薛晶晶，安飛飛，羅秀芹，蔡杰

中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571131

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)是一種RNA介導(dǎo)的植物天然抗病毒技術(shù)，主要利用遺傳免疫操作系統(tǒng)性沉默某一特定基因，再經(jīng)過(guò)表型鑒定和基因表達(dá)確定靶基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用及對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生的應(yīng)激響應(yīng)［1］。VLGS技術(shù)能夠利用攜帶靶基因片段的病毒侵染植物，激活植物免疫系統(tǒng)，使其體內(nèi)與靶基因同源的RNA被特異性降解，從而發(fā)生基因沉默［2］。VIGS技術(shù)操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備要求低且無(wú)需進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，但只有遺傳后代純合后才能進(jìn)行深入的基因功能分析。VIGS發(fā)生在RNA轉(zhuǎn)錄后，可以大大縮短對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因進(jìn)行功能驗(yàn)證所需要的時(shí)間［3-4］。VIGS對(duì)于研究獲得突變體較難的作物優(yōu)勢(shì)突出。通過(guò)VIGS可以闡明調(diào)控器官發(fā)育、次生代謝及植物對(duì)生物和非生物脅迫響應(yīng)等許多基因的功能［5］。

木薯（Manihot esculentaCrantz）是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的糧食作物［6］。隨著木薯產(chǎn)量的提升和研究技術(shù)創(chuàng)新，它不僅是重要的糧食作物，也可作為一種工業(yè)和生物燃料，在一些國(guó)家用于生產(chǎn)工業(yè)淀粉和乙醇［7］。木薯遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)較成熟［8-9］，它可以通過(guò)穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化用于RNA干擾和基因編輯驗(yàn)證基因功能［10-13］，但其遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，并不適用于所有的木薯基因型［9］。因此，VIGS可作為一種方便快捷的方法應(yīng)用于木薯基因功能的驗(yàn)證。Zhang等［14］通過(guò)VIGS驗(yàn)證了木薯4個(gè)MeLRR基因?qū)am的抗性來(lái)正向調(diào)控木薯白葉枯病。Beyene等［15］發(fā)現(xiàn)MeAPL3是木薯貯藏根淀粉和干物質(zhì)積累的關(guān)鍵亞型。He等［16］驗(yàn)證了異源三聚體NF-Y轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物能夠正調(diào)控木薯對(duì)Xam的抗病性。

本研究基于木薯花葉病毒（Cassava common mosaic virus，CsCMV）的VIGS載體構(gòu)建木薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mesweet18的沉默載體pCsCMV-Mesweet18，注射木薯SC9的盆栽苗葉片；通過(guò)植株的表型觀察、qRT-PCR分析、葉綠素含量及可溶性糖含量測(cè)定，研究Mesweet18在木薯中的分子功能，以期為進(jìn)一步研究糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEET在木薯中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)品種為木薯SC9，生長(zhǎng)于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃。

1.2 方法

1.2.1 木薯Mesweet18沉默片段的獲得利用SGN VIGS工具選擇木薯Mesweet18基因沉默的靶基因區(qū)域［17］，序列片段長(zhǎng)300 bp，根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)引物（表1）。參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）的操作說(shuō)明提取木薯SC9葉片總RNA，用DNAse I柱上消化RNA樣品中殘留的微量DNA。cDNA第一鏈的合成參照Thermo Scientific RevertAid RT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表1 研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

1.2.2 木薯Mesweet18沉默載體的構(gòu)建Mesweet18基因片段擴(kuò)增回收后，采用Nimble Cloning試劑盒將目的片段和pCsCMV-NC載體進(jìn)行連接，具體操作過(guò)程參照Tuo等［18］的方法和試劑盒說(shuō)明書(shū)，連接產(chǎn)物采用熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞。PCR篩選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，序測(cè)正確的載體即為VIGS所需的重組沉默載體pCsCMV-Mesweet18。

1.2.3 農(nóng)桿菌注射將沉默載體pCsCMVMesweet18通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，在卡那霉素（50μg·mL-1）和利福平（25μg·mL-1）抗性條件下篩選轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定呈陽(yáng)性的克隆菌液即為本試驗(yàn)所需的農(nóng)桿菌單克隆。

