楊洋，王鳳林，劉德，羅園園，朱建華

暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510632

基因突變（gene mutation）廣泛存在于自然界中，從長遠(yuǎn)的生物進(jìn)化史來看，進(jìn)化的過程是遺傳物質(zhì)不斷突變的結(jié)果，基因突變在一定程度上對生物物種的多樣性起著積極的作用［1］。在自然條件下，一個(gè)特定基因相對于龐大的基因組來說，其突變概率是極低的。當(dāng)科技研究發(fā)展至基因水平時(shí)，人們則需要對脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列中某個(gè)或某些特定的基因進(jìn)行改造，即基因編輯技術(shù)。

基因編輯技術(shù)能夠針對生物體基因組中特定的基因（目的基因）進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)對特定DNA片段的插入、刪除及定點(diǎn)突變，從而導(dǎo)致目的基因（gene of interest）序列改變，造成基因沉默、激活或移碼突變（frame shift mutation）等。基因編輯的本質(zhì)是利用具有靶向性的核酸內(nèi)切酶，對DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行剪切，造成DNA雙鏈斷裂，然后利用生物體自身的DNA損傷修復(fù)（DNA repair）功能，實(shí)現(xiàn)對目的基因的編輯［2］。

近年來，隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，已有4種核酸酶家族被用于基因編輯，分別為：大范圍核酸酶（meganucleases）［3］、鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）［4］、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）［5］以及成簇的有規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）［6］。CRISPR-Cas技術(shù)是繼ZFN和TALEN后的第3代基因編輯技術(shù)［7］。ZFN和TALEN技術(shù)通過對轉(zhuǎn)錄激活因子中DNA結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)模體——鋅指模體和氨基酸模塊的識(shí)別來確定不同的DNA序列［8］，而CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)通過sgRNA（small guide ribonucleic acid）來進(jìn)行目的基因的定位，其設(shè)計(jì)簡單、操作簡便、效率高且成本低，已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域的基因編輯中。

次級(jí)代謝產(chǎn)物（secondary metabolites）是相對于初級(jí)代謝（primary metabolism）產(chǎn)物而言的。初級(jí)代謝產(chǎn)物是植物代謝產(chǎn)生的維持植物機(jī)體生命活動(dòng)必不可少的物質(zhì)，如糖類、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等［9］。次級(jí)代謝產(chǎn)物是在特定條件下，由初級(jí)代謝產(chǎn)物經(jīng)過進(jìn)一步轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的一類非必需的小分子有機(jī)化合物，包括萜類、生物堿、黃酮和皂苷等物質(zhì)［10］。次級(jí)代謝產(chǎn)物一般具有藥用價(jià)值，因此對植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究有著重要意義。

2013年，Li等［11］首次成功利用CRISPR-Cas9技術(shù)對擬南芥和煙草原生質(zhì)體進(jìn)行基因編輯，展示了CRISPR-Cas9技術(shù)的高效性、簡便性、多功能性和特異性，為該技術(shù)在植物中進(jìn)行高精度基因編輯提供了新思路。自此之后，CRISPR-Cas9技術(shù)開始廣泛用于水稻［12］、擬南芥［13］、煙草［14］、小麥［15］、大豆［16］和番茄［17］等植物的研究中，以提高農(nóng)作物產(chǎn)量、改良品質(zhì)、提高植物抗病性、提高非生物脅迫抗性和增強(qiáng)除草劑抗性［18］。本文綜述了CRISPR-Cas9技術(shù)在植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的研究進(jìn)展，以期為CRISPR-Cas9技術(shù)在藥用植物領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 天然CRISPR-Cas9系統(tǒng)

CRISPR-Cas9系統(tǒng)是古細(xì)菌和細(xì)菌中存在的一種獲得性免疫機(jī)制，1987年日本科學(xué)家首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)［19］。CRISPR是存在于原核生物基因組內(nèi)的一段具有回文結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列［20］，Cas9是由原核生物中Cas基因編碼的一種蛋白，具有核酸酶活性，可切割DNA使雙鏈DNA斷裂（double strand breaks，DSB）。由于Cas基因編碼蛋白通常與CRISPR序列區(qū)域同時(shí)起作用，故被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)（CRISPR-associated，Cas）基因［21］。當(dāng)細(xì)菌遭受病毒入侵后，Cas1和Cas2編碼的蛋白質(zhì)掃描入侵的DNA，同時(shí)識(shí)別出外源DNA的原間隔物相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM），PAM序列多為5'-NGG結(jié)構(gòu)，之后Cas1和Cas2編碼的蛋白質(zhì)將臨近PAM的DNA序列從外源DNA中剪切下來，在其他酶的協(xié)助下將剪切下來的DNA片段作為間隔序列插入到臨近的CRISPR序列中，然后進(jìn)行DNA修復(fù)，修補(bǔ)雙鏈缺口。CRISPR序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后加工表達(dá)產(chǎn)生成熟的crRNA（CRISPR RNA）和反式激活crRNA（trans-activating crRNA），最后crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白組成復(fù)合物（圖1A）。當(dāng)細(xì)菌再次遭受到相同的外源DNA入侵時(shí)，crRNA/tracrRNA/Cas9復(fù)合物可識(shí)別出與crRNA互補(bǔ)的PAM序列，并準(zhǔn)確定位到外源DNA的PAM區(qū)域，通過Cas9對外源DNA進(jìn)行精準(zhǔn)切割，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，使外源DNA的表達(dá)沉默，從而為細(xì)菌和古細(xì)菌提供針對病毒的適應(yīng)性免疫［6］（圖1B）。

