譚琳，NWE Ni Win Htet，2，陳償，PAN Zhiqiang

1.中國熱帶農業(yè)科學院?？趯嶒炚?，海口571101；

2.緬甸生物技術研究所微生物實驗室，緬甸 皎施 05151；

3.中國科學院南海海洋研究所，熱帶海洋生物資源和生態(tài)重點實驗室，廣州 510301；

4.美國農業(yè)部農業(yè)研究局天然產物利用研究中心，美國 牛津 38677-1848

相容性溶質是微生物在長期進化過程中形成的一種對抗外界不斷變化滲透壓的一類化合物［1］。四氫嘧啶類物質是一類廣泛分布在嗜鹽菌和非嗜鹽菌中的相容性溶質，具有極好的滲透壓保護功能［2-3］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶不僅是調節(jié)微生物細胞滲透壓的物質，還是細胞及大分子物質的生物保護劑。四氫嘧啶可緩解高滲、高溫、凍融、干燥、輻射和化學試劑對蛋白、核酸、生物膜及整個細胞的毒害作用［4-6］，且能在人體皮膚保護［7-9］、抗炎癥治療［10-12］、緩解神經變性疾病中發(fā)揮作用［13］，因此在醫(yī)療、酶工業(yè)、化妝品等領域有廣闊的應用前景。由于天然微生物中四氫嘧啶含量很低，提取困難，同時四氫嘧啶僅含有1個手性碳原子，也難以通過化學方法合成［14］。目前四氫嘧啶的生產大多通過發(fā)酵具有四氫嘧啶合成能力的中度嗜鹽微生物獲得大量的四氫嘧啶。但此方法的缺點是，高鹽濃度下發(fā)酵對設備損耗較大導致生產成本較高，并且中度嗜鹽微生物不是常用的工業(yè)微生物菌種，生長慢、發(fā)酵周期長、最終產率低［15］。為了簡化這種復雜的生產工藝，目前將來源于嗜鹽菌中的四氫嘧啶合成基因簇ectABC轉入非嗜鹽菌，在非嗜鹽菌中重構四氫嘧啶的合成通路。重組菌株在中度鹽離子濃度或者低鹽離子濃度脅迫下合成四氫嘧啶［16］。在本團隊前期研究中，對一株來自南海珊瑚礁的新喀里多尼亞弧菌CGJ02-2進行了全基因組序列測定，通過antiSMASH軟件預測次級代謝產物基因簇，發(fā)現(xiàn)此細菌基因組中含有四氫嘧啶合成基因簇［17］。本研究旨在分離新的四氫嘧啶合成基因簇ectABC，并在大腸桿菌BW25113中重構四氫嘧啶的合成通路，通過優(yōu)化全細胞催化條件，為構建四氫嘧啶高產菌株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑、菌株限制性內切酶NheⅠ和EcoRⅠ購自Biolabs公司（New England）；氨芐青霉素和1kb DNA Ladder購于生工生物（上海）有限公司。PrimeSTAR?Max DNA polymerase購自TaKaRa公司；四氫嘧啶標準品購于Sigma公司；菌株新喀里多尼亞弧菌CGJ02-2由中國科學院南海海洋研究所陳償研究員提供；pBAD載體為本實驗室保存；E.coliBW25113感受態(tài)購自上海維地生物公司。試驗于2020年3月—2021年5月在中國熱帶農業(yè)科學院?？趯嶒炚具M行。

1.1.2 主要儀器高速冷凍離心機（Thermo-Fisher，Sorvall legend Micro 21R）、恒溫搖床（智誠，ZWY-2102）、電泳儀（Wix-EP600）、PCR儀（Ta-KaRa TP600）、凝膠成像系統(tǒng)（AlphaImager 2401）、納升液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜聯(lián)用儀（Ekspertnano LC 425/Ultimate 3000/Q-trap 6500+AB sciex 6500+）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取將菌株CJG02-2用

2216E（海博生物公司）培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)過夜，常溫8 000 r·min-1離心5 min，收集菌體，按照Ta-KaRa微生物基因組DNA提取試劑盒（TaKaRaMini-BEST細菌基因組DNA提取試劑盒Ver.3.0）操作步驟，提取基因組DNA。

