孫夢婷，趙鵬翔，儀楊，王濛，謝飛，ADZAVON Yao Mawulikplimi，劉夢昱

北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124

在成人腦腫瘤中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常見且惡性程度最高的腫瘤。根據(jù)GBM獨(dú)特的組織學(xué)特征，即腫瘤壞死區(qū)及內(nèi)皮細(xì)胞增殖程度，世界衛(wèi)生組織將其歸類為最高級別Ⅳ級腦腫瘤（Lah，Novak and Breznik）［1］。確診后，GBM患者的生存期一般只有15個(gè)月左右［2］。GBM分為原發(fā)性GBM和繼發(fā)性GBM，兩類GBM具有不同的分子發(fā)生機(jī)制。在老年患者中，GBM主要為原發(fā)性腫瘤，該類患者未曾患有惡性程度較輕的腦腫瘤。繼發(fā)性GBM來源于低等級腦膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)［3］。GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療手段為最大程度安全地進(jìn)行手術(shù)切除聯(lián)合放化療治療［4］。替莫唑胺作為小分子藥物能夠穿過血腦屏障，一直作為一線用藥應(yīng)用于GBM的臨床治療中，近年來隨著抗腫瘤藥物的研究發(fā)展，貝伐珠單抗、洛莫司丁以及腫瘤電場治療也可作為輔助治療手段參與到GBM的治療中［5-7］。然而，盡管膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療方法在不斷進(jìn)步，患者五年生存率仍低于10%［8］，因此新的治療方法以及抗腫瘤藥物亟待研發(fā)。

二甲雙胍（metformin hydrochloride，MET）是治療2型糖尿病的一線雙胍類藥物［9］。二甲雙胍在不同疾病中顯示出了多效性，提示其不依賴于控制血糖而對多種組織器官產(chǎn)生作用。二甲雙胍的親水及親脂性使其可以高度溶解于無機(jī)液相介質(zhì)中，且易與膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)合，使得二甲雙胍可輕易穿過血腦屏障［10］。Labuzek等［11］研究發(fā)現(xiàn)全身炎癥Wistar大鼠模型口服二甲雙胍后，藥物可透過血腦屏障，在腦不同部位的血藥濃度均在μmol范圍內(nèi)。針對多種疾病的多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍經(jīng)注射給藥后血藥濃度均在40μmol·L-1內(nèi)，符合藥理學(xué)血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)，為二甲雙胍抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究表明二甲雙胍的抗腫瘤作用機(jī)制包括AMPK依賴或AMPK非依賴方式［12］。二甲雙胍能夠通過激活細(xì)胞AMPK抑制下游mTOR信號通路而具有潛在的抗腫瘤作用。而AMPK非依賴在體內(nèi)的作用包括降低胰島素、抑制炎癥信號以及增強(qiáng)脂聯(lián)素等，這些變化在腫瘤的生成過程中均具有重要的調(diào)控作用［13-14］。近年來多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，二甲雙胍在多類良性或惡性腫瘤中發(fā)揮了抑制作用，在結(jié)腸癌、乳腺癌以及前列腺癌的治療效果中得到了證實(shí)［14-16］。因此，本研究選擇多種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系作為研究對象，探討二甲雙胍在體外是否對不同膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有抑制作用，以期為進(jìn)一步開展二甲雙胍治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞小鼠源膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（GL261）購自北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫；大鼠源膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（C6）購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺（北京總部）；人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（U87MG）來源于北京陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院。

1.1.2 試劑二甲雙胍鹽酸鹽（美國Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；CCK-8試劑盒、CCK-L試劑盒（日本Dojiodo公司）；NucGreen Dead488ReadyProbes（美國Thermo Fisher公司）；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；p-Akt、Akt抗體（美國CST公司）；β-actin抗體（美國Proteintech公司）；熒光二抗（鼠抗、兔抗）（美國KPL公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；光學(xué)（熒光）倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；低速離心機(jī)（江蘇瑞江分析儀器有限公司）；高速離心機(jī)（美國EPPENDORF公司）；六合一酶標(biāo)儀、核酸電泳儀（美國BIO-RAD公司）；Odyssay凝膠成像儀（美國LI-COR公司）；細(xì)胞實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)（美國BioTex公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)含10% FBS和1%鏈青霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)基，每3天傳代1次，傳代比例為1∶3。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按3×103個(gè)·孔-1接種于96孔板內(nèi)，貼壁24 h。顯微鏡下觀察到細(xì)胞貼壁并且生長良好時(shí)，加入完全培養(yǎng)基（0 mmol·L-1）和含不同濃度二甲雙胍（2、4、6、8、10 mmol·L-1）的完全培養(yǎng)基，作用時(shí)間分別為24、48、72 h。每孔按照體系體積的10%加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，在波長450 nm處檢測吸光度，按照公式（1）計(jì)算細(xì)胞相對增殖活性（細(xì)胞存活率）。

