朱佳夢，江海洋，陳茹梅，周曉今*

1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230000；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081

凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay， EMSA），或稱凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)，是一種廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可對核酸序列特異性結(jié)合蛋白進(jìn)行定性與定量分析。20世紀(jì)80年代，凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用在體外研究蛋白與DNA結(jié)合［1-4］，之后幾經(jīng)發(fā)展，逐漸被應(yīng)用于蛋白與RNA結(jié)合的研究中［5-7］。其中，最早在EMSA實(shí)驗(yàn)中使用的是放射性同位素標(biāo)記探針，常用的放射性核素有32P、3H和35S等［8-9］，但是放射性同位素存在輻射危害，并且有半衰期限制和放射性自顯影檢測時(shí)間長等不足，所以放射性同位素標(biāo)記探針的方式逐漸被其他標(biāo)記方式所替代。近年來EMSA實(shí)驗(yàn)多使用生物素標(biāo)記探針［10-12］，生物素標(biāo)記在進(jìn)行蛋白與探針結(jié)合前需要使用試劑盒標(biāo)記探針，在電泳結(jié)束后還需要進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和免疫反應(yīng)，然后才能進(jìn)行發(fā)光檢測，實(shí)驗(yàn)整體耗時(shí)較長。熒光標(biāo)記探針相較于放射性同位素標(biāo)記更安全，并且相比生物素標(biāo)記更加簡便和高效，但熒光探針存在價(jià)格高和易聚集等問題。

Opaque2（O2）是種子發(fā)育過程中調(diào)控貯藏物質(zhì)積累的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［13］，它可直接或間接與其他蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)zein基因的表達(dá)［14-16］。同時(shí)O2作為核心因子，通過轉(zhuǎn)錄激活蔗糖合成酶基因Sh1、Sus1和Sus2的表達(dá)，增加胚乳灌漿期間蛋白質(zhì)和淀粉合成的代謝源［17-18］。因此，O2蛋白通過影響醇溶蛋白和氮、碳代謝，在玉米胚乳發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ZmGRAS11是GRAS家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其表達(dá)由O2直接調(diào)控在胚乳灌漿過程中促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)張，正向調(diào)控玉米籽粒的增大［19］。本實(shí)驗(yàn)主要使用熒光標(biāo)記探針，通過EMSA實(shí)驗(yàn)探究O2與ZmGRAS11啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，為深入理解O2-Zm-GRAS11轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊的作用機(jī)理提供依據(jù)，同時(shí)探索熒光標(biāo)記法EMSA的可行性與便利性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料KOD one Mix購自東洋紡公司；限制性內(nèi)切酶、Infusion克隆試劑盒購自賽默飛公司；大腸桿菌Fast-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自諾唯贊公司；Rosetta（DE3）Competent Cell購自康為世紀(jì)公司；不含EDTA的cOmpleteTMMini蛋白酶抑制劑混合物購自Roche公司；Ni-NTA Agarose購自天根公司；無填料層析柱購自紐英倫生物技術(shù)有限公司；Amicon?Ultra-15離心過濾裝置購自默克公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒購自索萊寶公司；30%Acr-Bis（29∶1）、Ammonium persulfate substitute（APS substitute）、TEMED、5×EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液、10×EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無色）購自碧云天公司；5'端FAM熒光標(biāo)記DNA探針、普通單鏈探針購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)試劑及配方1 mol·L-1IPTG、裂解緩沖液、洗雜緩沖液、洗脫緩沖液、1×置換緩沖液、5×TBE緩沖液的配方見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用到的試劑配方Table 1 Formulation of reagent used in this study

1.1.3 試驗(yàn)儀器PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳槽、Mini P-4小型垂直電泳槽、紫外可見分光光度計(jì)、恒溫?fù)u床、離心機(jī)、超聲破碎儀、多功能微孔板檢測儀、Tanon 5200 Multi多功能成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 pET28a-O2原核表達(dá)載體的構(gòu)建EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pET28a載體，PCR獲得O2開放閱讀框，引物：F-5'-TCGCGGATCCGAATTCATGCCGC CGACGACCC-3';R-5'-GGTGGTGGTGCTCGAGATACAT GTCCATGTGTATGGCCC-3'，酶 切 產(chǎn) 物 與PCR產(chǎn) 物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，利用Infusion克隆試劑盒重組獲得質(zhì)粒pET28a-Opaque2（圖1）。

圖1 pET28a-Opaque2原核表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of pET28a-Opaque2 prokaryotic expression vector

