質(zhì)大都在發(fā)酵過程中產(chǎn)生，且百香果果汁的添加可以促進酯的積累。己酸乙酯(甜香、香蕉、青蘋果香味)、乙酸異戊酯(香蕉、梨、蘋果香味)、丁酸乙酯(香蕉、菠蘿、草莓香味)、乙酸異丁酯(花香)、丙酸乙酯(蘋果香味)、乙酸乙酯(菠蘿香味)和乙酸丙酯(梨香味)等在百香果果啤中含量較為豐富。

揮發(fā)性酸是造成pH值變化的主要因素，并呈現(xiàn)出典型的醋味和過熟水果味[11]。百香果果啤中測定出兩種主要揮發(fā)酸(乙酸和丙酸)，發(fā)酵過程中乙酸質(zhì)量分數(shù)顯著增加，在初始麥汁中含量為(404.14±21.03) μg/kg，發(fā)酵前期含量增加至(1 218.14±62.81) μg/kg，約是麥汁中的3倍。

圖1 百香果果啤釀造過程中香氣物質(zhì)熱圖Figure 1 Heat map of flavor substances in passion beer during the brewing process

成品酒貯藏1個月后乙酸質(zhì)量分數(shù)[(1 186.96±75.60) μg/kg]較成品酒的[(1 354.57±16.82) μg/kg]顯著下降。丙酸是麥汁中糖降解的產(chǎn)物，在啤酒發(fā)酵過程中間接影響乙醇的生成，同時也為酯的合成提供前體，在貯藏過程中快速上升，約是貯藏前[(241.00±14.98) μg/kg]的13倍。

乙醇是酒精發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物，果汁的添加會提高可發(fā)酵糖含量，隨之產(chǎn)生的乙醇量就會增加。乙醇對最終果啤中的風(fēng)味有較大影響，當乙醇未很好地平衡時，會產(chǎn)生強烈的刺激性氣味和雜醇味[12]。麥汁中甲醇[(1 288.19±28.68) μg/kg]質(zhì)量分數(shù)最高，可能和糖化酶的使用有關(guān)。但在酵母發(fā)酵過程中，甲醇質(zhì)量分數(shù)逐漸下降到(231.99±15.67) μg/kg，低于啤酒中限量標準(50 mg/kg)。1-己醇[(506.39±8.71) μg/kg]、1-戊醇[(147.88±2.37) μg/kg]、正丁醇[(203.07±2.30) μg/kg]、異戊醇[(1 380.51±14.48) μg/kg]和2-甲基丙醇[(528.19±9.67) μg/kg]在成品酒中的質(zhì)量分數(shù)顯著增加(P<0.05)。整個釀造過程中，(Z)-3-己烯-1-醇和1-戊醇質(zhì)量分數(shù)較低，與酵母代謝相關(guān)性較弱有關(guān)。異戊醇和2-甲基-1-丙醇與啤酒的可飲性密切相關(guān)，除乙醇外，異戊醇在啤酒中質(zhì)量分數(shù)最高，其次是2-甲基-1-丙醇。

醛類物質(zhì)是酒精發(fā)酵過程中的中間代謝物，主要來源于Strecker降解或酵母代謝副產(chǎn)物，與啤酒老化有關(guān)[13]。當啤酒中某些醛類化合物含量超過氣味閾值時，通常會呈現(xiàn)出強烈的未成熟、硬紙板和腐爛的香氣。百香果果啤發(fā)酵中期丙醛(氧化蘋果味)、正丁醛(香瓜、綠麥芽味)、3-甲基-2-丁烯醛(杏仁香味)和戊醛(青草、蘋果、奶酪味)顯著增加。

2.2 主成分分析

由圖2可知，同一平行樣品聚類良好，但與其他樣品組被很好地區(qū)分，說明百香果果啤中揮發(fā)性物質(zhì)的組成在釀造過程中發(fā)生了顯著變化。PC1和PC2貢獻率分別為62.1%和19.1%，累計貢獻率為81.2%，表明其可以代表百香果果啤中整體的風(fēng)味組成。在PC1方向上，麥汁與其他發(fā)酵階段能夠很好地區(qū)分開來，說明PC1與麥汁發(fā)酵前后引起的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的變化密切相關(guān)，主要的化合物有2-甲基丁酸丁酯(果香)、丁酸乙酯(香蕉、菠蘿、草莓香味)、丙酸乙酯(蘋果香味)、1-戊醇(柑橘、檸檬香味)和γ-萜品烯(檸檬香味)等，其多是在酵母參與發(fā)酵后產(chǎn)生的；在PC2方向上，發(fā)酵前期、中期、成品酒與后貯果啤產(chǎn)品有效區(qū)分開，表明PC2與果啤發(fā)酵過程引起的揮發(fā)性代謝物變化密切相關(guān)，主要的化合物有乙酸甲酯(溶劑、果香味)、異丁酸乙酯(蘋果、柑橘、菠蘿香味)、2-甲基丙醛(果香、香蕉、甜瓜香味)、戊醛(堅果氣味)、丙酸(酸腐，醬油味)和2-戊酮(茉莉、天竺葵香味)等。2-甲基丙醛、丙酸和2-戊酮含量在后貯過程中顯著增加，其中，2-甲基丙醛被認為是啤酒老化的標志物[14]。

圖2 百香果果啤釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)主成分分析Figure 2 Principal component analysis of flavor substances during the brewing of passion beer

