周水娟，郭忠建

江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000

隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，基因組信息已經(jīng)無法滿足人類對現(xiàn)有生命現(xiàn)象背后本質(zhì)的探索，蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的執(zhí)行者，它們之間復(fù)雜的相互作用在細(xì)胞生命活動(dòng)過程中起著重要的作用。在病毒感染宿主的過程中，其基因組編碼的蛋白質(zhì)發(fā)揮重要作用，因此，研究病毒蛋白之間或者病毒與宿主蛋白之間的相互作用對于揭示病毒感染宿主的分子機(jī)制十分重要。目前研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法有許多，如酵母雙雜交技術(shù)（yeast two-hybrid system）、免疫共沉淀技術(shù)（co-immunoprecipitation，Co-IP）、pull-down技術(shù)、蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析（protein complementation assay，PCA）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）試驗(yàn)、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET）試驗(yàn)等。雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是近二十年來興起的檢測蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于可視化蛋白質(zhì)互作的研究中。本文概述了BiFC技術(shù)的原理、發(fā)展、優(yōu)勢以及在動(dòng)物病毒和抗病毒藥物研究中的應(yīng)用，以期為未來動(dòng)物病毒致病機(jī)制的探索和抗病毒藥物的研發(fā)提供參考。

1 BiFC技術(shù)

1.1 BiFC的原理

熒光蛋白兩個(gè)β片層間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上有多個(gè)特異性位點(diǎn)可插入外源蛋白卻不影響其熒光活性，BiFC可利用這一特性，在合適的位點(diǎn)切割熒光蛋白，形成沒有熒光的N-端和C-端，分別與待研究的目標(biāo)蛋白融合表達(dá)。若目標(biāo)蛋白間發(fā)生相互作用，兩個(gè)不完整的熒光片段則相互靠近形成完整的有活性的熒光基團(tuán)，從而在激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)出熒光（圖1）；反之，則無熒光。熒光信號同時(shí)也能夠顯示目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中相互作用的定位。

圖1 BiFC技術(shù)的原理圖Fig.1 Principle of BiFC technology

1.2 BiFC技術(shù)中熒光蛋白的發(fā)展

熒光蛋白利用分裂后能夠融合且不改變熒光特性的優(yōu)勢在BiFC技術(shù)中被廣泛應(yīng)用，后續(xù)又開發(fā)出以光敏色素作為熒光標(biāo)記的BiFC技術(shù)。根據(jù)BiFC系統(tǒng)的發(fā)展歷程，結(jié)合Kodama等［1］的綜述總結(jié)用于BiFC的熒光蛋白和光敏色素繪制的發(fā)展進(jìn)程見圖2。

圖2 BiFC技術(shù)中熒光蛋白和光敏色素發(fā)展Fig.2 The development of fluorescent proteins and photochromes in BiFC

2000年，Ghosh等［2］在體外將兩個(gè)反平行的亮氨酸拉鏈融合到GFP的兩個(gè)非熒光片段上，初步證明了GFP具有熒光互補(bǔ)性。隨后多種熒光蛋白被應(yīng)用于BiFC技術(shù)中，如GFP衍生出的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）、增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白（enhanced yellowgreen fluorescent protein，EYFP）、增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白（enhanced blue fluorescent protein，EBFP）和增強(qiáng)型青色熒光蛋白（enhanced cyan fluorescent protein，ECFP）［2-4］。隨著GFP的發(fā)展，人們認(rèn)識到GFP及其衍生變體對環(huán)境的敏感性阻礙了生理?xiàng)l件下BiFC的應(yīng)用，因此，研究人員對熒光蛋白進(jìn)行了一系列突變，生成可在生理培養(yǎng)條件下產(chǎn)生明亮信號的熒光蛋白Venus、Citrine、Cerulean［5］。隨 后，綠 色熒 光亮 度 增強(qiáng) 的GFP變體frGFP［6］、GFP-S65T［7］被應(yīng)用于BiFC。Zhou等［8］拆分sfGFP 214和sfGFP 215之間的氨基酸殘基并對其進(jìn)行基因突變，有效減少了熒光蛋白的假陽性現(xiàn)象。2008年，與GFP具有相似光譜特征的珊瑚熒光報(bào)告蛋白mKG（單體Kusabira-Green）被開發(fā)用于BiFC［9］。2010年，能夠快速響應(yīng)光的新型GFP樣蛋白Dronpa被應(yīng)用于BiFC，克服了GFP變體的光漂白和量子產(chǎn)率低的問題［10］。

