范蓓，王園園，趙云霞，江魁，王斌

1.華蘭生物工程股份有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453000；

2.河南晟明生物技術(shù)研究院有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453600；

3.華蘭基因工程有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453600

腫瘤免疫療法的出現(xiàn)代表腫瘤治療手段的革命性進步，也成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點。雖然免疫療法在不同適應癥中表現(xiàn)出可觀的長期生存率，但只在一小部分患者和腫瘤類型中獲得成功，仍然無法使很多患者從中受益［1］，因此，亟需臨床前動物模型來推動能夠延長或改變患者臨床反應的新免疫療法或免疫組合療法的開發(fā)，提高臨床試驗的成功率。目前，用于評價免疫療法的小鼠模型有同源小鼠模型、化學誘導小鼠模型、基因編輯人源化小鼠模型和免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型，其中前三種模型應用比較廣泛，它們依賴于小鼠免疫系統(tǒng)，但小鼠的免疫反應并不能完整復制人的免疫反應［2］。免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型是將人的免疫細胞移植到重度免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，構(gòu)建出具有功能性人免疫系統(tǒng)的小鼠模型，更接近于人體免疫系統(tǒng)，能夠更好地模擬藥物進入人體后免疫系統(tǒng)的反應，因此越來越受到科研工作者的關(guān)注和青睞。雖然免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型構(gòu)建技術(shù)已非常成熟，但是人源化免疫系統(tǒng)重建的影響因素很多，不同單位和機構(gòu)的水平參差不齊，對模型構(gòu)建成功率及應用轉(zhuǎn)化方面的影響也不同。本研究從構(gòu)建方法、免疫缺陷小鼠品系、性別及飼養(yǎng)、免疫細胞的供體、數(shù)量和細胞狀態(tài)等方面對免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型構(gòu)建進行了技術(shù)探討，以期為腫瘤免疫療法提供更有利的藥物研發(fā)工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物31只6～8周齡重度免疫缺陷雌性小鼠NCG（NOD CRISPR Prkdc Il2r gamma），品系名稱為NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52 Il2rgem26Cd22/Gpt，SPF級，購于江蘇集萃藥康科技股份有限公司，小鼠在華蘭基因工程有限公司動物中心屏障動物實驗設施進行飼養(yǎng)。與本研究相關(guān)的動物實驗獲得了華蘭集團實驗動物管理委員會批準（申請受理編號：ER-HLGE-RD-2021005-02，ER

HLGE-RD-2021005-03，ER-HLGE-RD-2021005-09），整個動物實驗過程遵循實驗動物倫理福利3R原則，實驗動物管理和使用符合法規(guī)要求。

1.1.2 細胞Human normal PB-MNC（HuPB-MNC）購于上海澳能生物技術(shù)有限公司，包括四種供體：供體1（批號：LP200730，Donor ID：Z006）、供體2（批號：LP200907A，Donor ID：Y1292）、供體3（批號：PCH20210200017，Donor ID：Z0115）、供體4（批號：PCH20210400013，Donor ID：Z0144），液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑1×FBS和1×PBS（pH 7.4）均購自美國Gibco公司；RPMI-1640購自ATCC；DNaseⅠ購自美國Worthington公司；鹽酸購自洛陽昊華化學試劑有限公司；無水乙醇購自天津市科密歐化學試劑有限公司；肝素鈉、BSA購自北京索萊寶科技有限公司；0.9%氯化鈉注射液購自河南科倫藥業(yè)有限公司；1×RBC裂解緩沖液購自美國eBioscience公司；FITC anti-human CD45抗體、PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45抗體購自美國BioLegend公司。

1.1.4 主要儀器小鼠飼養(yǎng)IVC系統(tǒng)（蘇州馮氏，ZJ-5）；層流傳遞窗（中科圣杰）；生物安全柜（蘇凈泰安，BSC-1604ⅡA2）；紫外線消毒車（申光儀器，豪華型）；電子天平（河南宏程，T500）；二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申，HF90）；電熱恒溫水箱（上海錫為科學，HWS-28）；生物安全柜（蘇州安泰，BSC-1304ⅡB2）；脈動真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械，XG1.DTF-1.5）；高精密度電子天平（賽多利斯科學儀器，GL224l-1SCN）；渦旋混勻器（精騏，HYQ-3110）；離心機（Dragon，D3024R）；流式細胞儀（BD，C6）。