圖1 天然CRISPR-Cas9系統(tǒng)[19]Fig.1 Natural CRISPR-Cas9 system[19]

2 基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)原理

基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)即利用CRISPR-Cas作為工具酶的一種基因編輯技術(shù)。通過人工設(shè)計(jì)一段小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）以對目的基因進(jìn)行定位，sgRNA具有靶向特異性，相當(dāng)于天然細(xì)菌系統(tǒng)中crRNA和tracrRNA的復(fù)合物（圖2）。sgRNA能夠引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶至具有合適PAM的基因位點(diǎn)，通過Cas9的核酸酶活性切割目的基因使DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB）［22-23］。DSB可以通過非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）重組修復(fù)和同源定向修復(fù)（homology-directed repair，HDR）兩種方式進(jìn)行修復(fù)。由于NHEJ不需要通過同源DNA對DNA進(jìn)行修復(fù)，因而以該種方式進(jìn)行修復(fù)的DNA鏈同源性不高，修復(fù)的DNA序列中可能存在一定的錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致目的基因發(fā)生移碼突變或終止密碼子提前出現(xiàn)；而以HDR方式的修復(fù)，參與修復(fù)的兩段DNA在相當(dāng)長的范圍內(nèi)序列相同，故此種修復(fù)方式可以引入特定位點(diǎn)的突變或插入所需的基因序列［22，24］。通過CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的HDR修復(fù)，除了可以對DSB進(jìn)行修復(fù)外，還能夠精確地將突變引入基因組［25］。

圖2 基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)原理[6]Fig.2 Principle of gene editing technology based on CRISPR-Cas9[6]

3 基于CRISPR-Cas9的基因編輯方法

3.1 基因敲除

Cas9蛋白切割DNA雙鏈產(chǎn)生DSB，通常情況下，細(xì)胞通過NHEJ修復(fù)DNA雙鏈斷裂，在修復(fù)過程中極易發(fā)生堿基錯(cuò)配或缺失，導(dǎo)致移碼突變，從而使基因沉默，達(dá)到基因敲除的目的［26］。利用CRISPR-Cas9技術(shù)對基因進(jìn)行敲除，操作簡單、效率高，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和植物學(xué)等領(lǐng)域，用以闡明疾病發(fā)生機(jī)制、治療疾病、發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點(diǎn)和提高植物產(chǎn)量、改良性狀等［27］。馬篤軍等［28］利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)結(jié)合蛋白R(shí)ab（ras-associated binding）家族基因RAB39B后，發(fā)現(xiàn)敲低RAB39B基因能夠降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，證實(shí)了RAB39B基因與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、軟骨分化的相關(guān)性。Miao等［29］利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除脫落酸受體家族蛋白PYL1/4/5（pyrabactin resistance 1-like 1/4/5）三基因的水稻突變體產(chǎn)量更高、生長最好。

3.2 基因敲入

細(xì)菌內(nèi)存在與DSB互補(bǔ)的同源DNA時(shí)，還可以通過HDR的方式來修復(fù)DSB，該修復(fù)方式準(zhǔn)確性高，可以將需要插入基因的互補(bǔ)片段人工導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使DSB以導(dǎo)入片段作為模板進(jìn)行修復(fù)，從而達(dá)到基因敲入的目的［22，24］。Zhao等［30］通過CRISPRCas9技術(shù)將低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，Ldlr）基因?qū)隠dlr基因缺陷的小鼠中，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)AAV-CRISPR-Cas9介導(dǎo)的Ldlr基因可挽救部分ldlr突變體的Ldlr表達(dá)，有效改善動(dòng)脈粥樣硬化，為家族性高膽固醇血癥患者提供了一種潛在的治療途徑。

3.3 堿基編輯

盡管相對于NHEJ來說，HDR修復(fù)具有高度保真性，但其整合頻率比NHEJ要低得多，且需要外源的修復(fù)模板，應(yīng)用受到一定的限制。而利用Cas9突變體（de-activated Cas9，dCas9）和堿基編輯因子融合蛋白可以對單個(gè)堿基進(jìn)行替換，且該過程不需要外源修復(fù)模板，從而實(shí)現(xiàn)G/C堿基向A/T堿基的轉(zhuǎn)換，這一技術(shù)被稱為堿基編輯（base editing，BE）［31］。由于其可對單個(gè)堿基精準(zhǔn)點(diǎn)突變的優(yōu)點(diǎn)，堿基編輯目前已被廣泛應(yīng)用于植物［32］、動(dòng)物［33］和微生物［34］領(lǐng)域，在改善作物性狀、實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)育種以及治療點(diǎn)突變引起的疾病等方面有著巨大的潛能。

