曹丹，馬林龍，劉艷麗，王麗麗，金孝芳*

1.湖北省農業(yè)科學院果樹茶葉研究所，武漢 430064；

2.福建省農業(yè)科學院茶葉研究所，福州 355000

MicroRNA（miRNA）是一類長度約為20 nt的單鏈RNA，主要通過誘導靶基因mRNA降解或抑制其翻譯起負調控作用。1993年，Lee等［1］首次在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）體內發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA基因（lin-4）。隨著生物技術手段的不斷進步，越來越多的miRNA及其靶基因被挖掘出來。MiRNA獲得的方法主要有正向遺傳篩查、生物信息學分析、直接克隆、表達序列標簽（expressed sequences tag，EST）分析和高通量測序等［2-3］。根據(jù)Sanger miRBase 22.0的最新數(shù)據(jù)，目前在271個物種中共有48 885條成熟miRNA和38 589條miRNA前體序列，且數(shù)據(jù)仍然在不斷更新和完善中。已知miRNA廣泛存在于植物、動物和線蟲等生物體中，參與許多生物學過程，主要包括生長發(fā)育、代謝、蛋白降解、信號轉導和逆境脅迫等［4-6］。

營養(yǎng)元素在植物生命活動中具有重要的功能，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在植物響應營養(yǎng)元素脅迫中發(fā)揮著至關重要的作用（表1）。

表1 植物響應營養(yǎng)元素脅迫的miRNAsTable 1 MiRNAs responding to nutrient stress in plants

1 MiRNA參與低磷脅迫

土壤中的磷易被鐵、鈣、鋁等元素固定，降低其遷移率，引發(fā)有效磷缺乏，而土壤中缺乏有效磷已成為限制農業(yè)發(fā)展的重要因素之一［7］。MiR399e和miR399g在調節(jié)大豆磷平衡中發(fā)揮了重要作用。高磷高氮條件下，OE-miR399e-6和OE-miR399e-7轉基因大豆老葉的可溶性磷含量分別是野生型的2.31倍和2.37倍；同時在OE-miR399g-1轉基因株系中，相比于高磷高氮，高磷低氮更有利于可溶性磷在老葉中積累。另外，過表達OE-miR399g-1大豆株系的總磷含量在3個磷氮處理下（高磷高氮、低磷低氮、高磷低氮）均高于野生型［8］。Du等［9］發(fā)現(xiàn)miR399在玉米缺乏磷元素時高表達，miR399b轉基因玉米芽中積累了大量的磷元素，表現(xiàn)出典型的磷中毒性狀。進一步研究發(fā)現(xiàn)，磷缺乏誘導的長非編碼RNA1（PILNCR1）與miR399互作對玉米的低磷耐受性具有重要作用。劉浩等［10］發(fā)現(xiàn)在低磷脅迫下，miR399f、35S：MIM156、35S：MIM156miR399f轉基因植株中的無機磷含量均高于野生型，推測miR399和miR156共同參與調控磷元素平衡。miR827的靶基因是NLA（nitrogen limitation adaptation），NLA可與磷酸轉運蛋白基因在細胞膜上互作，從而調節(jié)植物磷平衡［11］。在煙草中發(fā)現(xiàn)，缺磷可誘導miR827差異性表達，靶基因NsSPXMFS1和NsSPX-MFS2分別下調和上調，酵母試驗結合亞細胞定位結果推測，miRNA827及其靶基因可能通過介導細胞質和液泡中磷的轉運實現(xiàn)對植株的磷調控［12］。

此外，缺磷還可誘導擬南芥中的miR778表達上調、miR398表達下調［13］，大豆中的miRNA894、miR159、miR1509、miR1507等上調，以及miR398、miR165、miR166、miR1511、miR1450等 下 調［14］。呂春雨等［15］將大豆miR168轉入煙草中發(fā)現(xiàn)，過表達miR168能增強煙草對低磷脅迫的耐受性，同時可能參與調控ABA和JA介導的種子萌發(fā)信號。