1.2 實驗方法

1.2.1 重度免疫缺陷小鼠NCG的飼養(yǎng)與檢疫小鼠飼養(yǎng)于IVC系統(tǒng)中，環(huán)境條件控制在20～26℃，相對濕度40%～70%，小鼠照度15～20 lx，工作照度200 lx以上，光照12 h明暗交替，噪音低于60 dB；與小鼠有關(guān)的所有操作，如更換籠具墊料、加水加料、實驗操作等均在生物安全柜中進行；給予合格的小鼠生長繁殖飼料，自由攝食；經(jīng)高壓滅菌的玉米芯材質(zhì)作為實驗專用墊料，應保證無異味、無結(jié)塊、無霉變、無蟲蛀、無異物污染等；飲用水采用酸化水（用HCl調(diào)節(jié)pH至2.5～3.0），經(jīng)高壓滅菌后使用飲水瓶供應，自由攝水；所有動物購入后，由獸醫(yī)負責檢疫，動物檢疫期1～3 d，檢疫期最后期限由獸醫(yī)決定。

1.2.2 HuPB-MNC細胞復蘇從液氮中取出供體1、供體2、供體3和供體4 HuPB-MNC細胞，快速將其置入37℃水浴中解凍，直到管中只剩下最后一片結(jié)晶；在生物安全柜中，用75%乙醇擦拭細胞凍存管外壁；打開細胞凍存管，用1 mL移液槍輕輕混勻細胞后，將細胞移至含有300μg DNaseⅠ的50 mL無菌離心管中，用1 mL完全培養(yǎng)液沖洗凍存管，并將其轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，邊滴加邊搖勻；之后逐滴加入18 mL 37℃預熱的完全培養(yǎng)基（含10%FBS的RPMI-1640），邊滴加邊搖勻；細胞懸液室溫條件下200 r·min-1離心15 min；去除上清后加適量體積1×PBS，輕輕混勻細胞，取少量細胞懸液計數(shù)，確定復蘇后細胞活率及細胞數(shù)；用PBS調(diào)整到需要的細胞濃度，備用。

1.2.3 免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的建立選取檢疫合格的6～8周齡NCG重度免疫缺陷雌性小鼠，適應性飼養(yǎng)1周左右；注射前將復蘇后的HuPB-MNC細胞置于冰上保存；分別取1.0E+6 cells和1.0E+7 cells的HuPB-MNC細胞，使用1 mL無菌注射器吸取200μL HuPB-MNC細胞懸液，以尾靜脈注射方式注射NCG小鼠；對照組NCG小鼠不作任何處理；每周觀察小鼠2次，并記錄小鼠體重及死亡情況；實驗第7、14、21、28和35天眼眶靜脈叢試血，流式檢測小鼠外周血中huCD45+T細胞和mCD45+T細胞，huCD45%計算方法如公式（1）。

1.2.4 流式細胞術(shù)監(jiān)測NCG小鼠外周血中人CD45+T細胞的重建水平采用流式細胞術(shù)監(jiān)測小鼠外周血中人CD45+T細胞的重建水平，具體操作如下：①采血：小鼠眼眶靜脈叢試血，加入1%肝素鈉生理鹽水溶液抗凝（4μL抗凝劑：200μL血），混勻后室溫放置，1 h內(nèi)染色。②抗體Mix配制：以一個樣品為例，取1.25μL FITC anti-human CD45抗 體 和0.3125μL PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45抗體，加入3.4375μL 1%BSA-PBS染色緩沖液渦旋混勻，4℃避光待用。③熒光標記：50μL抗凝血，每管加入5μL FITC anti-human CD45和PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45抗體Mix，充分混勻，4℃避光孵育20 min。另設置不加抗體處理作為陰性對照。④裂紅：加入紅細胞裂解液（全血：紅細胞裂解液體積比為1∶10），輕搖混勻，室溫反應5 min，加入1×PBS終止裂紅反應（PBS：紅細胞裂解液體積比為2∶1），500 r·min-1離心5 min，棄上清（觀察裂紅效果，是否需要重復1次）。⑤洗滌：加入1 mL 1×PBS，500 r·min-1離心5 min，棄上清。⑥檢測：細胞沉淀加入300μL 1×PBS，300目尼龍網(wǎng)過濾后上機檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計學分析實驗采集的原始數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 7.0軟件進行分析；流式細胞儀檢測數(shù)據(jù)采用BD AccuriTMC6軟件進行分析，流式監(jiān)測結(jié)果圖采用FlowJo V10軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫細胞移植數(shù)量的選擇