除了綠色、青色和黃色熒光蛋白及其變體應(yīng)用于BiFC外，紅色熒光蛋白因其波長范圍優(yōu)勢逐漸成為關(guān)注的對象。2006年，由單分子DsRED變體mRFP1突變形成的mRFP1-Q66T被應(yīng)用于BiFC［11］，隨 后，基 于mCherry的BiFC系 統(tǒng) 被 開發(fā)［12］，但這兩種紅色熒光蛋白只能在相對較低的溫度下工作，限制了BiFC在活體哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用。為此，2009年Chu等［13］首次將mKate應(yīng)用于更高溫度下基于紅色熒光蛋白的BiFC系統(tǒng)。同年，為改善紅色熒光蛋白的溫度敏感性及熒光強(qiáng)度，mKate-S158A變體mLumin［13］和TagRFP［14］被應(yīng)用于BiFC中。2014年，由mKate進(jìn)一步突變生成的首個(gè)激發(fā)峰值達(dá)到600 nm的明亮熒光蛋白Neptune［15］被應(yīng)用于BiFC。2018年，新開發(fā)的紅色熒光蛋白mScarlet-I［16］、Kusabira-Orange（KO）［17］在BiFC上得以應(yīng)用，進(jìn)一步優(yōu)化了熒光蛋白的特性。

與類GFP蛋白不同，光敏色素是細(xì)菌或植物中一種可吸收紅光和近紅外光的光受體［18］。2013年，基于細(xì)菌光敏色素的近紅外熒光蛋白iRFP（infra-red fluorescent protein）首 次 應(yīng) 用 于BiFC系統(tǒng)［19-20］。隨后，IFP1.4也被應(yīng)用于BiFC［21］，但它和iRFP的熒光強(qiáng)度均不高。2021年，開發(fā)了一種改進(jìn)的單體近紅外細(xì)菌光敏色素IFP2.0，增加了BiFC的信號強(qiáng)度［22］。同年，Chen等［23］開發(fā)了基于藍(lán)細(xì)菌色素的最小近紅外熒光互補(bǔ)系統(tǒng)—miRFP670nano，拓展了BiFC檢測的波長范圍，為其廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1.3 BiFC技術(shù)的優(yōu)勢

BiFC技術(shù)具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，使其在眾多研究蛋白質(zhì)相互作用的方法中脫穎而出。第一，簡易性和直觀性。報(bào)告基因的固有熒光使蛋白質(zhì)互作直接可視化而不依賴于二次檢測，因此只需配備熒光顯微鏡便可對相互作用的蛋白進(jìn)行成像分析，且能夠直觀反映互作在細(xì)胞中的定位。同時(shí)，熒光強(qiáng)度也可反映BiFC中兩個(gè)互作蛋白間的相互作用強(qiáng)度［24-25］。第二，BiFC技術(shù)可使蛋白間的相互作用在活細(xì)胞中可視化，省去了裂解或者固定細(xì)胞等繁瑣實(shí)驗(yàn)步驟且可以消除其帶來的潛在影響。第三，復(fù)合物的形成比較穩(wěn)定，可用于研究蛋白質(zhì)間微弱或瞬時(shí)的相互作用［24-25］。第四，蛋白質(zhì)在正常的細(xì)胞環(huán)境中表達(dá)，無需添加具有細(xì)胞毒性或擾亂細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的外源性底物［26］，其效果可與內(nèi)源性蛋白相媲美，幾乎可反映天然蛋白質(zhì)的性質(zhì)，包括翻譯后修飾的影響。第五，多種蛋白質(zhì)間相互作用可以使用光譜不同的熒光復(fù)合物并行可視化，即多色BiFC分析［27］。BiFC技術(shù)的優(yōu)勢使其成為檢測蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)大工具。

