趙開拓，李志龍，賀達

中冶南方城市建設(shè)工程技術(shù)有限公司，武漢 430077

近年來，人們越來越關(guān)注全球氣候變化對自然環(huán)境造成的影響［1］，其中內(nèi)陸水體鹽度升高是主要的影響之一［2-3］。據(jù)Nielsen等［4］預(yù)測，內(nèi)陸地區(qū)水體鹽度在未來50年將增長20倍。我國西部內(nèi)陸地區(qū)大多處于溫帶大陸性氣候和高原山地氣候，水體鹽化趨勢明顯［5］。周洪華等［6］研究表明，博斯騰湖25年間鹽度從0.385 g·L-1升高至1.870 g·L-1，增加了3.9倍；烏梁素海13年間鹽度從0.60g·L-1升高到4.36 g·L-1，增加了6.3倍。鹽度升高會直接或間接地破壞內(nèi)陸水生態(tài)環(huán)境和生物多樣性，其中淡水藻類作為初級生產(chǎn)者對鹽度反應(yīng)最為敏感［7-8］。

淡水普通小球藻（Chlorella vulgaris）廣泛分布于西部內(nèi)陸地區(qū)，是一種常見的綠藻門小球藻屬球形單細胞淡水藻類，細胞直徑大多約為3～8μm［9-10］。在鹽度升高條件下，小球藻生理特征的變化可反映全球氣候變化導(dǎo)致的水體鹽度升高對內(nèi)陸水生態(tài)系統(tǒng)的影響程度［11］?，F(xiàn)有研究主要從藻類對鹽度的生理反應(yīng)角度探究小球藻在高鹽度脅迫時的響應(yīng)。如杜宇等［10］研究表明高鹽度（26.3 g·L-1）能抑制小球藻生長。劉春光等［11］研究表明鹽度小于3 g·L-1會促進藻類生長，過高鹽度會抑制藻類生長。饒本強等［12］在不同鹽度條件下研究集球藻細胞結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)在高鹽條件下細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)階段性破壞并出現(xiàn)質(zhì)壁分離和空泡化等現(xiàn)象。葸玉琴等［13］研究自養(yǎng)和混養(yǎng)小球藻對NaCl脅迫的響應(yīng)中發(fā)現(xiàn)：當培養(yǎng)基中NaCl濃度升高至5～20 g·L-1時，自養(yǎng)和混養(yǎng)小球藻由于受到鹽脅迫，藻細胞內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量會出現(xiàn)遞減趨勢。綜上所述，現(xiàn)有研究主要集中在較高鹽度（>5 g·L-1）條件下，小球藻及其他藻種的生長特性、產(chǎn)物合成及生理響應(yīng)方面，而對低鹽度條件（＜5 g·L-1）下小球藻的生長繁殖及生理特性研究鮮見。

因此，本研究以我國西部內(nèi)陸水體常見藻種普通小球藻（Chlorella vulgaris）為研究對象，以內(nèi)陸水體逐漸鹽化過程中形成低鹽化水體（＜5 g·L-1）為背景，模擬水體低鹽化對普通小球藻（Chlorella vulgaris）的分裂增殖，探究低鹽化條件下對小球藻葉綠素a合成速率、酶活性及其光合作用的生理響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用普通小球藻（Chlorella vulgaris）取自西安市興慶湖地表水體，藻細胞在BG-11培養(yǎng)基上劃線分離后純化培養(yǎng)，挑取生長良好的藻種接種于新的BG-11培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的普通小球藻作為藻種使用，接種量為10%（體積分數(shù)）。擴培后將等量純種普通小球藻分別置于40 cm×20 cm×30 cm的有機玻璃容器中進行培養(yǎng)，容器盛水量20 L，藻細胞原始濃度為1.2×105個·mL-1。取用興慶湖原水模擬小球藻原有環(huán)境，并在126℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌30 min，以去除其他藻細胞或細菌等雜質(zhì)，滅菌完成后采用孔徑1.2μm濾紙過濾作為本次實驗培養(yǎng)基用水。

1.2 培養(yǎng)方法

為避免過低的營養(yǎng)條件對鹽度刺激造成掩蔽作用，向滅菌過濾后的原水中添加營養(yǎng)鹽使總氮含量達到12 mg·L-1，總磷含量達到0.5 mg·L-1。實驗培養(yǎng)溫度控制在為25℃左右，光照強度為3 300 lx，光暗周期為12 L∶12 D。實驗設(shè)3個處理組和1個對照組，其中對照組不做處理，實測鹽度0.4 g·L-1，實驗組以NaCl調(diào)節(jié)鹽度值，每組設(shè)3個重復(fù)，各項測量結(jié)果取平均值。本次實驗周期連續(xù)9 d，實驗第1 d各組均維持原水鹽度值（0.4 g·L-1），作為實驗對象的緩沖期；第2 d按照1、3、5 g·L-1的濃度梯度改變實驗組溶液的鹽度值。實驗期間每天人工攪動3次，每隔24 h從各容器中間層分別取樣，測定葉綠素a濃度、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）和葉綠素熒光等參數(shù)。