3.4 基因抑制/激活

一種堿基編輯技術(shù)設(shè)計(jì)了HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域活性喪失的dCas9，使dCas9失去了核酸酶功能，只能在sgRNA引導(dǎo)下與DNA結(jié)合，而不對DNA進(jìn)行剪切［35］。通過sgRNA的引導(dǎo)dCas9可以結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，使基因無法繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，從而抑制基因表達(dá)。

通過CRISPR-Cas9技術(shù)對啟動(dòng)子序列進(jìn)行干擾，同樣可達(dá)到基因抑制或激活的目的。?ermák等［36］通過CRISPR-Cas9技術(shù)，使用雙生病毒復(fù)制子對番茄基因進(jìn)行遺傳修飾，成功在控制花青素生物合成基因的上游插入一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，導(dǎo)致番茄組織中色素過表達(dá)和異位積累。

3.5 多基因編輯

若設(shè)計(jì)多個(gè)不同的sgRNA，分別將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，則CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以通過sgRNA的引導(dǎo)同時(shí)對多個(gè)基因進(jìn)行編輯。Yu等［37］通過CRISPRCas9系統(tǒng)同時(shí)編輯擬南芥中AtRPL10家族的三個(gè)同源基因AtRPL10A、AtRPL10B和AtRPL10C，得到了傳統(tǒng)雜交難以得到的三基因突變體。

4 CRISPR-Cas9技術(shù)在植物次生代謝物生產(chǎn)中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)雖然可用于闡明次生代謝物生物合成途徑、提高植物中的次生代謝物含量［38］以及改良植物遺傳性質(zhì)［39］，但是外源基因的插入在一定程度上影響了植物的安全性。CRISPRCas9技術(shù)不存在外源基因的整合，雖然可能會(huì)在T0代植物基因組上插入標(biāo)記基因、sgRNA序列和Cas9序列，但是這三者與靶基因沒有密切的連鎖關(guān)系，通過自交在T1代植株中能夠篩選得到不含有外源基因的目標(biāo)植株［40］。

4.1 醌類化合物

醌類化合物廣泛分布于動(dòng)物和植物中，大多具有重要的生物活性。目前，CRISPR-Cas9技術(shù)在醌類化合物的生產(chǎn)上多用于闡明藥用植物丹參中活性成分丹參酮的生物合成。丹參酮類化合物是丹參的主要活性成分，臨床上可用于治療冠心病、心肌梗死［41］，是一類二萜醌類化合物，通過異戊二烯代謝途徑產(chǎn)生，其共同前體物質(zhì)是牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）［42］。李斌［43］首次將CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于藥用植物丹參，成功獲得了丹參二萜合酶SmCPS1（Salvia miltiorrhizacommitted diterpene synthase gene 1）基因的毛狀根突變體和丹參二萜合酶SmCYP76AH1（Salvia miltiorrhizacommitted diterpene synthase gene 76AH1）毛狀根突變體。同時(shí)，該研究證明SmCPS1基因位于丹參二萜類化合物共同前體物質(zhì)GGPP的下游。這一基因的成功敲除為丹參中其他二萜醌類化合物的異源合成提供了可能?；衔锴绑w形成重要的中間體后，會(huì)經(jīng)細(xì)胞色素P450等后修飾酶催化生成各種復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此，細(xì)胞色素P450酶CYPs（cytochrome P450 enzymes）通常在天然產(chǎn)物的生物合成中起著至關(guān)重要的作用。Li等［44］報(bào)道了兩個(gè)重要的P450酶CYP76AK2和CYP76AK3在丹參酮生物合成途徑中的作用。利用一個(gè)三重靶標(biāo)CRISPR-Cas9系統(tǒng)對丹參中的CYP76AK2和CYP76AK3基因進(jìn)行靶向敲除，結(jié)果顯示，突變體中五種丹參酮的含量均顯著降低，說明這兩種酶可能參與了丹參酮的生物合成。該研究結(jié)果為鑒定CYP76AK2和CYP76AK3的催化功能奠定了基礎(chǔ)，也進(jìn)一步豐富了對丹參酮次級(jí)代謝合成網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。醌類物質(zhì)可由酚類物質(zhì)經(jīng)植物多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）催化生成，對煙草而言，醌類化合物偏高會(huì)導(dǎo)致煙葉烘烤后品質(zhì)變差。代卓毅等［45］選用烤煙品種NC89為實(shí)驗(yàn)材料，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除PPO基因NtPPO8，結(jié)果表明，編輯NtPPO8后煙葉中PPO的活性降低、多酚類含量顯著提高，有助于增強(qiáng)煙葉的耐烤性?？傊贑RISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的輔助下，不但有助于闡明丹參酮的生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)人工合成以降低丹參酮的生產(chǎn)成本，還可以改良植株的品質(zhì)，提高其質(zhì)量和價(jià)值，同時(shí)也為其他植物醌類化合物相關(guān)合成酶基因的編輯提供了參考方法。