2 BiFC在動(dòng)物病毒研究中的應(yīng)用

BiFC幾乎適用于除專性厭氧生物外的各種細(xì)胞類型，加之簡單、快捷、靈敏且對細(xì)胞無侵害的特點(diǎn)，為BiFC的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。動(dòng)物病毒是一種寄生在人體或動(dòng)物體內(nèi)，能引起人和動(dòng)物疾病的強(qiáng)感染因子，在病毒入侵、增殖和傳播過程中，其依靠宿主編碼的蛋白質(zhì)發(fā)揮各項(xiàng)功能。利用BiFC技術(shù)研究動(dòng)物病毒侵染宿主過程中蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，對于探索動(dòng)物病毒與宿主間的相互作用，理解動(dòng)物病毒的生命周期，進(jìn)一步闡述其致病機(jī)制乃至設(shè)計(jì)與研發(fā)相關(guān)藥物和抑制劑都至關(guān)重要。

2.1 人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）

HIV是一種攻擊T淋巴細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒，根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和病毒核酸序列測定可分為人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和2型（HIV-2）兩種，其中HIV-1流行范圍更廣，研究也更加深入。HIV-I整合酶（HIV integrase，IN）是病毒將DNA整合到宿主基因中必不可少的病毒蛋白，這一過程通常需要將IN轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。2009年，Levin等［28］利用BiFC技術(shù)證實(shí)IN和importinα存在相互作用，表明IN的核輸入通過importinα途徑發(fā)生。隨著對IN入核機(jī)制的深入研究，Chen等［29］利用以光敏色素iRFP為熒光標(biāo)記的BiFC系統(tǒng)，可視化IN和人類晶狀體上皮衍生生長因子p75（LEDGF/p75）的相互作用，LEDGF/p75能夠輔助IN入核并且將其靶向宿主染色質(zhì)［30-31］。隨后Nakamura等［32］利用引入5個(gè)突變的Venus-BiFC系統(tǒng)進(jìn)一步闡明，多聚化的IN仍能與LEDGF/p75相互作用，進(jìn)而幫助HIV病毒將DNA整合到宿主染色體DNA中［33］。

作為HIV-1的輔助因子，負(fù)調(diào)控因子（negative factor，Nef）與HIV的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。先前的生化及結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)Nef功能的發(fā)揮需要其發(fā)生二聚化或者寡聚化［34-35］。直到2009年P(guān)oe等［36］的研究證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)，他們利用BiFC驗(yàn)證HIV感染宿主后，細(xì)胞內(nèi)Nef呈現(xiàn)二聚體形式。后續(xù)有研究利用BiFC證明Nef形成二聚體后可與IL-2誘導(dǎo)T細(xì)胞激酶（interleukin-2-inducible T-cell kinase，Itk）和布魯頓酪氨酸激酶（bruton tyrosine kinase，Btk）兩種Tec家族激酶相互作用，將Itk和Btk募集到細(xì)胞膜，越過正常免疫受體對Tec家族激酶活性的控制，自磷酸化直接激活組成型激酶［37］，導(dǎo)致病毒轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)（圖3）。2020年，Staudt等［38］利用BiFC檢測到二聚化后Nef的一個(gè)單體可能與絲氨酸結(jié)合子5（SERINC5）接觸，另一個(gè)與銜接蛋白-2（adaptin-2，AP-2）接合，形成Nef-SERINC5-AP-2復(fù)合物，在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下下調(diào)SERINC5，這與BiFC檢測出的CD4下調(diào)機(jī)制類似［39］。SERINC5和CD4均可阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，其下調(diào)增強(qiáng)了HIV-1的傳染性且有助于HIV逃避宿主免疫系統(tǒng)的捕捉。

圖3 Nef二聚體與Itk相互作用激活模型[37]Fig.3 Models of Nef-dimer mediated Itk activation[37]