1.2.2 四氫嘧啶合成基因簇ectABC的克隆及重組表達載體的構建根據(jù)CGJ02-2全基因組測序結果，設計克隆ectABC基因簇的1對引物：EctF:5'-CTAGCTAGCATGATCACATCAGCACCTTGGGT C-3'和EctR：5'-CCGGAATTCTTAGTCAACGAGA GGATAAACACC-3'（下劃線部分別為NheⅠ和EcoRⅠ酶切位點）。以菌株CGJ02-2全基因組DNA為模板，進行PCR擴增。擴增條件為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR膠回收產物和表達載體pBAD均用NheⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，酶切產物回收后通過T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)，獲得的重組子用雙酶切鑒定，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。提取測序正確克隆中的質粒，轉化表達宿主BW25113感受態(tài)細胞。

1.2.3 ectABC在大腸桿中的重組表達及鑒定將帶有重組質粒pBAD ectABC的陽性克隆接種到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃過夜。取適量過夜培養(yǎng)物加入LB培養(yǎng)基中（1∶100），37℃培養(yǎng)3 h，使其OD600為0.6。然后將L-阿拉伯糖添加到細菌培養(yǎng)物中使其終濃度為0.1%，30℃220 r·min-1誘導6 h。收集1 mL細菌培養(yǎng)液，4℃6 000 r·min-1離心5 min。將細胞用50μL 1×SDS上樣緩沖液（BOSTER，AR1142）重新懸浮，并在沸水中煮10 min。然后將裂解液在12 000 r·min-1下離心10 min，取10μL上清液，用SDS-PAGE分析重組表達情況。陰性對照為未添加L-阿拉伯糖的重組菌株BW25113pBAD-ectABC培養(yǎng)產物和添加L-阿拉伯糖的菌株BW25113pBAD（空載體）培養(yǎng)產物。根據(jù)SDS-PAGE結果，從凝膠上切取重組表達蛋白條帶，送上海交通大學分析測試中心，通過納升液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜聯(lián)用儀鑒定其是否為ectA、ectB、ectC。

1.2.4 重組菌株全細胞催化生產四氫嘧啶參照1.2.3中的方法將重組菌株進行活化、擴大培養(yǎng)及L-阿拉伯糖誘導表達，8 h后，以7 000 r·min-1、4℃離心10 min，收集細胞，用0.85%NaCl溶液洗滌兩次，然后再懸浮在含有100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）、50 mmol·L-1天冬氨酸鈉、50 mmol·L-1KCl和100 mmol·L-1甘油的反應混合物中，形成細胞懸浮液。使細胞懸液在30℃、120 r·min-1、24 h下進行催化反應。全細胞催化24 h完成后，9 000 r·min-1離心收獲上清，用0.45 mm濾膜過濾后用型號為BRUKER compact的電噴霧四級桿飛行時間質譜分析四氫嘧啶的產生。質譜條件：掃描范圍為m/z 50-1300，霧化器壓力1.8 Bar，毛細管出口電壓500 V，毛細管電壓4 500 V，正離子化模式的電噴霧電離，碰撞能量7 eV，干燥氣溫度250℃。

1.2.5 全細胞催化的優(yōu)化為了獲得最佳的全細胞催化條件，在全細胞催化實驗中，首先對底物天冬氨酸濃度（50～300 mmol·L-1）進行優(yōu)化，在此基礎上，分析了不同濃度KCl（0～300 mmol·L-1）轉化液中四氫嘧啶的產率。然后在pH 7.0的情況下，比較了不同溫度（25～40℃）對四氫嘧啶生產的影響。在獲得最適溫度的基礎上，添加最適濃度底物和KCl，使生物轉化在pH 6.0～8.0條件下進行，獲取最適pH反應條件。所有的催化反應在細胞密度OD600=5的條件下進行，通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測四氫嘧啶的合成及其產量。HPLC分析檢測條件為：色譜柱waters XBridge Amide，3.5μm，流動相B（乙腈）∶C（水）=75∶25，柱溫30℃，波長210 nm。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理，SPSS Statistics 22軟件進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 四氫嘧啶合成基因簇etcABC的克隆及重組表達載體構建

以菌株CGJ02-2全基因組DNA為模板，EctF和EctR為引物進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)PCR產物大小約為2 235 bp（圖1），與預期的ectABC基因簇大小一致。目的片段與載體連接、轉化后獲得陽性克隆，雙酶切鑒定顯示重組質粒中有2 235 bp左右的片段插入（圖2），測序后顯示四氫嘧啶合成基因簇ectABC的長度和序列與理論一致。

圖1 四氫嘧啶合成基因簇etcABC PCR擴增Fig.1 PCR of etcABC gene cluster for ectoine

圖2 重組質粒pBADetcABC的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pBADetcABC by synthesis double restriction enzyme digestion