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Fast-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定后，送往北京博邁德基因技術(shù)有限公司測序。鑒定測序結(jié)果正確后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta（DE3）competent cell，在菌液中加入甘油保存于-80℃，即可短期使用進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.2 O2蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化pET28a-O2菌液在搖床中培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí)，將菌液等體積分裝到試管a～f中，分別加入不同體積的IPTG，16℃，150 r·min-1搖床培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)16 h，然后12 000 r·min-1離心收集菌體（表2）。利用SDSPAGE觀察不同濃度IPTG的誘導(dǎo)效果。

表2 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化條件Table 2 Optimization of IPTG concentration for recombinant protein expression

1.2.3 O2蛋白純化將菌液培養(yǎng)至OD600=0.5，使用最佳誘導(dǎo)濃度1.0 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，16℃，150 r·min-1搖床培養(yǎng)16 h，收集菌體。加入裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑重懸菌體，超聲破碎后離心保留上清，即獲得粗蛋白液。將粗蛋白液加入鎳柱中，含有His標(biāo)簽的O2蛋白可與Ni2+結(jié)合，然后加入5倍柱體積的洗雜緩沖液洗去雜蛋白，最后加入洗脫緩沖液洗脫獲得目的蛋白。將目的蛋白溶液加入超濾柱（Amicon Ultra-15離心過濾器）濃縮，同時(shí)使用置換緩沖液除去咪唑，獲得的高濃度純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，以確定O2蛋白純化效果。

1.2.4 O2蛋白濃度的測定根據(jù)Bradford法蛋白濃度測定試劑盒操作說明，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。

1.2.5ZmGRAS11啟動(dòng)子探針制備用超純水將單鏈探針稀釋至200μmol·L-1（表3），分別取等量的上下游探針混勻，使用PCR儀進(jìn)行聚合。退火后FAM標(biāo)記的雙鏈探針需要進(jìn)一步稀釋至10μmol·L-1工作濃度，用于競爭的探針不需要稀釋直接配置為n×母液。稀釋后的標(biāo)記探針需要用黑袋子包裹后-20℃保存。

表3 ZmGRAS11探針聚合所用引物Table 3 Probes in the ZmGRAS11 promoter

1.2.6 6% TBE凝膠的制備及預(yù)電泳配置6%TBE凝膠：5×TBE 1 mL，30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺（Acr-Bis）溶液2 mL，50%甘油0.5 mL，超純水6.44 mL，10%丙烯酰胺凝膠聚合催化劑（APS）50μL，N,N,N′,N′-四 甲 基 乙 二 胺（TEMED）10μL。將6%TBE灌入膠板中，室溫放置30 min待TBE凝膠完全凝固后開始預(yù)電泳，4℃，100 V，電泳1 h，電泳緩沖液為預(yù)冷的0.5×TBE緩沖液。

1.2.7 檢測不同蛋白與探針的比例對EMSA實(shí)驗(yàn)的影響為測定O2蛋白與ZmGRAS11啟動(dòng)子探針相互作用的最佳濃度，用不同濃度的O2蛋白與FAM熒光標(biāo)記的ZmGRAS11啟動(dòng)子探針進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)，各個(gè)泳道標(biāo)記探針的濃度為10μmol·L-1，根據(jù)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件，每個(gè)泳道的反應(yīng)體系按表4加入相應(yīng)試劑。

表4 不同蛋白與探針的比例設(shè)置Table 4 Different treatments of protein to probe ratio

1.2.8 檢測不同突變方式的競爭探針對EMSA實(shí)驗(yàn)的影響各個(gè)泳道標(biāo)記探針的濃度為10μmol·L-1，競爭探針的濃度為200μmol·L-1，根據(jù)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件，每個(gè)泳道的反應(yīng)體系按照表5加入相應(yīng)試劑混勻，室溫下孵育20 min。然后分別加入2μL熒光標(biāo)記探針，混勻，在室溫黑暗處孵育20 min。

表5 不同突變方式的競爭探針體系Table 5 Reaction system of competitive probes with different mutations

蛋白與探針結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，4℃100 V電泳1 h。電泳結(jié)束后，快速拆開電泳槽取出膠板，用去離子水沖洗表面后，將膠板迅速轉(zhuǎn)移至黑暗環(huán)境，用Image Reader軟件掃描信號，選擇激發(fā)波長492 nm激發(fā)熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體pET28a-O2的構(gòu)建

通過Infusion方法將Opaque2基因的開放閱讀框與pET28a載體骨架連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Fast-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定分別獲得5 712、854、143 bp的特異條帶，EcoRⅠ單酶切鑒定分別獲得5 855、854 bp的特異條帶，XbaⅠ單酶切鑒定獲得6 709 bp的特異條帶（圖2）。