除了可視化Nef自身發(fā)生的二聚化外，BiFC還用于研究Nef與多種宿主蛋白間的相互作用，如Nef和磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇選蛋白（phosphofurin acidic cluster sortingprotein，PACS）的相互作用破壞了宿主細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和膜運(yùn)輸，引起細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物I類（MHC-I）下調(diào)，從而導(dǎo)致病毒逃離免疫監(jiān)視［40］。Nef和宿主細(xì)胞膜運(yùn)輸調(diào)節(jié)蛋白SNX18的互作參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸，也可使病毒逃避宿主的免疫監(jiān)測［41］。最新研究發(fā)現(xiàn)，Nef與T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白3（T cell immunoglobulin and mucin-containing molecule 3，Tim-3）形成復(fù)合物，促進(jìn)Tim-3從細(xì)胞表面脫落［42］，導(dǎo)致受感染T細(xì)胞表面檢查點(diǎn)受體水平上調(diào)，加速T細(xì)胞的衰竭。

此外，BiFC還檢測到HIV感染時(shí)其他重要蛋白間的相互作用，如Env糖蛋白間相互作用及其與SERINC5的相互作用［43］，HIV-1輔助蛋白Vpu與Tim-3的相互作用［44］，HIV-1主要結(jié)構(gòu)蛋白Gag之間以及Gag和協(xié)調(diào)RNA干擾的宿主蛋白AGO2之間的相互作用［45］。這些相互作用的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，不僅為研究HIV感染宿主細(xì)胞的過程和分子機(jī)制提供了新見解，也為靶向抗病毒抑制劑的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

2.2 皰疹病毒

皰疹病毒主要分為α、β和γ三大類。其中單純皰疹病毒是皰疹病毒的典型代表，屬于α皰疹病毒，分為1和2兩種血清型。單純皰疹病毒進(jìn)入細(xì)胞需要gB、gD、gH和gL 4種糖蛋白參與。Atanasiu等［46］利用BiFC對gD和gB以及gD和gH/gL之間的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，首次檢測出gD與其受體的結(jié)合可觸發(fā)gB和gH/gL之間的相互作用，這一結(jié)論也被Avitabile等［47］證實(shí)。在單純皰疹病毒1型（HSV-1）中，Hernandez等［48-49］發(fā)現(xiàn)感染細(xì)胞蛋白（infected-cell protein 27，ICP27）能夠以頭對尾的形式發(fā)生分子內(nèi)相互作用，將ICP27鎖定在封閉結(jié)構(gòu)中?；贐iFC的FRET表明在其C端和N端完好無損的前提下，ICP27能與細(xì)胞mRNA輸出受體蛋白TAP/NXF1發(fā)生相互作用［50］，有利于對病毒感染機(jī)制的理解。Guo等［51］利用BiFC證實(shí)HSV-1刺激相關(guān)基因1蛋白（HSV-1 stimulation related gene 1，HSRG1）與SV40轉(zhuǎn)化蛋白大T抗原（LT）有相互作用，進(jìn)而改變LT對SV40啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)，并影響細(xì)胞周期，這一相互作用的發(fā)現(xiàn)表明宿主可能存在一種未知的先天抗病毒機(jī)制。

人類皰疹病毒4型又稱EB病毒（epstein-Barr virus，EBV），是一種能感染人的皰疹病毒，可潛伏感染B淋巴細(xì)胞并使其永生化。潛伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是B細(xì)胞轉(zhuǎn)化所必需的，可誘導(dǎo)多種信號通路改變細(xì)胞環(huán)境，常在與EB病毒相關(guān)的癌癥中檢測到，因此被稱為EB病毒的癌基因［52］。Talaty等［53］利用BiFC技術(shù)證明LMP1能夠自組裝，且與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子TRAF2、TRAF3互作產(chǎn)生的熒光定位于細(xì)胞的核周和膜區(qū)域。Alaty等［54］通過BiFC技術(shù)篩選鑒定了一種新的LMP1結(jié)合蛋白——跨膜蛋白134（transmembrane protein 134，Tmem134），其與LMP1相互作用會(huì)影響LMP1誘導(dǎo)的NF-κB活性。2015年，Holthusen等［55］利用BiFC鑒定了多種肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白與LMP1互作且定位于脂筏結(jié)構(gòu)域。這些相互作用的發(fā)現(xiàn)為尋找有效治療EB病毒相關(guān)惡性腫瘤的靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

