亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        孕期地塞米松暴露對大鼠子代海馬神經(jīng)元增殖以及突觸可塑性的影響

        2022-11-30 07:04:16秦佳鑫姚寶珍
        生物技術(shù)進展 2022年6期
        關(guān)鍵詞:胎鼠祖細胞可塑性

        秦佳鑫,姚寶珍

        武漢大學人民醫(yī)院兒科,武漢 430060

        胎兒發(fā)育過程中,神經(jīng)系統(tǒng)會受到宮內(nèi)環(huán)境的影響,不良環(huán)境暴露可導致子代海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)異常以及發(fā)育、學習記憶改變。已有研究證明,暴露于糖皮質(zhì)激素、抗炎、抗癲癇、抗精神病等多種藥物[1-2]均可通過減少海馬神經(jīng)增殖分化以及增加海馬神經(jīng)元凋亡的機制使海馬神經(jīng)元數(shù)量減少、密度降低以及海馬的突觸可塑性[3]改變。

        地塞米松是一種糖皮質(zhì)激素藥物,具有抗炎、抑制免疫、抗休克及增強應激反應等藥理作用,廣泛應用于治療多種疾病,如自身免疫性疾病、過敏、炎癥、哮喘及皮膚病等。臨床上常使用地塞米松來促進早產(chǎn)兒的肺成熟以及孕期預防胎兒呼吸窘迫綜合征,是目前較為公認的孕期安全用藥。前期實驗表明,孕期地塞米松暴露(prenatal dexamethasone exposure,PDE)可導致大鼠子代空間記憶以及學習缺陷[4]。在PDE的恒河猴模型中,海馬CA區(qū)錐體神經(jīng)元和齒狀回顆粒神經(jīng)元數(shù)量減少以及苔蘚纖維的軸突突觸末端顯示出明顯的變性現(xiàn)象[5]。此外,孕期暴露于地塞米松會導致子代癲癇、抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病率增高[6-7]。因此,我們提出PDE可能導致子代海馬發(fā)育不良。

        在大腦的正常運作過程中,正常的神經(jīng)功能取決于神經(jīng)元連接的精確模式,而這又取決于成熟大腦中存在的數(shù)萬億個突觸[8]。為了滿足動物在不斷變化的環(huán)境中的生存要求,無論是結(jié)果還是功能上,突觸都不是一成不變的,而是會經(jīng)歷持續(xù)的變化,這被稱為突觸的可塑性[9]。多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如自閉癥、抑郁癥、阿爾茲海默癥等[10-13,15,17],均與突觸數(shù)量以及突觸可塑性改變有關(guān)。此前有研究證明APPL1(adaptor protein containing pH domain,PTB domain and leucine zipper motif 1)可充當連接神經(jīng)元活動與基因轉(zhuǎn)錄的連接器,該途徑有助于突觸可塑性的修飾,故其對突觸可塑性有不容忽視的作用[14-15]。本文探究了PDE導致子代海馬突觸可塑性受損是否與APPL1的改變相關(guān),提出PDE可能通過調(diào)控APPL1的表達從而影響子代海馬突觸可塑性的損傷。

        1 材料與方法

        1.1 動物與處理

        動物實驗在武漢大學動物實驗中心進行,該中心已獲得國際實驗動物護理評估與認證協(xié)會(AAALAC International)的認可。所有動物實驗程序均在中國動物福利委員會批準的基礎上進行。

        建立地塞米松暴露大鼠模型,適應性喂養(yǎng)Wistar大鼠一周后進行繁殖和交配。于合籠后次日進行陰道檢查,確認妊娠當日記為GD0。將妊娠大鼠隨機分為對照組和PDE組。從妊娠第9天至妊娠第20天,兩組大鼠分別皮下注射地塞米松0.2 mg·kg-1·d-1和等量的0.9%氯化鈉溶液。在GD20當天,將孕鼠用異氟醚麻醉,然后處死。每組胎仔數(shù)在8~14只的懷孕大鼠標記為合格,取出胎鼠。每組隨機取5個全腦,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后切片。從同窩中收集的剩余胎兒海馬樣本被匯集在一起,立即在液氮中冷凍后保存在-80℃,以作進一步分析。