式中，As：實(shí)驗(yàn)孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測物質(zhì)）吸光度值；Ac：對照孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、無待測物質(zhì)）吸光度值；Ab：空白孔（不含細(xì)胞和待測物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8）吸光度值。

1.2.3 活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種密度及實(shí)驗(yàn)分組同1.2.2，同時(shí)將75%乙醇處理細(xì)胞5 min設(shè)置陽性對照組。GL261、C6按照以下分組：對照組（CTRL組）、實(shí)驗(yàn)組（MET組，6 mmol·L-1）。U87MG按照以下分組：對照組（CTRL組）、實(shí)驗(yàn)組（MET組，8 mmol·L-1）。NucGreen Dead 488 ReadyProbes染料和培養(yǎng)基比例為1∶400。按照實(shí)驗(yàn)分組加入培養(yǎng)基及染料，避光放入活細(xì)胞成像系統(tǒng)監(jiān)測48 h，觀察凋亡情況。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按照GL261（100個(gè)·孔-1）、C6（200個(gè)·孔-1）、U87MG（200個(gè)·孔-1）的細(xì)胞密度接種于24孔板。GL261、C6按照以下分組：對照組（CTRL組）、實(shí)驗(yàn)組（MET組，6 mmo·lL-1）、實(shí)驗(yàn)組（MET組，8 mmol·L-1）；U87MG按照以下分組：對照組（CTRL組）、實(shí)驗(yàn)組（MET組，8 mmol·L-1）、實(shí)驗(yàn)組（MET組，10 mmol·L-1）。連續(xù)培養(yǎng)7 d，隔天更換培養(yǎng)基，單個(gè)細(xì)胞克隆達(dá)到50個(gè)左右，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，拍照。4倍顯微鏡觀察細(xì)胞團(tuán)狀態(tài)，并按照公式（2）計(jì)算克隆形成率。

1.2.5 活細(xì)胞ATP檢測細(xì)胞接種密度同1.2.2，分組同1.2.3，作用時(shí)間為48 h。每孔加入100μL CCK-L工作液，25℃避光孵育10 min，酶標(biāo)儀全波長檢測相對光強(qiáng)度（relative light unit，RLU）。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)分組同1.2.3，二甲雙胍處理12、24、48 h后收集細(xì)胞。參照試劑盒操作說明提取細(xì)胞全蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測蛋白濃度，上樣量為40μg，SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。5% BSA或5%脫脂牛奶室溫封閉。一抗p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、β-actin（1∶8 000）孵育。熒光二抗（1∶10 000）孵育，LI-COR成像系統(tǒng)直接掃描，Odyssey軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究均采用GraphPad Prism 9.0.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)（t-test）、單因素方差分析（one-way ANOVA）或雙因素方差分析（two-way ANOVA），組間比較P＜0.05、P＜0.001、P＜0.000 1表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 二甲雙胍對GBM細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 二甲雙胍對不同GBM細(xì)胞增殖活性的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示：與對照組（0 mmol·L-1）相 比，二 甲 雙 胍 在 較 低濃 度2～4 mmol·L-1時(shí)，對各組GBM細(xì)胞的活性無明顯抑制作用，在較高濃度時(shí)（≥6 mmol·L-1）對各組GBM細(xì)胞增殖水平均產(chǎn)生了明顯的抑制作用。CCK-8結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同GBM細(xì)胞對二甲雙胍的藥物敏感性不同，二甲雙胍藥物作用時(shí)間不同也對GBM細(xì)胞活性產(chǎn)生了不同的影響。如圖1所示，與GL261、C6相比，U87MG具有較高的耐藥性，二甲雙胍濃度達(dá)到8 mmol·L-1且作用時(shí)間48 h后，U87MG細(xì)胞相對活性為54.268%±4.442%。對于C6細(xì)胞，隨著藥物濃度增加及作用時(shí)間增加對細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)。GL261增殖能力較強(qiáng)，二甲雙胍作用時(shí)間達(dá)到72 h，藥物對細(xì)胞的抑制能力顯著降低，藥物作用48 h對GL261細(xì)胞U87MG細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用。綜上，二甲雙胍作用48 h對各組GBM細(xì)胞均產(chǎn)生了抑制作用，各組細(xì)胞半數(shù)抑制率藥物濃度（IC50）及作用 時(shí) 間 為：U87MG，8 mmol·L-1作 用 時(shí) 間48 h（54.268%±4.442%）；C6，6 mmol·L-1作用時(shí)間48 h（53.388%±1.521%）；GL261，4 mmol·L-1作用時(shí)間48 h（58.9175%±9.670%）。

