劉力萍，王宏華，王峰，丁鵬，孫子豪，王哲，喬穎，侯竹美*

1.青島農(nóng)業(yè)大學海洋科學與工程學院，山東 青島 266109；

2.濰坊華卓生物科技有限公司，山東 濰坊 261100

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）屬于弧菌科弧菌屬。據(jù)調(diào)查，我國沿海水域及海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢出率較高，尤其是氣溫較高的夏秋季節(jié)［1］。副溶血弧菌可引發(fā)大規(guī)模水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害，造成海水魚類體表發(fā)炎充血和南美白對蝦發(fā)生急性肝胰腺壞死綜合癥［2］。同時，作為人畜共患病菌，人類食用攜帶副溶血弧菌的食物后，會導(dǎo)致人體發(fā)生急性胃腸炎，少數(shù)情況引發(fā)敗血病，甚至危及生命［3］。

噬菌體（becteriophage）是細菌的制衡者，具有特異性、裂解性和天然性等特點。鑒于細菌的自我防御，噬菌體也在不斷進化中。近年來，我國倡導(dǎo)綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖，發(fā)布了關(guān)于抗生素禁用的政策，明確表示對濫用藥物的行為進行嚴懲［4］。目前，國內(nèi)外研究的關(guān)注點集中于噬菌體對水產(chǎn)品中致病菌的作用效果，它作為生物抗菌劑［5］在養(yǎng)殖業(yè)中對水產(chǎn)品病原菌控制方面的成效顯著。

本研究從青島市城陽市水產(chǎn)批發(fā)市場采集的15份海產(chǎn)品養(yǎng)殖水及下水道污水中分離獲得一株副溶血弧菌噬菌體CHY5-M1M，并對其基本的生物學特征和應(yīng)用進行研究，以期為篩選出裂解性強的噬菌體和設(shè)計新型藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 宿主菌副溶血弧菌（編號：186296）樣品，分離自青島市城陽水產(chǎn)品批發(fā)市場養(yǎng)殖水和下水道污水。

1.1.2 主要試劑和儀器營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）購自青島科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；酵母粉購自蘭杰柯科技有限公司；瓊脂粉購自生物工程股份有限公司；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000購自國藥集團化學試劑有限公司；SM緩沖液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；DNA試劑盒購于杭州西頓生物科技有限公司；智能恒溫培養(yǎng)振蕩器購自天津歐諾儀器股份有限公司；全溫振蕩器購自蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機購自熱電實驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離采用點滴法分離采集樣品中的副溶血弧菌噬菌體。采集水樣以5 000 r·min-1離心10 min后取上清液過濾。取對數(shù)期的副溶血弧菌0.1 mL與0.1 mL濾液于5 mL LB液體培養(yǎng)液中，混合均勻后放入37℃搖床。增殖后離心10 min，0.22μm過濾膜過濾上清。移取0.1 mL上清加入含0.75%半固瓊脂中混勻，倒入底層有NA的平板，放入37℃培養(yǎng)8 h，觀察是否有噬菌斑［6］。

1.2.2 噬菌體的純化及效價測定采用雙層平板法純化噬菌體［7］。移取噬菌體原液和副溶血弧菌混于試管中，37℃孵育20 min，混于半固體培養(yǎng)基中，倒雙層平板。培養(yǎng)8 h后觀察結(jié)果。用無菌槍頭挑取噬菌斑放入1 mL SM緩沖液中。37℃搖床培養(yǎng)40 min，將浸出液離心過濾。然后進行10倍比稀釋，繼續(xù)雙層平板法培養(yǎng)。以上操作重復(fù)3次，直至出現(xiàn)大小相同、獨立、分布均勻的噬菌體斑。純化的噬菌體增殖后雙層平板法測定噬菌體增殖液效價。

1.2.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測定將菌液按10倍比稀釋后分別平板涂布，培養(yǎng)8 h后計算菌落數(shù)量。根據(jù)細菌效價，分別按噬菌體效價/對數(shù)期宿主菌濃度（MOI）=100∶1,10∶1,1∶1,1∶10,1∶100,1∶1 000混合后，再與5 mL LB液體培養(yǎng)基混合，震蕩培養(yǎng)后離心過濾，此時會產(chǎn)生不同的噬菌體增殖液，采用雙層平板法測得效價［8］。

1.2.4 噬菌體一步生長曲線測定取菌液與最佳感染復(fù)數(shù)的噬菌體混合于離心管中，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育。取出混合液離心倒上清液。SM緩沖液重懸沉淀，洗滌重復(fù)2次。放入37℃、200 r·min-1搖床，此時記為0時刻，此后每隔20 min取一次樣并離心，雙層平板法測效價。根據(jù)橫坐標感染時間、縱坐標噬菌體效價，繪制一步生長曲線［9］。

1.2.5 噬菌體熱穩(wěn)定性測定噬菌體培養(yǎng)液離心過濾，取1 mL分裝到1.5 mL離心管中。將裝有噬菌體的1.5 mL離心管分別放入30、40、50、60、70℃的水浴鍋中溫浴2 h，對處理好的噬菌體稀釋測效價［10］。設(shè)置3個平行組。