2.2 etcABC在大腸桿菌中的重組表達及鑒定

重組菌株BW25113pBAD-ectABC，經0.1%L-阿拉伯糖誘導表達后，采用SDS-PAGE電泳鑒定細胞裂解液上清，發(fā)現(xiàn)與含有pBAD空載體的菌株誘導以及含有重組表達載體pBAD-ectABC菌株未誘導細胞裂解液上清相比，產生了3個重組蛋白（圖3）。其大小分別為15、40、13 kD左右，與ectA（20 kD）、ectB（45.9 kD）、ectC（14.8 kD）的理論值存在差異，可能的原因是某些親水性的氨基酸與SDS結合率低造成了重組蛋白在電場中的泳動發(fā)生了偏移［18］。進一步應用飛行時間串聯(lián)質譜聯(lián)用儀測定了3個重組蛋白的分子量和氨基酸序列。結果顯示其肽段覆蓋率分別達94%、91%、74%。其相應的分子量分別為20.1、45.9和14.8 kD，與ectA、ectB、ectC的分子量理論值一致。

圖3 SDS-PAGE分析ectA、ectB、ectC的重組表達Fig.3 SDS-PAGE analysis for the recombinant expression of ectA,ectB,ectC

2.3 重組菌株全細胞生產四氫嘧啶

利用高分辨質譜鑒定重組菌株BW25113 pBAD-ectABC誘導后全細胞上清中的四氫嘧啶，以重組菌株未誘導全細胞上清為陰性對照，四氫嘧啶標準品作為陽性對照。結果（圖4）發(fā)現(xiàn)在誘導的重組菌株全細胞催化上清中，有一個化合物的分子量為143.079，分子式為C6H11N2O2。而標準品的分子量為143.080 5，分子式為C6H11N2O2，這表明重組菌株能夠合成四氫嘧啶，并將其分泌到上清中。

圖4 四氫嘧啶的高分辨質譜鑒定Fig.4 Identification of ectoine by high resolution mass spectrometry

2.4 天冬氨酸鈉濃度對四氫嘧啶產量的影響

作為四氫嘧啶合成的底物，天冬氨酸的濃度是影響四氫嘧啶產量的重要因素。因此，首先研究了不同濃度天冬氨酸鈉對四氫嘧啶產量的影響。如圖5所示，隨著天冬氨酸鈉濃度的升高，四氫嘧啶產量呈先升高后下降的趨勢。當天冬氨酸鈉濃度達100 mmol·L-1時，四氫嘧啶產量最高，為0.86 mg·mL-1，與其他各濃度下生成的四氫嘧啶產量差異顯著（P＜0.05）。當天冬氨酸鈉濃度達到200 mmol·L-1時，四氫嘧啶產量逐步下降，當天冬氨酸鈉濃度為300 mmol·L-1時，四氫嘧啶的產率僅為0.52 mg·mL-1。因此，天冬氨酸鈉的最佳濃度為100 mmol·L-1。

圖5 天冬氨酸鈉濃度對四氫嘧啶產量的影響Fig.5 The effect of sodiumasparpate concentration on the yield of ectione

2.5 KCl濃度對四氫嘧啶產量的影響

由于KCl濃度對EctB活性的穩(wěn)定性有影響，試驗分析了不同濃度KCl對四氫嘧啶產量的影響。如圖6所示，隨著KCl濃度的提高，四氫嘧啶產量隨之升高，當KCl濃度為100 mmol·L-1時，四氫嘧啶產量達到最大值0.95 mg·mL-1。當濃度大于100 mmol·L-1時，四氫嘧啶產量隨之降低。不同濃度KCl對四氫嘧啶產量的影響差異顯著（P＜0.005），KCl的最佳濃度為100 mmol·L-1。

圖6 KCl濃度對四氫嘧啶產量的影響Fig.6 The effect of KCl concentration on the yield of ectione

2.6 溫度對四氫嘧啶產量的影響

為了了解溫度對四氫嘧啶合成的影響，試驗在最適天冬氨酸濃度和KCl濃度的基礎上，采用不同溫度對全細胞進行催化。結果如圖7所示，25℃時，四氫嘧啶的產率較低，隨著溫度的提高，四氫嘧啶產量明顯升高，但隨之也呈現(xiàn)出下降趨勢。當溫度為30℃，四氫嘧啶的產量最高，為0.94 mg·mL-1。雖然溫度為35℃時，四氫嘧啶產量與30℃時四氫嘧啶產量無統(tǒng)計學差異（P>0.05），考慮到能耗原因，選擇全細胞催化生產四氫嘧啶的最佳溫度為30℃。