4.2 苯丙酸類化合物

CRISPR-Cas9技術(shù)除了應(yīng)用在丹參中的丹參酮生物合成研究外，還被用于研究丹參酚酸類成分的生物合成途徑解析［46］。Deng等［47］從脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導(dǎo)的丹參轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選到了一種堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子bZIP（basic leucine zipper），并命名為SmbZIP1。利用CRISPR-Cas9敲除體系，輔助驗(yàn)證了SmbZIP1對脫落酸合成的促進(jìn)作用和丹參酮合成的抑制作用，揭示了酚酸和丹參酮生物合成中一種新的調(diào)控因子，為丹參的代謝工程研究提供了新思路。Zhou等［48］利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對丹參水溶性酚酸合成途徑中的迷迭香酸合成酶（rosmarinic acid synthase，RAS）基因SmRAS進(jìn)行編輯，聯(lián)合基因表達(dá)和代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)編輯成功的毛狀根系中，迷迭香酸和紫草精酸B等酚酸含量和RAS基因表達(dá)水平降低，這種現(xiàn)象在純合突變體中尤為顯著。此外，迷迭香酸生物合成前體3，4-二羥基苯基乳酸含量顯著上升。這些結(jié)果表明，CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以在生物信息學(xué)分析的輔助下識(shí)別一個(gè)基因家族中的重要基因，為丹參基因組編輯提供了一種高效、特異的工具。同時(shí)，丹參基因組測序的完成也為利用CRISPR-Cas9技術(shù)提高丹參中的次生代謝產(chǎn)物含量和改良丹參遺傳性質(zhì)提供了有利條件。

4.3 生物堿

生物堿是存在于自然界（主要為植物，少數(shù)為動(dòng)物）的一類含氮堿性有機(jī)化合物，大多具有獨(dú)特的生物活性。Zeng等［49］利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了顛茄莨菪堿6β-羥化酶AbH6H（Atropa belladonnahyoscyamine 6β-hydroxylase）基因，提高了顛茄植株莨菪堿的含量，且不含有山莨菪堿和東莨菪堿，減小了提取莨菪堿的難度和成本，因此在低成本生產(chǎn)莨菪堿方面具有巨大的潛在適用性。Ma等［50］通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功將茶樹愈傷組織中的同源結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子CsHB1（citrus HD-ZIPⅡtranscription）進(jìn)行定向突變。在轉(zhuǎn)基因愈傷組織中，轉(zhuǎn)錄因子CsHB1和N-甲基轉(zhuǎn)移酶（N-methyltransferase，NMT）基因yhNMT1的表達(dá)分別下降65%和93%，咖啡因的積累下降97.5%，表明yhNMT1基因受CsHB1調(diào)控。這一結(jié)果將有助于理解茶中咖啡因生物合成的調(diào)控機(jī)制。此外，一些植物中含有毒生物堿，會(huì)限制其用藥劑量和范圍，如藥用植物紫草（Symphytum officinale）具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用［51］，但其組織中存在有毒的吡咯利嗪類生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs），從而阻礙了其應(yīng)用［52］。Zakaria等［53］利用CRISPR-Cas9技術(shù)在有害突變中引入PAs生物合成途徑中的第一個(gè)特異酶——同亞精胺合成酶（homospermidine synthase，HSS）基因，結(jié)果顯示兩個(gè)HSS等位基因中只要有一個(gè)失活就會(huì)導(dǎo)致毛狀根中同亞精胺和PAs水平顯著降低，而在兩個(gè)等位基因均失活的毛狀根中未檢測到生物堿，該研究為非模式植物進(jìn)一步研究PAs的生物合成提供了新思路。由此可見，對于具有藥用價(jià)值的生物堿，利用CRISPR-Cas9技術(shù)對原植物進(jìn)行基因編輯，有望提高植物中生物堿的產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本，從而降低病人的用藥成本；而對于含有毒生物堿的藥用植物，如某些含有PAs的草藥，由于PAs水平超過了藥物規(guī)定的最大耐受水平而被限制口服［54］，利用CRISPR-Cas9對植物進(jìn)行基因編輯，可降低其產(chǎn)生有毒生物堿的含量，進(jìn)而擴(kuò)大藥用范圍。

CRISPR-Cas9在生物堿合成中的應(yīng)用不僅限于藥用植物，也廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物領(lǐng)域，利用CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行分子育種，可在基因水平上提升農(nóng)作物品質(zhì)和改良性狀。水稻甜菜堿醛脫氫酶OsBadh2（Oryza sativabetaine aldehyde dehydrogenase 2）基因是稻米香味的主要控制基因，2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-AP）是稻米中的主要香味物質(zhì)［56］。2-AP因其前體被OsBadh2催化氧化而合成受限，大米由此失去香味［57］。胡黎明等［12］選用常規(guī)稻華航31為受體材料，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNramp5（Oryza sativanatural resistance-associated macrophage protein）和香味基因OsBadh2同時(shí)進(jìn)行編輯，創(chuàng)制OsNramp5和OsBadh2雙基因敲除植株。與野生型華航31相比，所有雙基因敲除植株中的香味物質(zhì)2-AP含量均顯著提高。對于同為單子葉植物的玉米，張翔等［58］利用CRISPR-Cas9技術(shù)對玉米中2個(gè)Badh2同源基因（ZmBADH2-1、ZmBADH2-2）同時(shí)進(jìn)行定點(diǎn)敲除，成功獲得了新型香型玉米。香型玉米種子中2-AP含量比編輯前的材料顯著提高，香味更濃。煙草是一種傳統(tǒng)的模式植物和重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙草中煙堿的含量又關(guān)系到煙葉的品質(zhì)和工業(yè)可用性［55］。馮吉等［14］將烤煙品種K326作為實(shí)驗(yàn)材料，利用CRISPR-Cas9技術(shù)定向敲除與煙草煙堿合成與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，最終成功獲得低煙堿純合基因型T2代煙草植株，為低煙堿煙草分子育種提供了理論和技術(shù)支撐。