得到VIGS所需的pCsCMV-Mesweet18重組載體農(nóng)桿菌后，在帶有抗性的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.8～1.0，農(nóng)桿菌注射方法參照Tuo等［18］進(jìn)行。在生長(zhǎng)20 d的木薯SC9盆栽苗葉片背面進(jìn)行注射。為了驗(yàn)證VIGS沉默體系，設(shè)計(jì)如下試驗(yàn)：陰性對(duì)照組木薯注射pCsCMV-NC空載體，陽(yáng)性對(duì)照組注射pCsCMV-CHLD載體；實(shí)驗(yàn)組注射pCsCMV-Mesweet18載體；空白對(duì)照組木薯不做任何處理。20 d后開(kāi)始觀察木薯新生葉片生長(zhǎng)情況。

1.2.4 木薯Mesweet18沉默效果檢測(cè)運(yùn)用RTPCR技術(shù)檢測(cè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組目的基因的轉(zhuǎn)化情況，得到的目的條帶進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。qRT-PCR法檢測(cè)測(cè)序正確的株系中Mesweet18的表達(dá)水平，木薯Actin基因作為內(nèi)參，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 木薯Mesweet18沉默植株中葉綠素含量和可溶性糖含量的檢測(cè)采用分光光度計(jì)法測(cè)定葉綠素含量，取0.1 gMesweet18沉默植株上第二片展開(kāi)葉，將葉片剪成2 mm寬的碎條放入試管中，加入15 mL乙醇-丙酮混合液，避光放置24 h，期間晃動(dòng)3～5次，等葉片變白后定容至25 mL。以混合液為空白對(duì)照，分別在波長(zhǎng)663、645 nm下讀取吸光值并計(jì)算葉綠素含量，設(shè)置3次重復(fù)，取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［19］。計(jì)算公式如下：Cha=12.7D663-2.69D645；Chb=22.9D645-4.68D663；Cht=Cha+Chb=20.2D645+8.02D663。Cha、Chb分別為葉綠素a、b的含量；Cht為葉綠素總含量。采用試劑盒檢測(cè)植物中淀粉、蔗糖、果糖和葡萄糖的含量，具體方法參照說(shuō)明書(shū)（Solarbio公司）。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，使用GraphPad Prism5對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Dunnett's檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯Mesweet18沉默植株的獲得

利用pCsCMV載體的通用引物對(duì)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（pCsCMV-NC）、陽(yáng)性對(duì)照組（pCsCMV-CHLD）以及實(shí)驗(yàn)組株系進(jìn)行檢測(cè)（圖1），結(jié)果顯示：空白對(duì)照無(wú)條帶，陰性對(duì)照在1 000 bp處有條帶，轉(zhuǎn)化成功的植株在670 bp處有1條目的條帶。對(duì)不同處理下木薯植株的表型觀察發(fā)現(xiàn)（圖2），木薯實(shí)驗(yàn)組Mesweet18沉默植株的新葉與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組差異明顯，呈現(xiàn)明顯的花葉。

圖2 木薯Mesweet18沉默植株表型觀察Fig.2 Phenotypic observation of cassava Mesweet18 silenced plants

2.2 Mesweet18在木薯沉默植株的表達(dá)分析

qRT-PCR檢測(cè)pCsCMV-Mesweet18沉默植株表達(dá)水平的變化（圖3），發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組-1，2，3沉默植株Mesweet18的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的46.80%、30.23%、21.12%。這 一 結(jié) 果 表 明pCsCMVMesweet18可以高效沉默木薯Mesweet18基因的表達(dá)。

圖3 木薯Mesweet18沉默植株的表達(dá)水平分析Fig.3 Expression level analysis of cassava Mesweet18 silenced plants

2.3 木薯Mesweet18沉默植株中葉綠素和可溶性糖含量的測(cè)定

沉默糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mesweet18的表達(dá)可能影響木薯中糖的運(yùn)輸，從而影響葉片中葉綠素和可溶性糖的含量。測(cè)定實(shí)驗(yàn)組-1、2、3沉默后植株成熟葉片的葉綠素a、b及葉綠素總含量（圖4），發(fā)現(xiàn)葉綠素a、b及葉綠素總含量與對(duì)照相比均出現(xiàn)不同程度的下降，其中葉綠素a的含量在實(shí)驗(yàn)組-1、2、3中分別下降了22.43%、10.91%、12.24%；葉綠素b的含量在實(shí)驗(yàn)組-1，2，3中分別下降了22.42%、10.03%、12.09%；葉綠素總含量在實(shí)驗(yàn)組-1、2、3中 分 別 下 降 了22.35%、10.68%、12.28%。對(duì)可溶性糖含量的分析發(fā)現(xiàn)（圖4）：與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組-1、2、3沉默后植株葉片的淀粉和葡萄糖含量無(wú)顯著差異；實(shí)驗(yàn)組-1沉默的植株中蔗糖和果糖含量無(wú)顯著差異，而實(shí)驗(yàn)組-2、3沉默后植株葉片的蔗糖和果糖含量顯著上升，且果糖含量顯著高于蔗糖。所有植株的葡萄糖含量均少于蔗糖和果糖，這表明木薯Mesweet18主要影響果糖的含量。