        1.2 材料

        1.2.1 試劑PSD95(A6194)、GAPDH(AC002)的抗體均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;總RNA提取劑Trizol購于美國Invitrogen公司;4%多聚甲醛固定購于北京艾斯本技術(shù)有限公司;異氟醚購于美國Baxter Healthcare有限公司;逆轉(zhuǎn)錄和定量實時聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒購自TaKa-Ra生物技術(shù)有限公司;所有引物均由天一匯源生物科技有限公司合成。

        1.2.2 設備分光光度計和ABI Step One RT-PCR熱循環(huán)儀購于美國賽默飛世爾科技公司;光學顯微鏡購于北京生物科技公司;石蠟組織切片機購于湖南榮和科技公司;高速離心機購于上海佳德儀器公司;凈化工作臺購于蘇潔醫(yī)療器械(蘇州)有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR根據(jù)制造商的說明書提取總RNA。用分光光度計測定總RNA的濃度和純度,調(diào)整RNA濃度為1μg·μL-1。使用2μg總RNA制備單鏈cDNA(引物見表1)。RT-qPCR在10μL反應混合物中進行。為了更精確地量化基因轉(zhuǎn)錄本,將管家基因GAPDH的mRNA水平作為定量對照。相對擴增子表達量采用2-ΔΔCt法計算。

        表1 qRT-PCR中引物序列及反應條件Table 1 Primer sequences and reaction conditions used in quantitative real-time PCR

        1.3.2 蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡分析從海馬組織中提取蛋白質(zhì)樣品。使用BCA測定法測定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)過上樣、電泳,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h,再將膜與一抗在4℃下孵育過夜。用TBST洗滌3次后,加入抗小鼠GAPDH(1:5 000)二抗孵育。最后,使用ECL Plus試劑盒可視化蛋白質(zhì)條帶,平均光密度代表蛋白質(zhì)的相對水平。

        1.3.3 透射電鏡觀察突觸超微結(jié)構(gòu)每組分別隨機選取雌、雄各3只胎鼠,斷頭,在冰上快速分離海馬,切取1 mm3海馬CAl區(qū)組織塊,使用2.5%戊二醛溶液4℃固定24 h,按常規(guī)制作電鏡標本,使用透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)改變。

        1.3.4 統(tǒng)計與分析采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差表示。獨立樣本t檢驗比較對照組和PAE組的平均值。多組比較采用單因素方差分析檢驗,然后采用dunnett-t檢驗確定兩組之間的顯著差異。P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 PDE對雌雄子代海馬神經(jīng)增殖的影響

        增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在細胞增殖的啟動上起重要作用,是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標。Ki67是增殖細胞的相關(guān)抗原,其功能與有絲分裂密切相關(guān),在細胞增殖中是不可缺少的。與對照組相比,PDE子代海馬雌雄性高劑量組PCNA、ki67均出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01,圖1)。提示PDE可致子代海馬神經(jīng)增殖減少。

        圖1 子代胎鼠海馬增殖指標表達變化Fig.1 Changes of hippocampal apoptosis index in offspring fetal rats

        2.2 PDE對雌雄子代海馬神經(jīng)凋亡的影響

        Caspase-3是一種蛋白酶,其在細胞凋亡中起著不可替代的作用,是反映細胞凋亡的重要指標。RT-qPCR結(jié)果顯示,與對照組相比,PDE雌雄子代Caspase-3均顯著增加(P<0.05,P<0.01,圖2)。提示PDE可致子代海馬神經(jīng)凋亡增加。

        圖2 子代胎鼠海馬凋亡指標表達變化Fig.2 Changes of hippocampal apoptosis index in offspring fetal rats