4.4 萜類化合物

萜類化合物種類繁多、分布廣泛，其中有一半以上是在植物中發(fā)現(xiàn)的，是植物體內(nèi)一種重要的次生代謝物，對植物的生長、發(fā)育以及植物與生態(tài)環(huán)境之間的聯(lián)系起著極為重要的作用。利用CRISPR-Cas9技術(shù)對主要活性物質(zhì)為萜類化合物的藥用植物進(jìn)行基因編輯，探索其合成途徑，可以實(shí)現(xiàn)萜類化合物的批量生產(chǎn)。青蒿素（artemisinin，ART）是我國科學(xué)家屠喲喲團(tuán)隊(duì)20世紀(jì)70年代初從傳統(tǒng)中藥黃花蒿（Artemisia annuaL.）中分離獲得的一種具有過氧基團(tuán)的新型倍半萜內(nèi)酯類化合物，對惡性瘧原蟲、耐甲氟喹等抗瘧藥的瘧原蟲有顯著的殺滅作用［59-60］。至今，青蒿素類藥物仍是世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）倡導(dǎo)的“基于青蒿素的聯(lián)合療法”（artemisinin-based combination therapies，ACTs）首選抗瘧藥［60］。但由于天然青蒿中青蒿素含量極低，難以滿足市場需求，如何提高青蒿中青蒿素的產(chǎn)量已成為研究的熱點(diǎn)。CRISPR-Cas9技術(shù)在青蒿素生物合成通路前體關(guān)鍵酶基因的編輯上得到了充分應(yīng)用。紫穗槐二烯合成酶（amorphadiene synthase，ADS）是催化焦磷酸法尼酯（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）生成紫穗槐二烯的關(guān)鍵酶，是FPP走向青蒿素代謝通路的限速酶。Song等［61］利用CRISPR-Cas9對枯草芽孢桿菌中ADS生物合成通路的基因進(jìn)行編輯，不僅引入特定的點(diǎn)突變和敲除基因，還將2.5 kb的GFPADS表達(dá)盒整合到枯草桿菌基因組中，這是CRISPR-Cas9報(bào)告整合到枯草桿菌基因組中的最大片段，經(jīng)基因改造后的枯草芽孢桿菌，在沒有經(jīng)過任何發(fā)酵條件的優(yōu)化下，紫穗槐二烯的含量由81 mg·L-1增加到116 mg·L-1。此外，楊林等［62］克隆了甘草1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS）基 因，采用基因融合法構(gòu)建了過表達(dá)載體pCA-DXS。根據(jù)DXS第一外顯子設(shè)計(jì)sgRNA序列，構(gòu)建了CRISPR-Cas9基因編輯載體，通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法誘導(dǎo)甘草胚軸的DXS基因過表達(dá)，結(jié)果表明，DXS基因過表達(dá)甘草毛狀根樣品中甘草酸含量明顯降低，證實(shí)了DXS基因?qū)Ω什菟嵘锖铣傻呢?fù)調(diào)控作用。

三萜是傳統(tǒng)中藥雷公藤（Tripterygium wilfordii）的主要活性成分。但是人們對植物中三萜的生物合成知之甚少。Liu等［63］從雷公藤中克隆了2種角鯊烯環(huán)氧化酶和5種氧化角鯊烯環(huán)化酶基因，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)和酵母異源表達(dá)鑒定其功能。這些基因的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了人們對三萜生物合成關(guān)鍵酶的了解，也為通過破壞競爭途徑增加雷公藤組織培養(yǎng)中三萜的產(chǎn)量或通過重建三萜生物合成途徑增加底盤細(xì)胞中三萜的產(chǎn)量提供了額外靶基因。

類胡蘿卜素是一種四萜類化合物［64］，是植物顯現(xiàn)顏色的重要因素之一，也是人體內(nèi)維生素A的主要來源，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌和延緩衰老等功效［65］。日本牽?；ǎ↖pomoea nil）可呈現(xiàn)出多種顏色，但唯獨(dú)沒有黃色，這表明花瓣中類胡蘿卜素含量較低。Watanabe等［66］利用CRISPRCas9技術(shù)敲除了牽?；ㄖ械念惡}卜素剪切雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenase，CCD）基因，發(fā)現(xiàn)敲除CCD基因的白色花瓣變成淡黃色，這一結(jié)果表明CCD參與調(diào)控花瓣中類胡蘿卜素的積累。