2 MiRNA參與硫脅迫

近年來，由于無硫低硫化肥的廣泛施用、工業(yè)含硫廢氣排放的控制以及集約化農業(yè)的實施，土壤含硫量逐漸降低，土壤缺硫的問題也隨之凸顯出來［16］。李利紅等［17］利用高通量測序技術發(fā)現(xiàn)30 mg·m-3SO2處 理 擬 南 芥72 h后，186個 保 守miRNA和16個新miRNA發(fā)生差異表達，其靶基因主要涉及信號轉導、刺激響應、代謝及轉錄調控等過程。其中miR393和miR160通過生長素信號途徑調控植株的生長發(fā)育，參與植物響應SO2脅迫。miR395靶向硫酸轉運基因（Sultr2；1）和ATP硫化酶基因（APS1、APS3和APS4），缺硫促進乙酰絲氨酸的累積，進而誘導miR395表達上調；向植株施用半胱氨酸后，植株的硫酸鹽吸收和同化被抑制，同時提高miR395的水平，而谷胱甘肽合成抑制劑丁硫氨酸亞砜胺可抑制miR395的表達，因此，該研究認為miR395是硫酸鹽合成調節(jié)網(wǎng)絡的組成部分［18-20］。此外，還有研究認為，乙烯轉錄因子SLIM1（sulfur limitation1）在一定條件下有助于miR395的累積，同時APS3和Sultr2；1表達上調，而APS1和APS4表達下調［21］。

3 MiRNA參與氮脅迫

氮是蛋白質、葉綠素、核酸及代謝產(chǎn)物的重要組成部分，植物的種子休眠、葉片發(fā)育、根部構型及開發(fā)等過程均受氮素影響［22］。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)缺氮條件下，miR160通過調控ARF16和ARF17的表達誘導側根生長，miR167可能通過解除對靶基因生長素轉錄因子的抑制促進側根生長，miR171可以通過調節(jié)SCL6抑制初生根的伸長生長；進一步的試驗發(fā)現(xiàn)，該脅迫下根系統(tǒng)實際由miR160、miR167和miR171組成的復合體調控，通過誘導miR171和miR160的表達、抑制miR167的表達來促進根的生長［23］。此外，茶樹中的miR156可能通過靶向谷氨酸受體基因GLK和丙酮酸激酶基因PK參與調控氮缺乏時的茶氨酸代謝［24］。趙勐等［25］發(fā)現(xiàn)缺氮條件下，miR169a在擬南芥根和地上部表達下調，其靶基因NFYA5過表達植株的生物量明顯高于野生型，推測miR169a通過調控NFYA5參與植物應對氮脅迫，同時轉基因植株根部與地上部的總氮含量均低于野生型，硝酸鹽轉運蛋白基因AtNRT1；1和AtNRT1；2的表達水平均低于野生型，說明miR169a在植物應對氮素含量變化過程中發(fā)揮著重要的調控作用。缺氮條件下，擬南芥miR5090和miR826過表達植株均顯示出較強的耐受性，生物量和氮含量增加，長出更多的側根和初生根等，同時AtNRT2；1和AtNRT1；5表達量增加，說明氮的吸收能力增強［26］。謝文召等［27］研究發(fā)現(xiàn)小麥miR1129對氮素呈典型的濃度及時間依賴性，低氮條件下miR1129超表達植株較野生型形態(tài)增大、干重增多及氮含量增加，推測miR1129在植物抵御低氮脅迫中起著非常重要的作用。低氮處理時，miR393a在光皮樺根和葉中的表達先下調后上調，在恢復組中均上調表達；而在莖中，低氮處理4 d后miR393a明顯上調，恢復組中明顯下調，表明miR393及其靶基因在低氮脅迫響應中發(fā)揮著調控作用［28］。孫青等［29］在玉米中發(fā)現(xiàn)，miR528在低氮處理時表達下調，其靶基因ZmLAC3和ZmLAC5表達上調，而在高氮處理時miR528表達上調；轉基因試驗發(fā)現(xiàn)，高氮下ZmmiR528可能通過調控其靶基因的表達，影響木質素的合成，從而調節(jié)玉米的倒伏性。此外，miR397靶向一個含有Cu2+的多酚氧化還原酶基因，在豆科植物百脈根結瘤時被誘導表達，參與共生固氮［30］。

4 MiRNA參與低鉀脅迫

在番茄中采用sRNA高通量測序發(fā)現(xiàn)，miR156d-5p、miR168a、miR319a、miR319b、miR319c、miR477-3p及miR9472-3p7個miRNAs均可響應低鉀脅迫［31］，miR171b、miR167g-5p、miR167b、miR168a在番茄根系中表達差異顯著［32］。葉芝蘭等［33］利用小RNA和降解組在西藏野生大麥XZ153和栽培品種浙大9號中鑒定到65個響應低鉀脅迫的候選差異miRNA。其中miR164c、miR169h、miR395a及其靶基因參與了三羧酸循環(huán)、糖酵解和磷酸戊糖途徑，miR166g和miR482參與植物鈣信號調節(jié)，miR171e和miR396c參與調控乙烯生物合成過程中的蛋氨酸補償途徑，這些差異表達miRNA在耐低鉀品種響應低鉀脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。李倩等［34］研究發(fā)現(xiàn)，低鉀處理下的花生根系中有20個miRNA及其靶基因發(fā)生差異表達，其中miR160表達差異倍數(shù)最高。