圖2 pET28a-O2酶切鑒定電泳圖Fig.2 Enzyme digestion identification of pET28a-O2

2.2 蛋白濃度測定結(jié)果

EMSA實(shí)驗(yàn)之前，對濃縮后的O2蛋白進(jìn)行濃度測定。已知蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程，再依據(jù)測得的樣品OD值，計(jì)算樣品中O2蛋白的濃度。

由圖3可知，樣品稀釋16倍后測得的OD值為0.888，依據(jù)線性回歸方程y=2.040 7x+0.596 2（R2=0.991 6），計(jì)算出樣品中蛋白濃度為2.232μg·μL-1。

圖3 蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve for protein quantification

2.3 蛋白與探針的比例對EMSA實(shí)驗(yàn)的影響

使用波長為492 nm的藍(lán)色激發(fā)光激發(fā)熒光，結(jié)果顯示（圖4），在泳道1體系中只加入FAM熒光標(biāo)記的ZmGRAS11探針后未發(fā)生阻滯現(xiàn)象，泳道2～8體系中，隨著O2蛋白加入量的不斷增大，阻滯逐漸增強(qiáng)。泳道2中加入1.1μg的O2蛋白可形成微弱的阻滯條帶，泳道5中加入8.9μg的O2蛋白有明顯的阻滯條帶，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇8.9 μg O2蛋白的加入量進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4 EMSA檢測不同濃度O2蛋白與ZmGRAS11探針的結(jié)合Fig.4 The binding of O2 protein with ZmGRAS11 probe was detected by EMSA

2.4 不同突變方式的競爭探針對EMSA實(shí)驗(yàn)的影響

為進(jìn)一步探究ZmGRAS11啟動(dòng)子區(qū)GCN4 motif與O2蛋白結(jié)合中起主要作用的堿基，本研究對GCN4 motif序列進(jìn)行多種方式的突變，合成了突變探針M1～M6，通過突變探針與FAM熒光標(biāo)記探針競爭結(jié)合O2蛋白，分析GCN4 motif序列的各種突變對ZmGRAS11啟動(dòng)子區(qū)探針與O2蛋白結(jié)合能力的影響。

首先，通過在泳道2中加入熒光標(biāo)記的野生型ZmGRAS11探針和O2蛋白設(shè)置陽性對照，結(jié)果出現(xiàn)阻滯條帶，表明O2蛋白可以結(jié)合野生型Zm-GRAS11探針（圖5B，泳道2）。其次，為證實(shí)未標(biāo)記的野生型ZmGRAS11探針能與標(biāo)記的探針競爭結(jié)合O2蛋白，在泳道2體系的基礎(chǔ)上，泳道3、4加入了相較于熒光標(biāo)記探針50倍和100倍的未標(biāo)記探針，結(jié)果顯示阻滯條帶消失，進(jìn)一步證實(shí)了野生型ZmGRAS11探針可與O2蛋白結(jié)合。為證實(shí)GCN4 motif序列是影響ZmGRAS11啟動(dòng)子區(qū)與O2蛋白結(jié)合的關(guān)鍵序列，設(shè)計(jì)了3種突變探針M1～M3，分別將GCN4 motif序列刪除、全部突變成“T”和“G”，將探針分別加入了泳道5、6、7，結(jié)果顯示泳道5、6中阻滯條帶仍存在，證實(shí)了GCN4 motif序列是影響ZmGRAS11啟動(dòng)子區(qū)與O2蛋白結(jié)合的關(guān)鍵序列，泳道7中未出現(xiàn)阻滯條帶，表明GCN4 motif序列不同的突變方式對其結(jié)合能力有不同的影響。最后，為分析GCN4 motif序列的各個(gè)堿基對ZmGRAS11啟動(dòng)子區(qū)探針與O2蛋白結(jié)合能力的影響，設(shè)計(jì)了3種突變探針M4～M6，分別突變了GCN4 motif序列的左三、中三和右三堿基，將探針分別加入了泳道8、9、10，結(jié)果顯示泳道8、9中出現(xiàn)了阻滯條帶，泳道10中未出現(xiàn)阻滯條帶，表明GCN4 motif序列的7個(gè)堿基在與O2蛋白的結(jié)合過程中起到了不同的影響。

圖5 不同方式突變對ZmGRAS11探針和O2蛋白結(jié)合力的影響Fig.5 Effects of different mutations on the interaction between the ZmGRAS11-promorer probe and O2 protein