圖1 二甲雙胍對GBM細(xì)胞的增殖活性的影響Fig.1 Effect of MET on proliferation activity of GBM cells

2.1.2 二甲雙胍對GBM細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響10倍顯微鏡下觀察GBM細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖2所示：與對照組相比，MET組視野中GL261、C6和U87MG細(xì)胞變圓、皺縮細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞密度降低。這與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對應(yīng)，證明二甲雙胍明顯抑制各GBM細(xì)胞的增殖和生長。

圖2 二甲雙胍對GBM細(xì)胞形態(tài)的影響(×10)Fig.2 Effect of MET on GBM cell morphology

2.2 二甲雙胍對GBM細(xì)胞凋亡水平的影響

NucGreen Dead 488 ReadyProbes染料可與凋亡細(xì)胞的核DNA結(jié)合，發(fā)出綠色熒光，對生長狀態(tài)正常的細(xì)胞無影響。10倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖3），MET可在24 h內(nèi)有效促進(jìn)U87MG細(xì)胞凋亡，而對GL261和C6細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用無明顯變化；48 h內(nèi)可有效促進(jìn)3種GBM細(xì)胞大量凋亡，明場中3種GBM細(xì)胞的數(shù)量無明顯變化，說明二甲雙胍能夠顯著抑制GBM細(xì)胞增殖。由于不同GBM細(xì)胞自身代謝水平及增殖水平的差別，MET對不同GBM細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用的時(shí)間不同，促進(jìn)GBM凋亡的具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖3 二甲雙胍對GBM細(xì)胞凋亡水平的影響Fig.3 Effect of MET on apoptosis of GBM cells

2.3 二甲雙胍對GBM細(xì)胞克隆形成的影響

二甲雙胍分別處理GL261、C6和U87MG細(xì)胞7 d后，如圖4所示，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二甲雙胍處理后的GBM細(xì)胞形成克隆數(shù)與對照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），MET組細(xì)胞克隆能力明顯低于對照組，且隨著作用濃度增加，二甲雙胍對GBM細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，形成的克隆細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞數(shù)目也顯著減少。4倍顯微鏡下觀察克隆細(xì)胞團(tuán)形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MET組中GBM形成細(xì)胞團(tuán)的能力明顯降低，克隆細(xì)胞團(tuán)中細(xì)胞間空隙明顯增大（圖5）。綜上，證明二甲雙胍能夠有效抑制GBM細(xì)胞的克隆形成能力，并具有一定的劑量依賴性。

圖4 二甲雙胍對GBM細(xì)胞克隆形成的影響Fig.4 Effects of MET on the formation of GBM cell clonies

圖5 二甲雙胍對GBM克隆細(xì)胞團(tuán)形態(tài)的影響Fig.5 Effect of MET on cell cluster morphology of GBM clonies

2.4 二甲雙胍對GBM細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響

研究表明二甲雙胍能夠通過抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ對細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，本研究通過化學(xué)發(fā)光法（CCK-L）對GBM細(xì)胞的活細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生的ATP水平進(jìn)行檢測。與對照組相比，MET組的相對光強(qiáng)度（RLU）明顯降低（圖6）。ATP作為細(xì)胞的能量貨幣，直接為細(xì)胞代謝提供能源，結(jié)果證明二甲雙胍能夠顯著抑制各GBM細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生ATP，從能量來源處抑制了細(xì)胞增殖及生長。

圖6 二甲雙胍對GBM細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響Fig.6 Effect of MET on intracellular ATP level in GBM cells