分別取1.0E+6 cells和1.0E+7 cells的供體1 HuPB-MNC細胞以尾靜脈注射方式移植入NCG小鼠體內(nèi)，實驗第7、14、21、28和35 d眼眶靜脈叢試血，流式檢測小鼠外周血中huCD45+T細胞和mCD45+T細胞，計算huCD45%。結(jié)果顯示（圖1），HuPB-MNC細胞移植數(shù)量為1.0E+7 cells時重建效果較好。

圖1 不同免疫細胞移植數(shù)量對免疫重建效果的影響Fig.1 Effect of different number of transplanted immune cells on immune reconstitution

2.2 免疫細胞供體的選擇

2.2.1 免疫細胞不同供體重建后體重及生存率的變化分別取1.0E+7 cells數(shù)量的供體2、供體3和供體4 HuPB-MNC細胞以尾靜脈注射方式移植入NCG小鼠體內(nèi)，對照組小鼠不作任何處理。免疫細胞移植后NCG小鼠體重變化結(jié)果顯示（圖2），與對照組相比，供體2組和供體4組在HuPBMNC細胞移植21 d后體重開始下降，供體3組在HuPB-MNC細胞移植0 d后體重未見明顯增長，平均體重始終低于對照組。NCG小鼠生存率變化結(jié)果顯示（圖3），供體3組在HuPB-MNC細胞移植35 d時的生存率下降至80%，供體2組和供體4組在HuPB-MNC細胞移植35 d時生存率均為100%。由以上結(jié)果可知，供體2組和供體4組在HuPBMNC細胞移植21 d后開始出現(xiàn)GVHD移植物抗宿主反應，供體3組在HuPB-MNC細胞移植0 d后即表現(xiàn)出GVHD移植物抗宿主反應。以上結(jié)果表明，生存率在NCG小鼠不同供體的重建速度和水平存在明顯差異。

圖2 免疫細胞不同供體重建后體重的變化Fig.2 Effect of different donors of transplanted immune cells on body weight

圖3 免疫細胞不同供體重建后生存率的變化Fig.3 Effect of different donors of transplanted immune cells on survival rate

2.2.2 免疫細胞不同供體重建后NCG小鼠外周血中人CD45+T細胞的重建水平的變化分別取1.0E+6 cells數(shù)量的供體2、供體3和供體4 HuPBMNC細胞以尾靜脈注射方式移植入NCG小鼠體內(nèi)，實驗第7、14、21、28和35天眼眶靜脈叢試血，流式檢測小鼠外周血中huCD45+T細胞和mCD45+T細胞，計算huCD45%。NCG小鼠外周血中人CD45+T細胞的重建水平的變化結(jié)果顯示（圖4），供體3組和供體4組在HuPB-MNC細胞移植21 d時NCG小鼠外周血中人CD45+T細胞的重建水平大于25%，供體2組在HuPB-MNC細胞移植28 d時NCG小鼠外周血中人CD45+T細胞的重建水平大于25%，標志著免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型建立成功。每周采集NCG小鼠外周血進行流式動態(tài)監(jiān)測結(jié)果顯示（圖5），NCG小鼠外周血中人CD45+T細胞重建水平隨時間推移逐步上升，在重建35 d時供體2組、供體3組和供體4組huCD45%平 均 值 分 別 達34.77%、26.24%和56.10%。

圖4 NCG小鼠外周血中人CD45+T細胞的重建水平的變化Fig.4 Effect of different donors of transplanted immune cells on reconstruction level of NCG mice peripheral blood

圖5 每周采集NCG小鼠外周血進行流式動態(tài)監(jiān)測Fig.5 The results of weekly flow dynamic monitoring of NCG mice peripheral blood