圖7 溫度對四氫嘧啶產量的影響Fig.7 The effect of temperature on the yield of ectione

2.7 pH對四氫嘧啶產量的影響

由于不同pH會影響酶活性，因此在確定最適底物濃度、KCl濃度、最適溫度的基礎上，探究了pH對四氫嘧啶產量的影響。如圖8所示，隨著pH的提高，四氫嘧啶產量同樣表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且大部分pH對四氫嘧啶產量的影響差異顯著。當pH為7.0時，四氫嘧啶產量最高，達1.11 mg·mL-1。然而pH高于7.5后產量下降，當pH為8.0時，四氫嘧啶產量為0.8 mg·mL-1。因此，pH 7.0是全細胞催化生產四氫嘧啶的最適pH。

圖8 pH對四氫嘧啶產量的影響Fig.8 The effect of pH on the yield of ectione

2.8 最適條件下四氫嘧啶產量

在 天 冬 氨 酸 濃 度100 mmol·L-1，KCl濃 度100 mmol·L-1，溫度30℃，pH7.0的最優(yōu)條件下，測得四氫嘧啶的產量為1.11 mg·mL-1。

3 討論

自發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶以來，廣泛應用于醫(yī)學領域、酶工業(yè)、化妝品領域，國內外的科學家們在其生物合成途徑及制備方法方面開展了大量的研究。目前，人們已經從鏈霉菌、鹽單胞菌等多種嗜鹽菌中克隆了四氫嘧啶合成基因簇ectABC［18-21］，并且通過重組表達載體，將它們導入大腸桿菌中表達，實現(xiàn)了四氫嘧啶在低鹽環(huán)境下的重新合成。但研究發(fā)現(xiàn)不同來源的ectABC通過重組表達后，合成四氫嘧啶的能力有顯著差異，如高波［22］從Streptomyces pactumAct12分離出ectABC，通過pET28a在大腸桿菌BL21中表達，重組菌株的四氫嘧啶產量較低，僅為0.437 mg·mL-1。張欣［23］從HalomonasspQHL1中分離的ectABC也通過pET28a在大腸桿菌BL21中表達，四氫嘧啶產量達1.109 mg·mL-1。Schuben等［24］從Chromohalobacter salexigens中獲得ectABC，通過pASK-IBA7在大腸桿菌DH5α中表達，重組菌株四氫嘧啶合成量高達5.9 mg·mL-1。因此克隆新的四氫嘧啶合成基因簇，以探索其在異源宿主低鹽環(huán)境下四氫嘧啶的產量，仍是研究的熱點。

Naughton等［25］通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，包括新喀里多尼亞弧菌的10類弧菌中含有ectABC基因簇，但是從弧菌中克隆ectABC，并在大腸桿菌中實現(xiàn)異源表達及合成四氫嘧啶，尚未有報道。本研究從弧菌中獲得的四氫嘧啶合成基因簇ectABC，通過pBAD表達載體在BW25113中實現(xiàn)異源表達，且在最佳全細胞催化條件下，當細胞密度OD600為5時，獲得的重組菌株四氫嘧啶合成量為1.11 mg·mL-1。與一些高產四氫嘧啶菌株相比，本研究獲得的重組菌株四氫嘧啶產量略低，但要遠高于高波［22］、魏偉偉［26］等構建的ectABC重組菌株產量。產生這一結果的原因可能是不同來源的嗜鹽菌中ectABC基因簇編碼ectA、ectB、ectC蛋白序列存在差異。序列分析顯示本研究中ectA、ectB、ectC與其他細菌來源ectA、ectB、ectC的同源性在60%以下，這可能導致重組表達的ectA、ectB、ectC蛋白酶活性存在差異，從而影響四氫嘧啶的合成。陳永濤等［27］的研究結果也顯示，不同來源的ectABC簇構建的工程菌株生產四氫嘧啶，產量之間有顯著的差異。此外，全細胞催化時細胞密度對四氫嘧啶的合成也有影響。如He［28］等研究發(fā)現(xiàn)，將來自Halomonas elongata的ectABC通過全細胞催化，當發(fā)酵罐中細胞密度OD600為5時，產量達到2.67 mg·mL-1，當細胞密度OD600為20時，產量達到了25.1 mg·mL-1。因此，下一步將通過發(fā)酵罐來生產四氫嘧啶，并探討細胞密度對四氫嘧啶產量的影響，同時也將開展分離純化實驗，為工業(yè)化生產四氫嘧啶奠定基礎。