1.3 測定方法

1.3.1 葉綠素a含量測定取中間層原藻液10 mL，0.45μm過濾膜抽濾、-20℃冷凍過夜備用。測定方法改進梁興飛［14］采用超聲輔助熱乙醇提取葉綠素a的方法，以低溫高壓破碎取代其超聲破碎。

1.3.2 SOD比活性測定參考李合生等［15］氮藍四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）法測定SOD活性，用分光光度計測量波長560 nm處的吸光值，以抑制50%氮藍四唑光還原為1個酶活力單位，除以總蛋白質(zhì)含量得到比活性。

1.3.3 MDA濃度測定參考高俊鳳［16］硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測定MDA濃度，用分光光度計分別測量532、600、450 nm處的吸光值，計算出MDA濃度。

1.3.4 葉綠素熒光參數(shù)qP和NPQ測定采用掌上水體葉綠素熒光儀（型號Aqua Pen-PAP-P100）連續(xù)測量，每次測定前暗處理15 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對小球藻細胞分裂增殖的影響

實驗第9天，從實驗組和對照組中層水體分別取1 mL藻液，同倍率顯微鏡下統(tǒng)計每組樣品10個視野中普通小球藻細胞數(shù)，并觀察分裂增殖狀況，結(jié)果取平均值。由圖1可知，視野中可見的普通小球藻細胞數(shù)目隨著鹽度的升高逐漸減少：當水體鹽度為1 g·L-1時，普通小球藻的數(shù)目與對照組近似相同，藻細胞體積幾乎未發(fā)生變化，這表明1 g·L-1的鹽度幾乎不影響普通小球藻的細胞分裂及增殖；而鹽度升高至3 g·L-1時，普通小球藻的數(shù)目與對照組相比略有減少，藻細胞體積縮小，表明3 g·L-1的鹽度已開始對小球藻的細胞分裂與增殖產(chǎn)生一定程度的影響；而當鹽度升高至5 g·L-1時，視野中細胞數(shù)目顯著減少，藻細胞體積也明顯縮小，表明5 g·L-1的鹽度對普通小球藻細胞的分裂及增殖產(chǎn)生抑制作用，并顯著影響細胞體積。

圖1 不同鹽度下的細胞數(shù)及細胞分裂圖Fig.1 Cells amount and division in different salinity

圖1中成對出現(xiàn)的藻細胞視為正在分裂的細胞，單個存在的藻細胞視野為未進行分裂的細胞。統(tǒng)計不同視野中正在分裂的藻細胞占藻細胞總量的比例，結(jié)果（表1）表明：在對照組和鹽度1、3、5 g·L-1的實驗組中，普通小球藻細胞分裂比例分別為77%、33%、18%、1.1%；隨著鹽度升高，普通小球藻細胞分裂比例呈顯著下降趨勢，當鹽度升高至3 g·L-1時，藻細胞分裂比例小于20%，當鹽度升高至5 g·L-1時藻細胞幾乎停止分裂，這些結(jié)果表明水體鹽度升高能明顯抑制藻細胞分裂增殖，改變細胞生長周期。

表1 不同鹽度下普通小球藻細胞相對分裂比例Table 1 Divide ratio of Chlorella vulgaris cells under different salinity

2.2 鹽度對小球藻葉綠素a合成的影響

葉綠素a的合成量可間接表征普通小球藻的生長代謝情況，各組葉綠素a的初始濃度均為0.88 mg·L-1，實驗第9天測量各實驗組和對照組藻溶液中葉綠素a的最終濃度（圖2）。

圖2 試驗期末處理組葉綠素a的最終濃度Fig.2 Comparison of final concentration of chlorophyll-a

葉綠素a最終濃度隨著鹽度升高降低。在試驗第9天，對照組葉綠素a最終濃度為1.28 mg·L-1，與試驗第1天相比增長了約36.2%，表明在水體鹽度不改變條件下，藻溶液中葉綠素a不斷合成累積。然而，在試驗第9天，發(fā)現(xiàn)鹽度為1、3和5 g·L-1時葉綠素a最終濃度相比于對照組分別減少5.30%、21.96%和28.03%，說明水體鹽度越高，普通小球藻葉綠素a合成量越少。尤其當鹽度達到5 g·L-1時，葉綠素a最終濃度僅為0.92 mg·L-1，與葉綠素a初始濃度0.88 mg·L-1相近，幾乎未累積，這表明鹽度越高對普通小球藻葉綠素a合成過程的抑制越強，鹽度達到5 g·L-1時合成過程幾乎停止，藻細胞的生長代謝受到抑制。