八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）是合成類胡蘿卜素的關(guān)鍵限速酶，無色的八氫番茄紅素經(jīng)PDS處理形成有色的類胡蘿卜素。左鑫等［67］選擇RcPDS1基因作為靶基因，利用CRISP-Cas9系統(tǒng)成功創(chuàng)制RcPDS1基因敲除植株，發(fā)現(xiàn)敲除RcPDS1基因的植株出現(xiàn)白化現(xiàn)象，這為進(jìn)一步解釋浙地黃中類胡蘿卜素的生物合成機(jī)制提供了基礎(chǔ)。編碼和調(diào)節(jié)基因突變區(qū)域可以對基因功能產(chǎn)生不同的影響。Jayaraj等［68］在番茄類胡蘿卜素上的研究也證明了這一點(diǎn)，CRISPRCas9系統(tǒng)通過番茄類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因5'-UTR的缺失導(dǎo)致該基因的下調(diào)，使脯氨酸紅素向番茄紅素的轉(zhuǎn)化率降低。

植物萜類化合物是植物中結(jié)構(gòu)變化最多的一類次生代謝產(chǎn)物［65］，其結(jié)構(gòu)多樣性在一定程度上阻礙了自身合成途徑的闡明和進(jìn)一步生產(chǎn)應(yīng)用。而許多相關(guān)研究已表明，利用CRISPR-Cas9技術(shù)有助于萜類化合物生物合成途徑的闡明，也為利用生物技術(shù)生產(chǎn)萜類化合物提供了科學(xué)資料。

4.5 木質(zhì)素

木質(zhì)素在植物次生細(xì)胞壁中含量豐富，與植物機(jī)械支持和水分傳輸?shù)确矫嬗兄懿豢煞值年P(guān)聯(lián)。CRISPR-Cas9技術(shù)在木質(zhì)素類化合物生產(chǎn)上的應(yīng)用，有助于開發(fā)富含木質(zhì)素的草生物、生產(chǎn)能源豐富的固體生物燃料和木質(zhì)素衍生芳香族化合物。木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)對秸稈植物的理化性質(zhì)和遺傳改良具有重要意義。Miyamoto等［69］利用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯對水稻轉(zhuǎn)錄抑制因子OsMYB108（Oryza sativaavian myeloblastosis viral oncogene homolog）進(jìn)行靶向敲除，獲得了一種木質(zhì)素豐富的模式轉(zhuǎn)基因水稻。敲除OsMYB108的水稻突變體稈細(xì)胞壁中木質(zhì)素生物合成基因表達(dá)增加，木質(zhì)素沉積增強(qiáng)。蘭科植物是第二大開花植物科，具有很高的觀賞性和藥用價(jià)值。目前，蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale）全基因組測序已完成，因此有望成為蘭科植物進(jìn)化、發(fā)育和遺傳研究的模型。Kui等［70］成功利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對鐵皮石斛木質(zhì)素生物合成途徑的5個(gè)靶基因香豆酸-3羥化酶C3H（coumarate 3-hydroxylase）、肉桂酸-4-羥化酶C4H（cinnamate-4-hydroxylase）、4-香豆酸輔酶A連接酶4CL（4-coumarate coenzyme ligase）、肉桂酰輔酶A還原酶CCR（cinnamoyl coenzyme reductase）、不規(guī)則木質(zhì)部IRX（irregular xylem）進(jìn)行定向編輯，提示可以進(jìn)一步利用該系統(tǒng)修飾其他化合物的生物合成途徑，以更好地研究功能基因?qū)λ幱弥参锇l(fā)育和代謝影響的分子機(jī)制。

4.6 皂苷類化合物

目前，越來越多的研究關(guān)注皂苷的合成和代謝途徑，探索皂苷合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，并試圖通過基因?qū)用娴恼{(diào)控影響皂苷的合成，進(jìn)而提高皂苷產(chǎn)量。王琪等［71-72］通過人參皂苷前體物質(zhì)2，3-氧化角鯊烯的代謝通路，采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了環(huán)阿屯醇合酶（cycloartenol synthase，CAS）和達(dá)瑪烷二醇合成酶（dammarenediol synthase，DS）質(zhì)粒 表 達(dá)載 體CRISPR-Cas9-CAS和CRISPR-Cas9-DS，探究載體與人參愈傷組織共培養(yǎng)時(shí)合適的抑菌壓和篩選壓，為以皂苷類化合物為主要活性成分的植物基因編輯體系建立奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。人參根中含有2種四環(huán)三萜類皂苷，分別為原人參二醇型（protopanoxadiol-type saponins，PPD）和原人參三醇型（protopanaxatriol-type saponins，PPT），PPD在PPT合成酶的催化下合成PPT。Han等［73］利用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的PPT合酶基因突變構(gòu)建了人參純合子突變系，并獲得了完全缺失PPT型人參皂苷的突變?nèi)藚⒏?。?shí)驗(yàn)結(jié)果證明突變根通過消耗PPT型人參皂苷產(chǎn)生PPD型人參皂苷，這是首次利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生靶向誘導(dǎo)突變以修飾人參屬植物的皂苷生物合成。

盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis）是中國特有的植物，其根狀莖可用于分離多種甾體藥物的合成前體——薯蕷皂苷元，其具有保護(hù)神經(jīng)、降低高血脂、保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、抗氧化、抗血栓、驅(qū)蟲和抗過敏等功效［74］。Feng等［74］首次采用CRISPR-Cas9編輯工具對盾葉薯蕷薯蕷皂苷元合成過程中的關(guān)鍵酶法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase gene，F(xiàn)PS）基因Dzfps進(jìn)行靶向突變，sgRNA設(shè)計(jì)在FPS的第一個(gè)外顯子上，sgRNA表達(dá)盒由OsU3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，Cas9由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型植株相比，分離突變體中法尼基焦磷酸合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平和角鯊烯的含量顯著降低，該研究為定向改造盾葉薯蕷的基因組提供了一種快速有效的方法。

無論是人參皂苷還是薯蕷皂苷都是具有重要生物活性的化合物，由于對該類活性成分的大量需求，野生型藥用資源正在不斷減少。利用CRISPR-Cas9技術(shù)探索皂苷的生物合成途徑，有望對皂苷進(jìn)行量產(chǎn)或提高藥用植物皂苷的產(chǎn)量，以緩解藥用植物資源短缺的現(xiàn)狀，同時(shí)也可保護(hù)野生資源。

4.7 甾體類化合物

目前，維生素D缺乏癥已成為全球的健康問題。生理狀態(tài)下，皮膚皮脂腺及其分泌物的7-脫氫膽固醇（7-dehydrocholesterol，7-DHC）經(jīng)太陽照射后可以合成維生素D3。某些植物也可合成7-DHC，如番茄等植物的葉片和未成熟的綠色果實(shí)［75］。但通常情況下，7-DHC不會(huì)在植物中累積，而是轉(zhuǎn)化為膽固醇。Li等［76］利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除了番茄中7-DHC還原酶基因SI7-DR2（specific isoform of 7-dehydrocholesterol reductase 2），發(fā)現(xiàn)SI7-DR2的失活可以大大增加番茄葉片和未成熟果實(shí)中7-DHC的含量，而對番茄內(nèi)其他化合物的含量及番茄的生長、發(fā)育和產(chǎn)量等沒有顯著影響。經(jīng)紫外線照射后，番茄中的7-DHC可有效轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3。以上研究結(jié)果提示番茄可以被開發(fā)為一種基于植物的、可持續(xù)的維生素D3來源。

4.8 黃酮類化合物

黃酮類化合物泛指兩個(gè)苯環(huán)（A與B環(huán)）通過中央3個(gè)碳原子相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物，具有C6-C3-C6骨架特征，廣泛存在于自然界中，在各種蔬菜、水果中都具有較高的含量。CRISPRCas9在黃酮類化合物生產(chǎn)方面主要應(yīng)用于農(nóng)作物領(lǐng)域，如提高水稻和蕎麥中黃酮的含量以增加其營養(yǎng)價(jià)值、提高豆科植物中異黃酮的含量以增強(qiáng)其病毒抗性。

花青素在植物生長中起著重要的作用，是構(gòu)成植物紅色、藍(lán)色和紫色的物質(zhì)基礎(chǔ)，并且具有很強(qiáng)的抗氧化和清除自由基活性。在植物中，MYBbHLH-WD40（MBW）復(fù)合體激活花青素生物合成基因，但在水稻中WD40的調(diào)控方式并不明確。Yang等［77］利用CRISPR-Cas9技術(shù)獲得了水稻W(wǎng)D40基因OsTTG1突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體各器官中花青素積累顯著降低，確定OsTTG1（Oryza sativatransparent testa glabra1）是水稻和其他植物中花青素合成的關(guān)鍵基因?；ㄇ嗨睾铣擅福╝nthocyanin synthase，ANS）是植物花青素合成的關(guān)鍵酶，催化花青素生物合成的倒數(shù)第2步，可使無色花色素轉(zhuǎn)變成有色花色素。楊迎霞等［78］以花青素合成途徑中的關(guān)鍵基因BoANS為目標(biāo)基因，成功建立了花椰菜CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)體系，結(jié)果顯示基因編輯株花球表面顏色減退，該研究為花椰菜優(yōu)質(zhì)資源的創(chuàng)制提供了技術(shù)體系。

苦蕎是一種重要的食用和藥用植物，含有豐富的蘆丁與其他黃酮類化合物，F(xiàn)tMYB45是一種R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，對蕎麥類黃酮的生物合成具有負(fù)調(diào)控作用。Dong等［79］利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了兩個(gè)sgRNA靶向FtMYB45基因的第二外顯子，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根，測序結(jié)果顯示，共產(chǎn)生了6種類型的突變體系，突變頻率達(dá)到50%；基于液相-三重四級(jí)質(zhì)譜法（liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry）代謝組學(xué)結(jié)果亦顯示，毛狀根突變體中蘆丁、兒茶素和其他黃酮類化合物含量均有所增加。這一研究表明，CRISPRCas9系統(tǒng)可以精確編輯蕎麥基因組，為蕎麥基因功能研究和品質(zhì)改良奠定了基礎(chǔ)。