1.2.6 噬菌體pH穩(wěn)定性測定將0.1 mL噬菌體增殖液分別加入0.9 mL pH為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0的LB液體培養(yǎng)基中，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后取樣，用鹽酸和氫氧化鈉溶液分別將pH調(diào)至原培養(yǎng)基pH后，進行10倍比稀釋，用雙層平板法測定噬菌體效價［11］。

1.2.7 噬菌體的紫外線穩(wěn)定性測定噬菌體增殖液放在無菌平皿中，打開蓋子，使噬菌體液暴露在距離紫外燈35 cm處，連續(xù)照射60 min，每10 min取0.8 mL噬菌體液，進行10倍比稀釋，利用雙層平板法測定噬菌體效價［12］。

1.2.8 噬菌體的全基因組測序副溶血弧菌噬菌體原液10 mL，加入0.584 g氯化鈉、1.0 g PEG 6000，室溫溶解混合后冰浴3 h，4℃10 000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀加0.2 mL PBS重懸，獲得基礎(chǔ)噬菌體濃縮液。再加入0.015 mL DNase，混勻放入37℃水浴30 min，除去宿主DNA。之后加0.05 mL RNase，混勻后放入37℃水浴15 min，除去宿主RNA。將處理樣品儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

委托上海凌恩生物科技有限公司利用Illumina novaseq 6000測序平臺對基因組進行測序［13］。首先，過濾低質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量的清除數(shù)據(jù)（clean data）；其次，利用組裝軟件對清除數(shù)據(jù)（clean data）進行組裝，多次調(diào)整參數(shù)及補洞后獲得基因組序列，之后對編碼基因（coding gene）進行分析；最后將基因功能與通用功能數(shù)據(jù)庫比對，注釋編碼基因［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離純化及噬菌斑形態(tài)特征

從青島市城陽水產(chǎn)品批發(fā)市場采集的海產(chǎn)品養(yǎng)殖水及下水道污水，采用點滴法分離純化副溶血弧菌噬菌體，獲得12株噬菌體。通過雙層平板法測效價發(fā)現(xiàn)CHY5-M1M效價最高，為8.65×1013PFU·mL-1（表1）。

表1 噬菌體名稱及其效價Table 1 Phage names and their potencies

由于噬菌體CHY5-M1M具有最高效價、較好的生存活力、易于快速培養(yǎng)且在有污染的水體中存在較多，所以整體實驗以該噬菌體為主要對象開展后續(xù)生物學特性分析。

通過點滴法分離出以副溶血弧菌為宿主菌的噬菌體CHY5-M1M，雙層平板法純化的噬菌斑大小均勻一致、圓形、邊緣有暈環(huán)（圖1）。

圖1 雙層平板法純化噬菌體Fig.1 Purification of phage by double layer plate method

2.2 噬菌體CHY5-M1M的最佳感染復(fù)數(shù)

雙層平板法分析可知（表2），CHY5-M1M的最佳感染復(fù)數(shù)為1∶1 000，此時最佳感染效價為1.05×1022PFU·mL-1，這表明該噬菌體可在副溶血弧菌中實現(xiàn)復(fù)制和擴增，感染能力強。

表2 噬菌體CHY5-M1M最佳感染復(fù)數(shù)Table 2 Optimal infection complexes of phage CHY5-M1M

2.3 噬菌體CHY5-M1M的一步生長曲線

由圖2可知，CHY5-M1M感染宿主菌20 min內(nèi)，噬菌體數(shù)量穩(wěn)定，而噬菌體裂解期是40～140 min之間，之后進入平穩(wěn)期，噬菌體數(shù)量重新保持穩(wěn)定。由此得出，該噬菌體潛伏期20 min，并根據(jù)裂解量標明得到CHY5-M1M噬菌體裂解量為1.98×107PFU·cell-1，對 副 溶 血 弧 菌 裂 解 性較強。

圖2 噬菌體CHY5-M1M一步生長曲線Fig.2 One-step growth curve of phage CHY5-M1M

2.4 噬菌體CHY5-M1M的熱穩(wěn)定性

由圖3看出，噬菌體在40℃時與未處理時的活性最接近；30℃和50℃時，噬菌體效價有所下降；在50℃之后，噬菌體存活率大大降低，60℃、70℃噬菌體基本失活，之后檢測不到噬菌體存在。由此可見，該噬菌體對40℃的溫度具有較好的穩(wěn)定性，同時它的感染能力很容易在不適條件下失活，熱穩(wěn)定性較差。

圖3 噬菌體CHY5-M1M的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of phage CHY5-M1M

2.5 噬菌體CHY5-M1M的pH穩(wěn)定性

噬菌體CHY5-M1M在pH 5～10范圍內(nèi)的效價保持在108PFU·mL-1左右，具有穩(wěn)定性和良好的裂解活性。高于或低于最適pH范圍都會引起噬菌體活力的改變，當pH≤3或者≥12時，基本檢測不到噬菌體的存在（圖4）。由此可以看出，噬菌體CHY5-M1M存活率有較寬的pH范圍。