圖4 木薯Mesweet18沉默植株葉片中葉綠素和可溶性糖含量分析Fig.4 Analysis of chlorophyll and soluble sugar content in cassava Mesweet18 silenced plants

3 討論

應(yīng)用VIGS技術(shù)能夠有效沉默植物中的目標(biāo)基因，不需要通過(guò)轉(zhuǎn)基因株系和大量突變體鑒定，因而在研究與發(fā)育相關(guān)的基因上具有優(yōu)勢(shì)，是植物苗期基因功能鑒定的最佳手段［20］。通過(guò)VIGS技術(shù)沉默草莓的FaABI1和FaMYB5基因，發(fā)現(xiàn)其沉默效率均達(dá)到60%以上，前者沉默后導(dǎo)致果實(shí)提前成熟，后者導(dǎo)致果實(shí)中原花青素含量增加，在草莓中起負(fù)調(diào)控作用［21-22］。本研究采用了基于CsCMV的VIGS載體，在木薯中沉默效果較好，適用于對(duì)CsCMV敏感的木薯品系［18］。在木薯SC9中沉默表達(dá)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mesweet18后，發(fā)現(xiàn)沉默植株中Mesweet18的表達(dá)分別下降了53.2%、69.8%、78.9%，這表明Mesweet18在SC9中的表達(dá)受到抑制，CsCMV-VIGS系統(tǒng)能夠成功沉默SC9中Mesweet18的表達(dá)。

糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEET主要作用于質(zhì)外體裝載途徑，能夠?qū)⒐夂献饔煤铣傻恼崽怯身g皮部薄壁細(xì)胞卸出到質(zhì)外體空間。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，Mesweet18在木薯中主要轉(zhuǎn)運(yùn)果糖。VIGS系統(tǒng)沉默Mesweet18后，葉片果糖含量顯著高于蔗糖和葡萄糖，且pCsCMV-Mesweet18-2、3沉默后植株中果糖和蔗糖的含量呈上升趨勢(shì)；而與對(duì)照相比，pCsCMV-Mesweet18-1沉默后植株葉片的蔗糖、葡萄糖和果糖含量沒(méi)有顯著差異，這可能是在基因沉默和糖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中造成的沉默植株的淀粉和葡萄糖含量無(wú)顯著變化。抑制木薯SC9中Mesweet18的表達(dá)，能夠影響成熟葉片可溶性糖的 積 累。Ho等［23］利 用VIGS技 術(shù) 沉 默 番 茄 中SlSWEET1a基因，發(fā)現(xiàn)成熟葉片中己糖含量增加了2倍多，表明SLSWEET1a在番茄成熟葉片合成糖分向幼葉轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。這一結(jié)果與木薯SC9中Mesweet18沉默后葉片的糖含量變 化 趨 勢(shì) 一 致。Schachtsiek等［24］通 過(guò)CLCrVVIGS系統(tǒng)成功沉默了大麻中的ChlI和PDS基因，發(fā)現(xiàn)大麻葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量均降低，這與本研究中沉默Mesweet18的表達(dá)可以下調(diào)葉片中葉綠素a、b和總含量的結(jié)果相類(lèi)似。

基于CsCMV的VIGS載體用于木薯沉默基因表達(dá)，獲得的植株表型可以維持4～6個(gè)月［18］。通過(guò)VIGS技術(shù)沉默木薯中Mesweet18的表達(dá)，將沉默植株移栽大田4個(gè)月后收獲葉片和塊根，研究幼嫩葉片、成熟葉片以及塊根中的淀粉和糖含量變化趨勢(shì)，明確了糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mesweet18在木薯中的功能，本研究獲得的結(jié)果可以為木薯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEET的分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。