        2.3 PDE對雌雄子代海馬突觸可塑性的影響

        突觸融合蛋白(Syntaxin)、25 kD突觸相關(guān)蛋白(SNAP25)在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和軸突生長過程中起著重要的作用,可作為突觸的相關(guān)性指標。RT-qPCR結(jié)果顯示PDE子代海馬中Syntaxin以及SNAP25出現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.05,P<0.01,圖3)。Western-blot結(jié)果顯示高劑量PDE子代海馬中突觸后致密蛋白95(PSD95)出現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.05,P<0.01,圖3)。提示PDE可致子代海馬突觸可塑性受損。

        圖3 子代胎鼠海馬突觸指標表達變化Fig.3 Changes of hippocampal synapse index in offspring fetal rats

        2.4 PDE致雌雄子代海馬突觸可塑性受損

        投射電鏡結(jié)果顯示(圖4),對照組中突觸結(jié)構(gòu)完整,突觸后致密帶密度較高。地塞米松暴露組突出結(jié)構(gòu)模糊,突觸后致密帶密度降低,PSD厚度顯著減少,且突觸間隙顯著增寬。提示PDE可致子代海馬突觸可塑性受損。

        圖4 各組海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure of hippocampal CA1 area in each group

        2.5 PDE通過調(diào)節(jié)APPL1介導子代海馬突觸可塑性受損

        APPL1是含有多個結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白,有研究表明其定位于樹突棘和突觸,并調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的發(fā)育。RT-qPCR結(jié)果顯示PDE子代海馬中APPL1轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(P<0.05,P<0.01,圖5)。提示PDE可能通過調(diào)控海馬中APPL1的表達從而影響子代海馬突觸可塑性。

        圖5 子代胎鼠海馬APPL1 mRNA表達變化Fig.5 Change of hippocampal APPL1 mRNA expression in offspring fetal rats

        3 討論

        地塞米松作為一種糖皮質(zhì)激素藥物,其在臨床上應用廣泛,婦產(chǎn)科常用于多種早產(chǎn)有關(guān)疾病的治療。由于早產(chǎn)兒肺部多不成熟,可能會導致呼吸窘迫綜合征的發(fā)生,降低了胎兒的生存率,故臨床上多在孕晚期使用地塞米松來達到促進胎兒肺成熟的目的[16]。然而,近年來越來越多的研究表明,產(chǎn)前使用地塞米松會造成子代不良損傷[17-19]。目前臨床地塞米松用藥劑量標準常為0.05~0.2 mg·kg-1·d-1[20],按照人和大鼠的劑量轉(zhuǎn)換關(guān)系(人∶大鼠=1∶6.17)計算本研究中使用0.2 mg·kg-1·d-1地塞米松暴露量相當于0.03 mg·kg-1·d-1人群用藥劑量。因此,本研究在實驗中使用的地塞米松劑量是合理的,具有臨床現(xiàn)實意義。

        目前,關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的假說已有較多研究,其中神經(jīng)發(fā)生假說受到越來越多的關(guān)注和研究,該假說聚焦于海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生減少。海馬神經(jīng)發(fā)生是指從神經(jīng)干細胞增殖分裂成為定向神經(jīng)祖細胞,并逐漸向功能區(qū)域遷移產(chǎn)生神經(jīng)功能的完整過程。其中神經(jīng)祖細胞的增殖活動是海馬神經(jīng)發(fā)生中的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)祖細胞增殖障礙會導致神經(jīng)發(fā)生異常[21]。此外,神經(jīng)祖細胞的增殖、分化及其功能在神經(jīng)精神性疾病的發(fā)病機制和疾病治療中極其重要,有研究發(fā)現(xiàn)在癲癇[22-23]、阿爾茲海默癥、抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有可能存在神經(jīng)祖細胞發(fā)生減少現(xiàn)象;也有研究基于精神分裂癥患者的神經(jīng)祖細胞進行藥物篩選以得到更為有效的治療靶點[24]。突觸是神經(jīng)元信號傳遞的重要結(jié)構(gòu),神經(jīng)突觸可塑性被認為是神經(jīng)回路發(fā)育以及記憶與學習功能的基礎,其異??蓪е露喾N神經(jīng)疾病發(fā)生,例如癲癇、抑郁癥和阿爾茲海默癥等[25-27]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)PDE可致子代胎鼠海馬神經(jīng)細胞發(fā)生減少,主要包括增殖減少以及凋亡增多兩方面,進一步檢測PDE子代海馬突觸相關(guān)發(fā)育指標發(fā)現(xiàn),PDE會導致子代海馬突觸可塑性受損。