試驗第1～9天各組葉綠素a濃度隨時間的變化情況如圖3所示：隨著水體鹽度升高，葉綠素a濃度的累積速率逐漸變緩。實驗初期的1～2 d，各組葉綠素a濃度差異不大，均在0.85～0.95 mg·L-1范圍內(nèi)，各組葉綠素a的增長率大致相等，約為0.05～0.06 mg·L-1·d-1。實驗中后期各組表現(xiàn)因鹽度不同而出現(xiàn)較大差異，鹽度1 g·L-1時，葉綠素a濃度持續(xù)增長，增長率與對照組相當，僅在濃度值上略低于對照組；而當鹽度高于3g·L-1時，葉綠素a濃度在實驗第7～9 d維持在0.9～1.0 mg·L-1左右不再增長，這說明鹽度增加能明顯抑制普通小球藻葉綠素a合成，進而抑制細胞生長。

圖3 不同鹽度下葉綠素a濃度變化過程Fig.3 Change of chlorophyll-a concentration in different salinity

2.3 鹽度對小球藻抗氧化指標的影響

2.3.1 丙二醛丙二醛（malondialdehyde，MDA）是脂膜氧化的最重要產(chǎn)物之一，MDA含量越高表明脂膜過氧化程度也越高，細胞組織破壞程度越大，對其增殖影響也越大。在實驗第9天，不同鹽度條件下普通小球藻細胞內(nèi)MDA的平均含量如圖4所示：與對照組相比，當水體鹽度升高后普通小球藻細胞內(nèi)MDA含量顯著升高，兩者呈正相關(guān)。實驗第9天，對照組MDA平均含量較低，約0.004 mmol·mL-1；鹽度為1 g·L-1時MDA平均含量略有升高，約0.012 mmol·mL-1；而當鹽度升高至3或5 g·L-1時，細胞內(nèi)MDA平均含量顯著升高，分別 達 到了0.028 mmol·mL-1和0.04 mmol·mL-1，其中鹽度5 g·L-1時MDA平均含量約為對照組的10倍。細胞內(nèi)MDA平均含量大幅升高，反映出細胞膜已發(fā)生劇烈的脂膜氧化反應(yīng)并產(chǎn)生自由基，表明水體鹽度升高會在一定程度上損害藻細胞組織結(jié)構(gòu)，抑制細胞生長代謝，這也側(cè)面印證了普通小球藻增殖減緩以及葉綠素a變化趨勢形成的原因。

圖4 不同鹽度下MDA平均含量變化Fig.4 Average content of MDA under different salinity

2.3.2 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是植物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，其變化可表征植物體對環(huán)境惡化時產(chǎn)生活性氧的響應(yīng)，從而使其逐步適應(yīng)環(huán)境變化［17］。實驗期間普通小球藻在不同鹽度條件下細胞內(nèi)SOD比活性的變化趨勢如圖5所示：由圖5可以看出，對照組藻細胞的SOD比活性基本在0.01上下波動；與對照組相比，鹽度升高使藻細胞內(nèi)SOD比活性升高，總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢；且鹽度越高SOD比活性上升速率越快，達到峰值的時間越短。在5 g·L-1的鹽度條件下，SOD比活性在第4天達到峰值；在1 g·L-1和3g·L-1的鹽度條件下，SOD比活性滯后于5 g·L-1實驗組1 d達到峰值，且峰值時SOD比活性大小依次為為5 g·L-1>3 g·L-1>1 g·L-1>對照組。SOD比活性越高表明鹽度增加造成的藻細胞膜氧化越嚴重，藻細胞在高鹽度下被破壞可能是細胞分裂增殖速率下降的直接原因，這在Mostafa等［18］對螺旋藻的研究中也得到證實。

圖5 不同鹽度下SOD酶比活性變化Fig.5 The change of SOD specific activity under different salinity

2.4 鹽度對小球藻光合作用的影響

葉綠素熒光動力學(xué)在探索植物光合效應(yīng)方面有著廣泛應(yīng)用［19］，其中光化學(xué)淬滅系數(shù)qP和非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ是反應(yīng)植物光合作用過程的重要動力學(xué)參數(shù)；前者反映了光合活性的高低和反應(yīng)中心的開放程度，后者反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，體現(xiàn)了植物的光保護能力。實驗過程中對照組與處理組的qP值以及NPQ值變化如圖6和圖7所示。