此外，BiFC技術(shù)還被用于測定偽狂犬病毒［56］和鴨腸炎病毒［57-58］等皰疹病毒感染時(shí)相關(guān)蛋白間的相互作用。BiFC技術(shù)在皰疹病毒研究中的應(yīng)用不僅有助于探究各種皰疹病毒蛋白的功能及其在病毒感染過程中發(fā)揮的作用，更有助于進(jìn)一步了解皰疹病毒感染及其發(fā)病機(jī)制。

2.3 流感病毒

流感病毒可引起人和禽類、豬、馬等多種動(dòng)物感染和發(fā)病，通常分為甲、乙、丙三型，其RNA聚合酶復(fù)合物是病毒基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的，由PA、PB1和PB2亞基組成。其中，核心亞基PB1通過與PA和PB2相互作用，將PA和PB2整合到聚合酶復(fù)合物中［59］，但并未發(fā)現(xiàn)PA和PB2亞基之間的相互作用。Hemerka等［60］利用BiFC技術(shù)除驗(yàn)證PA-PB1和PB1-PB2之間的相互作用外，首次檢測出PA的N端和PB2存在相互作用，且定位于細(xì)胞質(zhì)。Suzuki等［61］結(jié)合BiFC與光柵圖像相關(guān)光譜（raster image correlation spectroscopy，RICS），發(fā)現(xiàn)PA與PB1結(jié)合后PA其C端誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中三聚體聚合酶復(fù)合物的異常形成；相反，PA的N端可抑制這一異常形成，將三聚體聚合酶復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中，調(diào)控三聚體聚合酶復(fù)合體的正確形成。此外，PA、PB1、PB2還可分別和視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ蛋白（retinoic acid-inducible gene-Ⅰ，RIGⅠ）相互作用，其中PB1-RIGⅠ和PA-RIGⅠ相互作用產(chǎn)生的BiFC信號主要分布在細(xì)胞質(zhì)，而PB2-RIGⅠ相互作用產(chǎn)生的信號主要在細(xì)胞核中［62］，這表明RIGⅠ具有抑制病毒RNA聚合酶的活性。

總之，在流感病毒蛋白互作的研究中，BiFC技術(shù)主要集中于可視化流感病毒RNA聚合酶復(fù)合物亞基間的相互作用和入核過程，驗(yàn)證聚合酶復(fù)合體的正確形成與病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制相關(guān)，進(jìn)而闡述相關(guān)的抗病毒機(jī)制。

2.4 其他病毒

除了上述三種常見的病毒外，BiFC還被應(yīng)用于其他病毒的相關(guān)研究中。如人類中丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B與干擾素刺激蛋白STING［63］特異性結(jié)合的可視化；人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的包膜蛋白（E2）和細(xì)胞溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（Brd4）的相互作用驗(yàn)證［64］；視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ蛋白（RIG-Ⅰ）與三基序蛋白25（TRIM25）、線粒體抗病毒信號蛋白MAVS之間形成的不同復(fù)合物及其空間定位的可視化［65］。其他動(dòng)物中，雞貧血病毒非結(jié)構(gòu)蛋白VP2和凋亡相關(guān)蛋白Apoptin之間的相互作用，使Apoptin Thr108去磷酸化，從而減弱由Apoptin觸發(fā)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)病毒繁殖［66］；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的跨膜非結(jié)構(gòu)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化，可為未來研究轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成和功能提供有價(jià)值的線索［67］；豬Mx1蛋白與豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5B的相互作用抑制了豬瘟病毒的復(fù)制［68］；可視化家蠶的細(xì)胞分裂周期蛋白37（BmCdc37）與家蠶熱休克蛋白（BmHsp90）的相互作用［69］，以及家蠶細(xì)胞的緊密連接蛋白（Claudin-2）與家蠶質(zhì)多角體病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP7的相互作用［70］，提供了與病毒感染相關(guān)機(jī)制的新見解。對于新型冠狀病毒（簡稱新冠病毒，SARS-CoV-2），Chen等［71］利用BiFC可視化了22種SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白的相互作用，揭示了核衣殼蛋白在病毒樣顆粒組裝中的關(guān)鍵作用，同時(shí)，SARS-CoV-2的核衣殼蛋白還與活細(xì)胞中細(xì)胞應(yīng)激顆粒蛋白CSNK2B、G3BP1和G3BP2相互作用，下調(diào)顆粒蛋白G3BP1的表達(dá)水平［24］，揭示SARSCoV-2可能通過核衣殼蛋白和應(yīng)激顆粒蛋白之間的相互作用來逃脫宿主的清除。