3 討論

在腫瘤免疫治療藥物的研發(fā)中，藥物篩選及藥效研究需要大量的模型動物，而重度免疫缺陷小鼠的價格較貴，通過提高模型構(gòu)建成功率及應用轉(zhuǎn)化率可以大大節(jié)約成本。但是影響免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型構(gòu)建成功的因素很多，如構(gòu)建方法、免疫缺陷小鼠品系、性別及飼養(yǎng)、免疫細胞的供體、數(shù)量和細胞狀態(tài)等，本研究通過實驗，總結(jié)出一些經(jīng)驗，現(xiàn)從以下幾個方面進行討論。

3.1 免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型構(gòu)建方法的選擇

目前用于人源化免疫系統(tǒng)重建的免疫細胞主要有人CD34+造血干細胞（Hu-CD34+HSC）和人外周單個核細胞（Hu-PBMC），根據(jù)免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型免疫細胞來源和構(gòu)建方法的不同，可以分為Hu-CD34+模型、Hu-BLT模型和Hu-PBL模型［3］。

Hu-CD34+模型是將來源于人外周血、骨髓、胎兒肝臟和臍帶血等CD34+造血干細胞注射入經(jīng)輻照處理的新生和成年免疫缺陷小鼠，以實現(xiàn)T細胞、B細胞、髓系及NK細胞的發(fā)育。該模型的免疫細胞和造血系統(tǒng)是由小鼠體內(nèi)發(fā)育而來，對其宿主具有免疫耐受性，通常不會發(fā)生GVHD反應，實驗窗口期最長可達45周［4］，適用于長期研究。但是該模型重建周期較長，通常需要8～12周，且T細胞數(shù)量較少、活性較低、髓系細胞發(fā)育受限［5-6］。

Hu-BLT模型是將胎兒肝臟和胸腺組織移植入經(jīng)輻照處理的成年免疫缺陷小鼠腎包膜下，再將來源于同一個體胎兒肝臟或骨髓的造血干細胞靜脈注射入該小鼠體內(nèi)，該模型提供了人的胸腺微環(huán)境，使得人T細胞的發(fā)育和對人MHC分子成為可能［3］。Hu-BLT小鼠具有完整的免疫系統(tǒng)并且能產(chǎn)生人源性的適應性免疫應答，是模擬人免疫系統(tǒng)最完善的小鼠模型，但是存在胎兒肝臟和胸腺來源受限、構(gòu)建難度極大、可誘發(fā)GVHD反應等缺點，使其研究和應用受到極大的限制［2，5］。

Hu-PBL模型通過將人PBMCs以靜脈或腹腔注射的方式移植入成年免疫缺陷小鼠，以實現(xiàn)外周血和脾臟中人CD45+T細胞的植入和增殖。PBMC移植后人T細胞增殖速度快，重建水平高且穩(wěn)定，通常2～3周時檢測外周血中人CD45+T細胞可超過25%，該模型構(gòu)建方法簡單、耗時短、成本相對其他模型較低，是免疫治療短期研究的理想非臨床動物模型，被廣泛應用于腫瘤免疫治療研究中［7-10］。Lin等［11］研 究表明Hu-PBL模型評估PD-L1/PD-1靶向免疫治療不僅耗時短且更準確，是研究PD-L1/PD-1靶向抗腫瘤療效的寶貴工具。

3.2 免疫缺陷小鼠的選擇

小鼠的異種移植成功與否與受體的免疫屏障狀態(tài)關(guān)系密切，受體免疫缺陷程度越高，供體細胞發(fā)生免疫排斥的幾率越低，移植成功率越高。目前應用較廣泛的免疫缺陷小鼠品系包括NOG/MNSG/NPG/NCG（NOD-SCID IL2rg-/-）、NRG（NODRag1-/-IL2rg-/-）、BRG（BALB/cA-Rag2-/-IL2rg-/-）和NPG-B2M。