圖4 噬菌體CHY5-M1M的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of phage CHY5-M1M

2.6 噬菌體CHY5-M1M的紫外線穩(wěn)定性

有圖5可知，在距紫外燈光源35 cm處連續(xù)照射30 min時，噬菌體CHY5-M1M效價明顯下降；而連續(xù)照射40 min后，噬菌體CHY5-M1M效價下降約5個數(shù)量級。這一結(jié)果表明，噬菌體CHY5-M1M對紫外照射耐受性差。

圖5 噬菌體CHY5-M1M的紫外穩(wěn)定性Fig.5 UV stability of phage CHY5-M1M

2.7 噬菌體CHY5-M1M的全基因組分析

采用R circlize包進行基因組圈圖的繪制（圖6）。噬菌體CHY5-M1M全基因組長43 193 bp，其中A、C、G、T堿基含量分別為21.27%、20.71%、28.56%、29.46%，其中G+C含量為49.37%。全基因組中未發(fā)現(xiàn)毒力因子基因和抗生素耐藥基因。

圖6 噬菌體CHY5-M1M的基因組圈Fig.6 Genome circle of phage CHY5-M1M

用NCBI網(wǎng)站BLASTn程序進行噬菌體CHY5-M1M基因序列比對，在所有得到的同源序列中，噬菌體CHY5-M1M與弧菌噬菌體vB_VpaP_KF1（NC_048035.1）和弧菌噬菌體vB_VpaP_KF2（NC_048036.1）的一致性分別為98%和97%，且兩者在分類上均屬于斑疹病毒。

根據(jù)噬菌體全基因組，使用BLASTp對蛋白質(zhì)序列進行分析，發(fā)現(xiàn)有44個開放閱讀框（open reading frames，ORFs），44個ORF中起始密碼均為ATG。這些序列主要為結(jié)構(gòu)蛋白基因、核酸代謝和一些未知蛋白。其中ORF5（主要衣殼蛋白）、ORF6（支架蛋白）以及ORF7（頭尾連接蛋白）在組成噬菌體過程中起重要作用。此外，ORF10（RNA聚合酶）、ORF13和ORF15（編碼外切酶）、ORF23（DNA聚合酶）、ORF25（DNA解旋酶）、ORF26（引發(fā)酶）、ORF39和ORF40（編碼成熟酶）參與噬菌體DNA復(fù)制和調(diào)控相關(guān)基因過程。

3 討論

本實驗采集的噬菌體主要來自水產(chǎn)品批發(fā)市場下水道污水，其中下水道污水是細菌繁殖的聚集地，更易產(chǎn)生噬菌體［15］。然而在養(yǎng)殖水體中未發(fā)現(xiàn)噬菌體，可能的原因是養(yǎng)殖過程中藥物使用以及監(jiān)管力度加強［16］。通過雙層平板法得到的烈性噬菌體命名為CHY5-M1M，證明了分離純化方法的適用性。

噬菌體CHY5-M1M的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和紫外線穩(wěn)定性等生物學特性與已報道的副溶血弧菌噬菌體相近，說明該噬菌體具有有效性。噬菌體CHY5-M1M耐高溫能力強，60℃處理30 min后存活率仍然達到75.8%。邱德全等［17］采用60℃處理分離的噬菌體20 min，僅有64.9%的存活率。噬菌體CHY5-M1M在pH 12時存活率僅10%，而丁云娟等［18］分離的副溶血弧菌噬菌體測定結(jié)果顯示pH為12時仍有75.3%存活率。這說明噬菌體CHY-M1M耐堿性較差。

基因組分析是噬菌體分類的重要依據(jù)，本實驗利用Illumina novaseq 6000測序平臺對噬菌體CHY5-M1M進行了全基因組測序，利用BLASTp進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該噬菌體中有10個ORFs找到了相似序列，表明該噬菌體仍有待進一步深入研究［19］。已報道的噬菌體基因組以大于5 kb為主，如吳春光等［20］測得的噬菌體基因組為83 428 bp。噬菌體CHY5-M1M基因組小于5 kb，在侵染宿主菌時會更加迅速。本研究發(fā)現(xiàn)噬菌體CHY5-M1M與NCBI數(shù)據(jù)庫中的弧菌噬菌體vB_VpaP_KF1和弧菌噬菌體vB_VpaP_KF2一致性最高，為97.5%。此外，基因組功能預(yù)測顯示噬菌體CHY5-M1M不含毒力因子和抗性因子，說明該噬菌體安全性高。

本研究為開發(fā)治療副溶血弧菌的噬菌體藥劑提供了理論基礎(chǔ)和噬菌體儲備。但噬菌體的抗菌性、安全性以及CRISPR/Cas的細菌防御系統(tǒng)仍是巨大挑戰(zhàn)［21］，這需要研究者和管理者共同努力［22-23］，研發(fā)更加有效的治療方法［24-25］，評估消費者對噬菌體治療的認識和接受程度并制定相應(yīng)的法律法規(guī)。