總而言之，BiFC技術(shù)可對這些相互作用及其作用區(qū)域進(jìn)行可視化，有助于理解病毒感染機(jī)制，進(jìn)而深入研究抗病毒機(jī)制。

2.5 BiFC在抗病毒研究方面的應(yīng)用

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在病毒感染宿主的過程中起關(guān)鍵作用，因此通過破壞或阻礙蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來抑制病毒感染已成為一種前景廣闊的抗病毒藥物開發(fā)策略，而BiFC技術(shù)的可視化為活細(xì)胞抗病毒藥物的評估提供了一種新思路。

HIV感染引起的宿主獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是一種危害性較大的傳染性疾病，治療難度極大。Emert-Sedlak等［72］通過BiFC發(fā)現(xiàn)一種獨(dú)特的二苯基吡唑化合物，可直接與Nef結(jié)合從而阻斷Nef二聚化，有效地抑制了HIV-1活性。HIV-1整合酶IN與細(xì)胞輔助因子蛋白LEDGF/p75相互作用是一個(gè)重要的抗病毒靶點(diǎn)［73］。Chen等［29］通過分裂光敏色素iRFP構(gòu)建BiFC系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)化合物6（compound 6）和卡比多巴（Carbidopa）可抑制IN-LEDGF/p75間的相互作用且成劑量依賴型，能夠有效地阻礙病毒DNA整合到宿主基因上。Zhang等［43］利用BiFC發(fā)現(xiàn)SERINC5與HIV-1 Env蛋白的相互作用選擇性地解離Env三聚體以限制HIV-1復(fù)制，為SERINC5的抗病毒活性提供了依據(jù)。

對流感病毒的研究發(fā)現(xiàn)，可通過抑制自噬進(jìn)而抑制甲型流感病毒的復(fù)制［74］。LC3-II是自噬體形成所必需的，而Atg5-Atg12/Atg16異三聚體能促進(jìn)LC3-I轉(zhuǎn)化形成LC3-II，Dai等［75］利用BiFCFRET技術(shù)發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿可抑制Atg5-Atg12/Atg16異三聚體的形成，從而對流感病毒的復(fù)制起抑制作用。Beclin 1作為自噬的調(diào)節(jié)因子，已被證明是多種病毒操縱的重要靶點(diǎn)［76］。B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白是一種與Beclin 1相互作用的自噬抑制劑，而Beclin1作用的發(fā)揮必須從Beclin1/Bcl2異源二聚體中解離。Dai等［77］基于BiFC技術(shù)鑒定出能夠抑制Beclin1-Bcl2解離的藥物丁香酚，同時(shí)，證實(shí)原花青素既可以抑制Atg5-Atg12/Atg16異源三聚體的形成又能抑制Beclin1/Bcl2異源二聚體的解離［78］，為開發(fā)新型抗甲型流感病毒藥物提供了思路。