由圖6可知，對照組普通小球藻的qP值（光合活性）平穩(wěn)升高，與對照組中藻細胞持續(xù)增殖的狀態(tài)吻合；而實驗組普通小球藻的qP值則逐漸降低，且鹽度越高下降速率越快，這說明細胞內(nèi)光合活性處于衰減狀態(tài)，且反應(yīng)中心的開放程度也隨著鹽度升高而降低。特別是當鹽度達到3 g·L-1以上時，藻細胞的光合活性下降趨勢尤為顯著，細胞內(nèi)光合活性衰減直接導(dǎo)致光合作用的減弱，使對照組細胞分裂增殖減慢及葉綠素a合成量減少。

圖6 不同鹽度下光化學(xué)淬滅系數(shù)qP的變化Fig.6 Change of photochemical quenching coefficient qP under different salinity

由圖7可知，對照組的NPQ值保持穩(wěn)定，基本在0.125附近浮動；而實驗組的NPQ值隨時間延長逐漸增大，且鹽度越高增長的速率越快，NPQ值也越大。實驗第8天，鹽度為1 g·L-1時NPQ值接近0.625，鹽度≥3 g·L-1時NPQ值超過1.25，是鹽度1 g·L-1時的2倍。當鹽度超過3 g·L-1時，NPQ值成倍升高，說明此時藻細胞不能用于光合電子傳遞，而是以熱的形式耗散掉這部分光能的增加，導(dǎo)致光合機構(gòu)破壞或失活，進而抑制光合作用，這也解釋了普通小球藻在鹽度升高時生長增殖減緩以及葉綠素a合成量減少的原因。

圖7 不同鹽度下非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ的變化Fig.7 Change of non-photochemical quenching coefficient NPQ under different salinity

3 討論

在全球氣候變化的影響下，內(nèi)陸水體鹽度緩慢升高的趨勢較為明顯，水體鹽度升高能夠一定程度上抑制普通小球藻生長代謝，主要表現(xiàn)為光合作用、葉綠素a合成速率、細胞內(nèi)酶活性降低等方面的影響。研究發(fā)現(xiàn)普通小球藻在鹽度為1 g·L-1的水體中，雖然實驗初期表現(xiàn)出環(huán)境脅迫，但經(jīng)過環(huán)境適應(yīng)后逐漸恢復(fù)生長和增殖水平。當鹽度達到3 g·L-1時，普通小球藻細胞葉綠素a的合成速率和細胞增殖速率都逐漸降低；通過對光化學(xué)淬滅系數(shù)qP和非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ的檢測及計算，發(fā)現(xiàn)鹽度升高造成光合作用反應(yīng)中心破壞及光合活性降低，因此鹽度升高能夠顯著抑制普通小球藻的生長代謝。任佳佳等［20］對波吉卵囊藻的研究也發(fā)現(xiàn)高鹽會降低電子傳遞的量子效率，導(dǎo)致高鹽組化學(xué)量子效率ΦPSⅡ值顯著降低，這與本研究中NPQ值的變化趨勢及結(jié)論吻合。同時，張國偉等［21］研究也發(fā)現(xiàn)，鹽度升高使植物細胞的光合結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致其細胞生長增殖等生理過程受到抑制。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著水體鹽度的升高，普通小球藻細胞內(nèi)MDA平均含量顯著升高，與鹽度呈正相關(guān)，表明普通小球藻細胞膜脂膜氧化作用隨著水體鹽度的升高逐漸加重。Meenakshi等［22］對鈍頂螺旋藻的相關(guān)研究結(jié)果也表明，水體中金屬離子含量升高時，鈍頂螺旋藻的MDA水平明顯上升。而隨著水體鹽度的升高，普通小球藻細胞內(nèi)SOD酶比活性卻表現(xiàn)出先升后降趨勢，鹽度越高SOD比活性上升速率越快，達到峰值的時間越短。孫妮等［23］研究柵藻發(fā)現(xiàn)，鹽（NaCl）脅迫顯著影響柵藻抗氧化物酶SOD和CAT活性，二者均隨脅迫程度的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與本研究的結(jié)果類似，推測可能是由于藻細胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)功能失衡，使藻細胞失去對鹽度脅迫的靈敏性。

隨著氣候的變化，內(nèi)陸水體鹽度持續(xù)升高，水體環(huán)境嚴重惡化，當水體鹽度超過5 g·L-1時內(nèi)陸水體中普通小球藻群落密度可能逐漸減小。普通小球藻對水體鹽化的適應(yīng)性弱，若在水體鹽化趨勢難以逆轉(zhuǎn)的背景下，淡水藻體系可能由多藻體系轉(zhuǎn)變?yōu)槟望}藻體系，生態(tài)系統(tǒng)的多樣性很可能逐漸喪失，進而引發(fā)食物鏈的多樣性變化，因此需引起人類廣泛重視。同時，本研究僅探究了鹽度升高對純種淡水藻類的脅迫作用，而缺少鹽脅迫條件下多種混合藻類間的競爭關(guān)系研究，下一步將對混合藻種的鹽脅迫進行探究。