異黃酮主要分布在豆科植物中，這些化合物在植物與環(huán)境的相互作用中起著關(guān)鍵作用，且有益于人類健康。異黃酮合酶（isoflavone synthasem，IFS）是合成異黃酮的關(guān)鍵酶，與黃烷酮-3-羥化酶（flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）和黃酮合酶Ⅱ（flavone synthaseⅡ，F(xiàn)NSⅡ）共享一個(gè)底物。為了提高大豆異黃酮的含量，Zhang等［80］采用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的多重基因編輯技術(shù)同時(shí)靶向大豆中的大豆黃烷酮-3-羥化酶GmF3H1（Glycine maxL.Merr.flavanone-3-hydroxylase1）、GmF3H2（Glycine maxL.Merr.flavanone-3-hydroxylase2）和大豆黃酮合酶GmFNSⅡ-1（Glycine maxL.Merr.flavone synthaseⅡ-1），使突變株中異黃酮的含量顯著提高，從而增強(qiáng)了植株對大豆花葉病毒的抗性。

紅三葉草（Trifolium pratense）是一種優(yōu)質(zhì)的豆科牧草，非常適合放牧和干草生產(chǎn)。Dinkins等［81］利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除紅三葉草中異黃酮生物合成中的關(guān)鍵酶異黃酮合酶（isoflavone synthase，IFS1），使突變植株中包括芒柄花素、生物霉素A和染料木素在內(nèi)的異黃酮水平顯著降低。根瘤菌測試實(shí)驗(yàn)顯示，異黃酮不參與紅三葉的根瘤菌信號(hào)傳導(dǎo)，但可能在根際防御中發(fā)揮作用。

CRISPR-Cas9技術(shù)已成為黃酮類化合物生物合成相關(guān)基因修飾和植物品種改良的重要工具。通過基因編輯有望大幅度地提高植物黃酮類成分的產(chǎn)量，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新植物品種。

5 展望

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)是第3代基因編輯技術(shù)，其以簡便易行和高效迅速等優(yōu)點(diǎn)在各個(gè)領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。與TALENs和ZFNs技術(shù)相比，CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有操作簡單、精度高、編輯效率高和無標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。植物次生代謝產(chǎn)物在植物與環(huán)境相互作用和整個(gè)生命活動(dòng)中行使著重要的功能，它們不僅是植物防御體系的一部分，與植物的生長發(fā)育相關(guān)酶基因的時(shí)空表達(dá)息息相關(guān)，也是天然活性成分的主要來源，但該類成分在植物中的含量往往比較低，難以滿足藥物的進(jìn)一步開發(fā)和利用。CRISPR-Cas9技術(shù)為植物基因工程的研究提供了新思路，其在提高植物次生代謝物產(chǎn)量、改良品質(zhì)、提高植物抗性及闡明天然活性成分生物合成機(jī)理等方面起到至關(guān)重要的作用。

豐富的植物種類是人類的珍貴資源。中藥多來源于植物，其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)大多是植物次生代謝物。通常天然植株中目的代謝物含量較低，如紫杉醇、青蒿素等，同時(shí)對藥用植物有效成分進(jìn)行化學(xué)合成時(shí)，又會(huì)遇到工藝流程復(fù)雜、成本高、合成過程中副反應(yīng)多及污染環(huán)境等問題。近年來，隨著對植物次生代謝產(chǎn)物合成生物學(xué)研究的深入認(rèn)識(shí)，以及分子克隆和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的飛速發(fā)展，利用基因工程大規(guī)模生產(chǎn)植物組織代謝物已經(jīng)成為該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

在基因編輯技術(shù)出現(xiàn)之前，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物引發(fā)了許多社會(huì)爭論，但CRISPR-Cas9技術(shù)有望大大改善這種現(xiàn)狀，其成本低廉和簡便易行的特點(diǎn)可很快獲得具有商業(yè)前景的農(nóng)作物。在生產(chǎn)植物組織代謝物方面，由于資源有限，代謝工程不可能對所有代謝物質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模篩選，所以為提高基因編輯技術(shù)的利用率，只能將研究資源集中到被廣泛需要的藥用成分以及主要農(nóng)作物中與抗性、品質(zhì)相關(guān)的次生代謝途徑上。

總之，CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，技術(shù)手段也在不斷更新和完善，比如靶位點(diǎn)的突變效率和特異性的進(jìn)一步提高，這為各種植物基因編輯體系的建立提供了充足的理論知識(shí)和可借鑒經(jīng)驗(yàn)。由此推測，CRISPR-Cas9技術(shù)有望在突變效率、穩(wěn)定性與安全性等方面得到更快的發(fā)展，其推廣也必將會(huì)對人類疾病治療、基因組定點(diǎn)編輯和植物遺傳育種產(chǎn)生革命性的影響。