近幾年BiFC技術(shù)在抗病毒研究方面有了新的進(jìn)展。Yu等［79］通過BiFC揭示了膜相關(guān)RINGCH型8（membrane-associated RING-CH 8，MARCH8）具有廣泛的抗病毒活性：通過與不同病毒融合蛋白相互作用將其滯留在高爾基體中，進(jìn)而抑制其從高爾基體向質(zhì)膜運(yùn)輸以及與病毒粒子的結(jié)合。Wei等［80］利用BiFC鑒定了一種源自噬菌體展示肽庫的肽——P1，它能夠與日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）的囊膜蛋白相互作用并阻止病毒入侵細(xì)胞，具有抗JEV感染的潛力。Huang等［81］發(fā)現(xiàn)化合物B7可以阻斷PRRSV糖蛋白與巨噬細(xì)胞特異性表面受體CD163的相互作用，從而預(yù)防PRRSV感染?；衔铫?2-9也被BiFC技術(shù)證實(shí)能夠干擾乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）衣殼蛋白的相互作用，從而抑制HBV衣殼的組裝，有助于開發(fā)新型抗HBV藥物［82］。

BiFC在致病性病毒蛋白互作研究中的應(yīng)用總結(jié)于表1。一直以來，由病毒引起的各種疾病威脅著全球人類的健康與生活，盡管疫苗的使用有效地預(yù)防和控制了疾病的發(fā)生和流行，但任何疫苗都需要時(shí)間才能發(fā)揮作用且無法完全預(yù)防病毒，機(jī)體依舊面臨被感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此抗病毒藥物的研發(fā)尤為重要。BiFC技術(shù)將抗病毒藥物的效果在活細(xì)胞中以可視化的途徑展現(xiàn)，有利于抗病毒藥物的篩選與評估，為開發(fā)新型藥物提供便利。

表1 BiFC在致病性病毒蛋白互作研究中的應(yīng)用Table 1 Application of BiFC in the study of proteins interaction of pathogenic viruses

3 新型BiFC系統(tǒng)的開發(fā)與應(yīng)用

3.1 BAC-BiFC系統(tǒng)

BiFC技術(shù)雖被廣泛使用，但大量證據(jù)表明在目標(biāo)蛋白不發(fā)生相互作用的情況下，兩個(gè)非熒光片段也可能由于隨機(jī)碰撞而自組裝成完整的熒光蛋白，產(chǎn)生假陽性信號，進(jìn)而限制了BiFC技術(shù)對目標(biāo)蛋白相互作用的定量研究。為了克服這一問題，Mao等［45］開發(fā)了一種能夠檢測并消除假陽性信號的方法，并將其命名為BAC-BiFC（background assessable and correctable-bimolecular fluorescence complementation）。其原理是在BiFC中一個(gè)目標(biāo)蛋白連接一個(gè)參考熒光蛋白，參考熒光蛋白可用來表征目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平與空間分布，還可通過比率判斷不同蛋白表達(dá)水平下假陽性信號的強(qiáng)弱，從而獲得不受假陽性信號干擾的實(shí)驗(yàn)條件（圖4）。該系統(tǒng)目前不僅在HIV-1結(jié)構(gòu)蛋白Gag之間的相互作用中應(yīng)用，還可將BAC-BiFC與其他成像方法（例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移）相結(jié)合，以研究多種蛋白質(zhì)之間的相互作用；或與RNA標(biāo)記系統(tǒng)相結(jié)合，研究蛋白質(zhì)與RNA的相互作用。BAC-BiFC的靈活性，使其成為一種通用且可靠的方法，用于研究各種細(xì)胞和病理環(huán)境中的生物分子相互作用。

圖4 BAC-BiFC用于PPI成像的工作原理[45]Fig.4 Working principle of BAC-BiFC for PPI imaging[45]

3.2 tBiFC系統(tǒng)

Chen等［22］以近紅外光敏色素蛋白IFP 2.0為材料，通過串聯(lián)構(gòu)建的方式，發(fā)展了熒光互補(bǔ)效率顯著提高的近紅外串聯(lián)熒光互補(bǔ)系統(tǒng)（tandem near-infrared fluorescence complementation system，tBiFC），將目標(biāo)蛋白串聯(lián)兩個(gè)IFP 2.0分裂片段，以達(dá)到增強(qiáng)熒光信號的目的（圖5）。該系統(tǒng)目前并未在病毒中應(yīng)用，但其增強(qiáng)熒光信號強(qiáng)度的特點(diǎn)為病毒感染過程中相關(guān)蛋白質(zhì)互作的研究提供了一種強(qiáng)有力的工具。此外，串聯(lián)構(gòu)建方法也可引入其他標(biāo)簽蛋白，以解決互補(bǔ)熒光強(qiáng)度弱的問題。