        中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是一個復雜的過程,其在任何時間節(jié)點受到破壞都可能對大腦的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生嚴重而持久的影響。在宮內(nèi),腦的發(fā)育受到基因和環(huán)境的雙重影響[28-29]。由于孕期使用地塞米松的不完全安全性,本實驗探究孕期地塞米松暴露與子代海馬發(fā)育的關(guān)系,證實了孕期地塞米松暴露會導致子代海馬神經(jīng)發(fā)育損傷以及突觸可塑性改變,未來實驗中需要進一步對孕期地塞米松暴露是否導致子代神經(jīng)系統(tǒng)疾病易感以及其可能的機制進行探究,這將對于臨床地塞米松用藥有一定借鑒意義。

        猜你喜歡
        胎鼠祖細胞可塑性
        甲基苯丙胺改變成癮小鼠突觸可塑性基因的甲基化修飾
        內(nèi)源性NO介導的Stargazin亞硝基化修飾在腦缺血再灌注后突觸可塑性中的作用及機制
        超聲刺激小鼠伏隔核后c-Fos蛋白及結(jié)構(gòu)可塑性改變的實驗
        胚胎大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)及神經(jīng)元鑒定
        不同胎齡胎鼠脊髓源性神經(jīng)干細胞特性比較
        Wnt3a基因沉默對內(nèi)皮祖細胞增殖的影響
        轉(zhuǎn)GDNF基因的BMSCs移植對大鼠腦出血突觸可塑性的影響
        內(nèi)皮祖細胞在缺血性腦卒中診治中的研究進展
        維甲酸誘導BALB/c近交系小鼠腭裂動物模型的實驗研究
        懸滴和懸浮法相結(jié)合培養(yǎng)胰腺祖細胞
        亚洲天堂在线视频播放| 国语自产视频在线| 吃奶呻吟打开双腿做受视频 | a√无码在线观看| 亚洲一区二区三区在线看| 人妻 丝袜美腿 中文字幕| 亚洲国产韩国欧美在线| 亚洲黄色在线看| 亚洲国产综合精品一区最新| 久久久99精品成人片| 黑人大荫道bbwbbb高潮潮喷| 91国在线啪精品一区| av男人天堂网在线观看| 国产裸体美女永久免费无遮挡| 国产成人亚洲精品无码h在线| 日韩久久av电影| 久久久大少妇免费高潮特黄| 成人一区二区免费中文字幕视频| 日本av一区二区三区四区| 2021国产精品视频网站| 欧洲一卡2卡三卡4卡免费网站| 日本女优中文字幕看片| 亚洲白嫩少妇在线喷水 | 内射人妻视频国内| 国产成人久久综合热| 97中文字幕一区二区| 亚洲av色香蕉一区二区三区潮| 久久午夜福利无码1000合集| 久久久亚洲色| 国产精品欧美视频另类专区| 国产tv不卡免费在线观看| 国产aⅴ无码专区亚洲av麻豆 | 中文无字幕一本码专区| 美国少妇性xxxx另类| 中国亚洲女人69内射少妇| 国产一区二区三区杨幂| 日韩人妖视频一区二区| 一个人看的视频www免费| 免费看欧美日韩一区二区三区| 日本女同av在线播放| 国产欧美一区二区三区在线看|