2.5 二甲雙胍對GBM細(xì)胞Akt及磷酸化水平的影響

檢測不同時(shí)間點(diǎn)下二甲雙胍作用對GBM細(xì)胞中p-Akt、Akt表達(dá)的影響，如圖7所示：與各自時(shí)間點(diǎn)的對照組相比，隨著二甲雙胍作用時(shí)間延長，3種GBM細(xì)胞內(nèi)p-Akt表達(dá)在12 h并未出現(xiàn)顯著差異，在24 h出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.000 1）；48 h僅C6細(xì)胞內(nèi)p-Akt表達(dá)下調(diào)明顯（P＜0.05），其余細(xì)胞Akt表達(dá)水平在12～48 h內(nèi)并未出現(xiàn)顯著差異，證明二甲雙胍通過抑制Akt磷酸化進(jìn)而抑制GBM細(xì)胞內(nèi)Akt活化，對p-Akt表達(dá)具有短效性作用，且無時(shí)間依賴性。

圖7 二甲雙胍對Akt及其磷酸化水平的影響Fig.7 Effect of MET on Akt and its phosphorylation level

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可能具有新的作用，不僅能夠因其具有降糖作用而成為2型糖尿病的一線用藥，同時(shí)在臨床應(yīng)用上還發(fā)現(xiàn)其對腫瘤有抑制作用。其作用效果在多種腫瘤中得到驗(yàn)證，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌以及腦膠質(zhì)瘤［17］。而GBM作為惡性程度最高的腦膠質(zhì)瘤，患者可選擇的治療方案十分有限，且效果甚微。研究表明，放療和化療或可提高標(biāo)準(zhǔn)治療效果，大量臨床病例也顯示聯(lián)合放化療治療方法會抑制腫瘤生長和限制復(fù)發(fā)，從而使挽救病人生命成為可能，然而治療后GBM患者的5年生存率仍難以提高［18］。在抗腦膠質(zhì)瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，二甲雙胍常與其他藥物，例如替莫唑胺、二氯乙酸（DCA）等聯(lián)合作用于U251、T98等膠質(zhì)瘤細(xì)胞系或C57BL/6小鼠GL261移植瘤模型進(jìn)行研究［19-21］。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)中的結(jié)果一致，證明了二甲雙胍可有效地抑制不同GBM細(xì)胞的增殖能力，且有一定濃度依賴性。本研究中CCK-8結(jié)果確定了不同GBM細(xì)胞適合的藥物作用濃度。實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測GBM細(xì)胞的動態(tài)生長狀況進(jìn)一步驗(yàn)證了二甲雙胍作用后促進(jìn)GBM細(xì)胞凋亡的有效作用時(shí)間，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了最重要的理論基礎(chǔ)。已有研究結(jié)果表明，在不同GBM細(xì)胞中二甲雙胍作用濃度不同，提示種屬、組織與惡性程度不同的GBM細(xì)胞的增殖及代謝水平不同，使得二甲雙胍抑制腫瘤細(xì)胞的有效濃度不同。本研究僅在體外探究了二甲雙胍單獨(dú)作用于GBM細(xì)胞的作用效果，未結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，且二甲雙胍作用機(jī)制十分復(fù)雜，許多二甲雙胍抗膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究僅局限于多藥聯(lián)合作用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，將二甲雙胍單獨(dú)應(yīng)用于體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究較少。因此，后續(xù)將對二甲雙胍單獨(dú)作用動物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，并進(jìn)一步驗(yàn)證二甲雙胍在臨床研究中的抗腫瘤效應(yīng)。

盡管研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的代謝產(chǎn)生影響，但其真正的作用機(jī)制尚待研究［22-23］。已有研究表明二甲雙胍作用后涉及多種信號通路，包括AMPK、mTOR、REDD1以及細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸鏈及氧化應(yīng)激的調(diào)控［24-27］。本研究首先對GBM細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生的ATP水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍作用后，不同GBM細(xì)胞內(nèi)ATP水平均顯著降低，證明了二甲雙胍對腫瘤細(xì)胞代謝功能的抑制作用。Akt是腫瘤細(xì)胞信號通路中重要的調(diào)控因子，該因子通過自身磷酸化和去磷酸化調(diào)控下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響細(xì)胞能量代謝水平，并與體內(nèi)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡過程等相關(guān)。本研究結(jié)果證明二甲雙胍作用后，多種GBM細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平顯著降低。

綜上所述，二甲雙胍可抑制多種GBM細(xì)胞的增殖，降低Akt磷酸化水平，其機(jī)制或與細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低密切相關(guān)，本研究結(jié)果為二甲雙胍用于GBM的防治及GBM患者治療提供了新的思路與途徑。