圖5 tBiFC用于PPI成像的工作原理[22]Fig.5 Working principle of tBiFC for PPI imaging[22]

3.3 TagBiFC技術(shù)

許多研究表明熒光蛋白具有亮度低、光穩(wěn)定性差、易漂白和多聚化等缺點(diǎn)，近期發(fā)展起來的自連接標(biāo)簽蛋白（self-labeling tags）可結(jié)合染料，同時(shí)能以融合蛋白的形式在活細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，成為取代熒光蛋白的材料。Shao等［83］開發(fā)了基于自連接標(biāo)簽HaloTag的TagBiFC技術(shù)，其可在細(xì)胞內(nèi)單分子層次追蹤發(fā)生互作的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)結(jié)合的動(dòng)態(tài)過程。TagBiFC能夠克服使用熒光蛋白的BiFC缺點(diǎn)，擴(kuò)展BiFC現(xiàn)有的工具包，并且在單分子和超高分辨水平追蹤蛋白相互作用，為有關(guān)相互作用提供更多細(xì)節(jié)信息。

與傳統(tǒng)的BiFC相比，新型BiFC系統(tǒng)完善了許多BiFC的不足，展現(xiàn)出優(yōu)越的相互作用可視化性能，但在動(dòng)物病毒相關(guān)的研究中暫未普及。因此，BiFC技術(shù)不斷的改良與發(fā)展，新型BiFC系統(tǒng)的開發(fā)與應(yīng)用，將為日后病毒感染過程中蛋白質(zhì)相互作用的研究以及抗病毒藥物的研發(fā)提供新的方法。

4 展望

BiFC已成為可視化活細(xì)胞中相互作用的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法，從蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用到蛋白質(zhì)的構(gòu)象［84-85］、蛋白質(zhì)和RNA之間的相互作用［23，86-88］的應(yīng)用，從多色熒光互補(bǔ)技術(shù)［27］到與其他技術(shù)如熒光共振能量轉(zhuǎn)移［89］、流式細(xì)胞術(shù)［90］的聯(lián)用，都體現(xiàn)了BiFC廣泛的應(yīng)用前景。本文闡述了BiFC的原理、發(fā)展、優(yōu)勢以及在典型的動(dòng)物病毒和抗病毒藥物評估中的應(yīng)用，并對近年來提出的新型BiFC系統(tǒng)原理進(jìn)行闡述。在病毒感染宿主的過程中，不僅病毒會(huì)侵染宿主，宿主也會(huì)對病毒做出抵御反應(yīng)，因此利用BiFC了解病毒以及病毒與宿主之間的相互作用，對于病毒致病機(jī)制、宿主的抗病毒機(jī)制以及抗病毒藥物的研究至關(guān)重要。尤其是在新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）全球大流行的當(dāng)下，通過成熟而便捷的BiFC技術(shù)，有望對新冠病毒等嚴(yán)重致病性病毒中的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行探究，進(jìn)一步解析病毒感染機(jī)制，靶向抗病毒藥物的篩選。

然而，在應(yīng)用BiFC技術(shù)時(shí)仍然存在一些問題有待解決和改善。比如，分裂熒光片段能夠隨機(jī)碰撞和自我組裝產(chǎn)生熒光造成假陽性，特別是在濃度較高的情況下；由于熒光蛋白在重組后并不能夠重新分開，這種不可逆性限制了可逆的蛋白質(zhì)互作研究；觀察到的熒光信號滯后于蛋白質(zhì)的相互作用，不能實(shí)時(shí)地反映相互作用過程；熒光蛋白的高靈敏性帶來的高背景等。因此，除了使用對照和引入突變來規(guī)避假陽性和消除高背景外，有必要持續(xù)開發(fā)出新的熒光標(biāo)簽、新的與其他技術(shù)相關(guān)聯(lián)的BiFC系統(tǒng)以及可逆的BiFC系統(tǒng)，繼而為病毒和病毒造成的疾病研究提供新的思路。