在選擇免疫缺陷小鼠品系時首先要考慮遺傳背景，如白細胞介素2受體γ鏈具有重要免疫功能的細胞因子IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的共同受體亞基，該基因敲除后小鼠機體免疫功能嚴重受損，通過多種受體阻斷細胞因子信號傳導，導致功能性NK細胞缺陷。重組激活基因Rag1和Rag2在免疫球蛋白（Ig）基因和T細胞受體（TCR）基因的重排和重組過程中發(fā)揮重要作用，是B細胞和T淋巴細胞成熟過程的必需階段，任意一個缺失都會導致T、B淋巴細胞發(fā)育中斷，表現(xiàn)為嚴重的T/B細胞早期發(fā)育阻滯，進而不能產(chǎn)生成熟的T、B淋巴細胞。B2M基因編碼的β2微球蛋白是MHCⅠ類分子的亞基，MHCⅠ類分子介導的T細胞反應在異種排斥反應中起重要作用，B2M基因敲除后，小鼠細胞表面不再表達MHCⅠ類分子，GVHD顯著減弱［12］。遺傳基因的改變會直接影響免疫系統(tǒng)的組成成分、免疫細胞泄露程度、壽命、輻照敏感度及繁殖能力。因此，在選擇免疫缺陷小鼠品系時應綜合考慮各種因素。

其次，免疫缺陷小鼠的性別也是影響免疫系統(tǒng)重建的重要因素之一。Faiyaz等［13］研究結(jié)果表明，受體性別在人造血干細胞移植和增殖過程中起著關(guān)鍵性作用，雌性NSG小鼠比雄性NSG小鼠人CD45+造血細胞的重建效果更好。Volk等［14-15］研究表明，在造血干細胞移植后0～12周雌性小鼠比雄性小鼠初始T細胞水平高，16周左右雄性小鼠成熟T細胞表現(xiàn)出更高的發(fā)育水平，20周以后外周血中人CD45+細胞、初始T細胞和記憶T細胞在不同性別之間達到平衡?？傮w來說，雌性小鼠在免疫細胞發(fā)育和成熟方面比雄性小鼠更有優(yōu)勢，表現(xiàn)出更高水平的重建效率［16-17］。

3.3 免疫細胞的選擇

免疫細胞的供體、數(shù)量和細胞狀態(tài)也是影響人源化免疫系統(tǒng)重建的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，不同供體的免疫細胞在同一小鼠品系的重建速度、重建水平及移植后免疫細胞發(fā)育和成熟的情況不同，不同供體構(gòu)建的免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型對同一免疫檢查點抑制劑反應也不同［18-19］。

人源化免疫系統(tǒng)的重建需要合適數(shù)量的免疫細胞，過多或過少均會影響重建效果。CD34+HSC細胞移植數(shù)量過多可能會導致貧血，PBMC細胞移植過多可能會加速GVHD反應，而移植數(shù)量過少可能會降低重建率甚至會造成重建失敗。一般情況下，CD34+HSC細胞移植數(shù)量為1.0E+4 cells～2.0E+5 cells，PBMC細胞移植數(shù)量為5.0E+6 cells～2.0E+7 cells［16］。

選擇新鮮采集還是超低溫保存的免疫細胞，對于人源化免疫系統(tǒng)重建沒有明顯影響［4］，但是免疫細胞的存活率及結(jié)塊率卻是影響重建效率的關(guān)鍵因素。因此，將預先篩選好的供體先超低溫保存，重建時再進行復蘇，可以提高重建成功率。

綜上所述，在構(gòu)建免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型時，應該從構(gòu)建方法、免疫缺陷小鼠品系、性別和飼養(yǎng)、免疫細胞的供體、數(shù)量和細胞狀態(tài)等各個方面進行考慮，通過采用多種供體克服差異性，優(yōu)化腫瘤模型和免疫細胞供體聯(lián)合接種方案最大化利用窗口期［20］等策略提高模型構(gòu)建成功率及應用轉(zhuǎn)化率，使實驗室免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型構(gòu)建方法進一步完善。近年來，免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型被廣泛應用于免疫檢查點抑制劑的臨床前研究中，除了已應用于臨床的PD-1/PD-L1和CTLA-4，也發(fā)現(xiàn)不少新的免疫檢查點，這些新的免疫檢查點很大程度上會選擇免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型進行臨床前研究，未來本實驗室會進一步研究腫瘤模型和免疫細胞供體聯(lián)合方案，開發(fā)出更多的免疫系統(tǒng)人源化腫瘤模型，以期為腫瘤免疫療法提供更有利的藥物研發(fā)工具。