3 討論

凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)是一種快速且靈敏檢測蛋白質(zhì)—核酸相互作用的實(shí)驗(yàn)方法，其原理是當(dāng)目的蛋白與標(biāo)記探針混合孵育后，會形成蛋白質(zhì)—核酸復(fù)合物，而蛋白質(zhì)—核酸復(fù)合物的電泳遷移率通常小于游離核酸的電泳遷移率，所以在非變性凝膠上會出現(xiàn)阻滯帶，從而可以證實(shí)蛋白質(zhì)與核酸互作［20-22］。相較于放射性同位素和生物素標(biāo)記來說，熒光標(biāo)記探針更為安全、穩(wěn)定、簡便，一次標(biāo)記可長期貯存和使用。通過6%TBE凝膠只需要在電泳結(jié)束之后使用凝膠成像系統(tǒng)掃描信號，即可獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)步驟從菌體破碎至EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)束，整個(gè)流程只需2 d即可完成，不僅大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，而且降低了出現(xiàn)失誤導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的概率。近年來，雖然熒光標(biāo)記探針因?yàn)槠鋬?yōu)越性被廣泛應(yīng)用于EMSA實(shí)驗(yàn)中［23］，但是一直缺少一份系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)流程總結(jié)，本文對熒光標(biāo)記的EMSA技術(shù)流程進(jìn)行了優(yōu)化和系統(tǒng)總結(jié)，可為蛋白—核酸互作研究提供技術(shù)支撐［24-25］。

凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要特別注意的事項(xiàng)有以下幾點(diǎn)：①熒光標(biāo)記探針需避光放置，適宜分裝保存于-80℃，使用時(shí)于冰上融化；②根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)來確定電泳緩沖液的pH，且pH需要大于等電點(diǎn)，否則蛋白難以進(jìn)入凝膠；③實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)盡量輕柔，以避免破壞蛋白結(jié)構(gòu)。

已有研究表明，O2蛋白與ZmGRAS11啟動(dòng)子區(qū)的GCN4 motif序列結(jié)合［19］，我們前期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)對競爭探針進(jìn)行GCN4 motif序列刪除突變后，該探針將無法與標(biāo)記的ZmGRAS11啟動(dòng)子區(qū)探針競爭結(jié)合O2蛋白。本研究通過固定熒光標(biāo)記探針的加入量，梯度改變蛋白的加入量，以確定在EMSA實(shí)驗(yàn)中蛋白與探針結(jié)合的適宜比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提高蛋白的濃度能夠優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是進(jìn)一步提高蛋白濃度達(dá)到“飽和”后并不能增強(qiáng)EMSA的阻滯條帶，因此蛋白與探針的適宜比例為8∶1［26］。本研究為進(jìn)一步探究ZmGRAS11啟動(dòng)子區(qū)GCN4 motif序列中7個(gè)堿基與O2蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，對競爭探針GCN4 motif序列進(jìn)行不同方式的突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同的突變方式會讓Zm-GRAS11啟動(dòng)子區(qū)探針與O2蛋白的結(jié)合能力發(fā)生變化［27-29］。競爭探針M6的突變方式是將GCN4 motif序列右側(cè)3個(gè)堿基突變，保留左側(cè)4個(gè)堿基“TGAC”，此種突變方式未出現(xiàn)阻滯條帶，提示GCN4 motif序列中的“TGAC”堿基序列可能在與O2蛋白結(jié)合過程中起主要作用。有研究認(rèn)為，ZmGRAS11啟動(dòng)子區(qū)域在GCN4 motif上游10 bp處存在GCN4-like motif序列，該序列同樣與O2蛋白有微弱的結(jié)合能力［30］。根據(jù)此研究結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GCN4-like motif序列中也存在與GCN4 motif序列中相同的“TGAC”堿基序列，所以我們認(rèn)為GCN4-like motif序列能與O2蛋白結(jié)合也可能是因?yàn)槠浯嬖凇癟GAC”堿基序列。

本研究基于O2-ZmGRAS11調(diào)控模塊，用熒光標(biāo)記ZmGRAS11探針進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，首先集成優(yōu)化了EMSA實(shí)驗(yàn)流程；其次確定了蛋白與探針的適宜比例為8∶1；最后確定了ZmGRAS11啟動(dòng)子區(qū)GCN4 motif序列中“TGAC”4個(gè)堿基可能是與O2蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究O2-Zm-GRAS11轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊在玉米籽粒發(fā)育中的作用機(jī)理提供依據(jù)。