5 MiRNA與其他營養(yǎng)元素

利用組學技術分析發(fā)現(xiàn)，柑橘在缺鐵情況下，葉片中有50個miRNA表達上調，31個表達下調［35］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR397、miR172、miR408、miR319、miR477和miR398可能在柑橘應對缺鐵過程中起著至關重要的作用；在缺硼條件下，miR397及其靶基因LAC7均發(fā)生差異性表達，推測miR397通過負調控其靶基因LAC7提高漆酶活性和增加木質素的累積以應對硼脅迫。盧藝彬等［36］利用Illumina測序發(fā)現(xiàn)，缺硼條件下，雪柑根系中分別有52個差異表達miRNA上調和82個miRNA表達下調，miRNA主要通過激活防御系統(tǒng)、增加側根、改善滲透調節(jié)等方面來調控根系對缺硼的適應性；此外，在葉片中獲得了91個上調和81個下調差異表達miRNA，葉片miRNA對缺硼適應性主要表現(xiàn)在削弱生長發(fā)育、穩(wěn)定葉片表型、減少硼運出以及提高超氧化物歧化酶活性等。

高鋁脅迫8 h后，日本晴根系中有13個表達下調的miRNA和6個表達上調的miRNA，而在“Embrapa Taim”品種中有5個下調和3個上調表達的miRNA，結合靶基因分析推測這些miRNA通過調控多種代謝途徑來參與水稻對高鋁脅迫的抗性［37］。Chen等［38］利用高通量測序技術發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿在遭受鋁毒害過程中，有23個miRNA發(fā)生響應，大多數(shù)響應基因表達下調，將這些miRNA分成迅速響應、延遲響應和持續(xù)性響應三種類型，其中大部分屬于迅速響應型。譚國勝等［39］在耐鋁大豆中鑒定到9個miRNA響應鋁脅迫時表達下調，推測它們與大豆的抗鋁脅迫相關。相比于抗氧化脅迫相關的miR169r，調控大豆根伸長的miR166k/o、miR390g和miR396c/k在抗鋁脅迫過程中發(fā)揮了更重要的作用［40］。

薛澤云等［41］利用高通量測序技術在鳳丹中發(fā)現(xiàn)12個保守miRNA和18個新miRNA響應銅脅迫差異性表達。杜秋霞等［42］在銅脅迫下的桑葉組織中鑒定到40個miRNA差異表達，其中27個上調表達和13個下調表達。楊惠荔等［43］研究發(fā)現(xiàn)，小麥在銅脅迫下添加外源硅，分別有miRNA156、miRNA396、miRNA894等58個miRNA表達上調，miRNA159、miRNA393、miRNA160等41個miRNA表達下調；銅脅迫下添加外源一氧化氮，分別有miRNA482、miRNA531、miRNA894等26個miRNA表達上調，miRNA159、miRNA166、miRNA396等66個miRNA表達下調。

6 展望

隨著高通量測序技術的發(fā)展，越來越多的營養(yǎng)脅迫相關miRNA被挖掘出來，但其功能和調控機制的研究依然很少。一個miRNA可以響應多種營養(yǎng)元素脅迫，一種營養(yǎng)元素脅迫也存在多個miRNA響應，這形成了復雜的調控網(wǎng)絡。如miR160同時響應S、N、K、B、Al、Cu等元素脅迫，P、S、N等元素脅迫中均有多個miRNA發(fā)生響應，但它們之間是如何相互作用的，有待于進一步深入開展研究。此外，對K、Fe、B、Al、Cu等元素而言，雖然鑒定到許多差異表達基因，但大多數(shù)研究僅停留在基因表達層面，哪些是關鍵調控基因以及調控機理尚不明確。因此，加大對營養(yǎng)元素脅迫相關miRNA的研究力度，對選育植物耐性品種和提高植物對營養(yǎng)元素脅迫的適應能力都具有重要的作用。