2.3 正交偏最小二乘法判別分析

由圖3可知，麥汁風(fēng)味與2-甲基丁酸丁酯-D、甲醇、3-羥基丁酮的相關(guān)性較強；發(fā)酵前期風(fēng)味與乙酸丁酯-M、3-甲基丁酸乙酯、甲酸乙酯、正丙醇、苯甲醛、乙醇、檸檬烯和乙酸甲酯-M具有較強的相關(guān)性；發(fā)酵中期風(fēng)味與丁酸丁酯-M、乙酸異戊酯-M、正丁醇-M、3-甲基-1-丁醇-D、2-甲基丙醇-D、乙酸-M和1-戊烯-3-酮具有較強的相關(guān)性；成品酒風(fēng)味與乙酸異戊酯-D、乙酸異丁酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、1-戊醇、4-甲基-3-戊烯-2-酮和莰烯-M具有較強的相關(guān)性；后貯酒風(fēng)味與丁酸己酯-M、乙酸丁酯-D、4-萜烯醇、1-己醇-M、丙酸和2-辛酮-M的相關(guān)性較強。

為了避免小樣本量帶來的誤差，對200個樣本進行隨機排列測試，以驗證模型的穩(wěn)定性。Q2和R2的截距分別為-0.716和0.321，表明該模型未出現(xiàn)過度擬合現(xiàn)象，具有統(tǒng)計學(xué)意義[15]。在代謝組學(xué)中，VIP值通常被用來評估X變量對OPLS-DA模型的貢獻率，VIP值>1通常被認為是關(guān)鍵變量。在OPLS-DA模型中共有30種化合物的VIP值>1，依次為四氫呋喃-D、3-甲基丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙醛、丙酸、二甲硫醚、2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、四氫呋喃-M、丁酸乙酯-D、丙醛-D、正丙醇、戊醛、甲酸乙酯、乙醇、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸丙酯、乙酸異戊酯-M、乙酸異戊酯-D、2-甲基丙醇-D、丙酸乙酯、1-戊烯-3-酮、1-戊醇、乙酸-M、甲醇、2-丁基呋喃、乙酸甲酯-D、乙酸甲酯-M、丁酸乙酯-M、丁酸己酯-M和異戊醇-D。

六邊形代表不同的樣品，3個相近六邊形為同一酒樣的平行處理，圓點代表揮發(fā)性化合物

2.4 相對氣味活度值計算

為進一步探究各化合物對果啤香氣成分的貢獻，對檢測到的化合物ROAV值進行計算。由表1可知，麥汁的關(guān)鍵香氣物質(zhì)為4-萜烯醇、苯甲醛、乙酸己酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、丙酮、3-甲基丁醛、3-甲基丁酸乙酯、二甲硫醚、異丁酸乙酯和乙酸香茅酯等；發(fā)酵前期關(guān)鍵香氣物質(zhì)為4-萜烯醇、苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、乙酸己酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、丙酮、正丙醇、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚和異丁酸乙酯等；發(fā)酵中期關(guān)鍵香氣物質(zhì)4-萜烯醇、苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸己酯、丙酮、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、1-戊烯-3-酮、異丁酸乙酯和乙酸香茅酯等；成品酒中關(guān)鍵香氣物質(zhì)為4-萜烯醇、苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、乙酸己酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸異丁酯、丙酮、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、異丁酸乙酯、乙酸香茅酯、戊醛和正丁醛等；后貯酒關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)為丙酸、4-萜烯醇、苯甲醛、丁酸己酯、(E)-2-庚烯醛、乙酸己酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸異丁酯、丙酮、3-甲基丁醛、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、異丁酸乙酯、乙酸香茅酯和戊醛等。

表1 基于GC-IMS的百香果果啤釀造過程中的風(fēng)味物質(zhì)及其含量?

續(xù)表1

續(xù)表1

將ROAV與VIP值結(jié)合，兩者均≥1的物質(zhì)有丁酸己酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸異丁酯、3-甲基丁醛、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯和二甲硫醚，共9種。以酯類化合物居多，是果啤香氣的主要貢獻者，如乙酸己酯(蘋果、櫻桃)、乙酸異戊酯(香蕉香味)、丁酸乙酯(香蕉、菠蘿香味)、乙酸異丁酯(花香)、3-甲基丁酸乙酯(蘋果香味)和乙酸丙酯(特殊的水果香氣)。

3 結(jié)論

采用GC-IMS技術(shù)分析了百香果果啤釀造過程中的風(fēng)味物質(zhì)變化，共鑒定出63種風(fēng)味化合物，其中酯類26種，醇類10種，醛9種，有機酸類2種，酮類7種，烷烴類6種，呋喃類2種，醚類1種。百香果果啤發(fā)酵過程中，酯類物質(zhì)主要是通過?；?、縮合和酯化等生化反應(yīng)生成；醇類物質(zhì)主要是酵母代謝的副產(chǎn)物；醛酮類物質(zhì)主要與Strecker降解、美拉德反應(yīng)和氧化有關(guān)，此外，還與醇的氧化、酮酸脫羧、氨基酸脫氨及脫羧反應(yīng)有關(guān)。主成分分析結(jié)果表明，PC1和PC2累計差異貢獻率為81.2%，說明百香果果啤釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生顯著變化。采用正交偏最小二乘判別分析(VIP值>1)、結(jié)合相對氣味活度值(ROAV值≥1)，初步確定百香果果啤釀造過程中的15種潛在的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，包括丙酸、丁酸己酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、1-戊烯-3-酮、乙酸異丁酯、3-甲基丁醛、異戊醇、2-甲基丙醇、正丙醇、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、二甲硫醚、3-甲基-2-丁烯醛和戊醛。鑒于試驗條件的限制，尚未進行百香果果啤的中試生產(chǎn)放大試驗。因此，生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量的一致性還有待深入研究。