湯琦 李惠 晉萍 張祥武 唐一吟 周紹強(qiáng) 陳德滇

隨著乳腺癌診療水平提高，越來越多的早期乳腺癌患者可通過行前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)（sentinel lymph node biopsy，SLNB）免于不必要的腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)（axillary lymph node dissection，ALND），減少上肢水腫的的發(fā)生，提高生存質(zhì)量[1-3]。前哨淋巴結(jié)（sentinel lymph node biopsy，SLN）病理檢查常用的方法包括術(shù)中快速病理法（冷凍法）、印片細(xì)胞學(xué)法（imprint cytology，IC），術(shù)后石蠟切片法、RT-PCR 檢測CK19 及術(shù)后免疫組織化學(xué)法等[4]。根據(jù)《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2021 年版)》，冷凍法和(或)IC 均作為SLN 術(shù)中診斷的常規(guī)檢測方法[5]?，F(xiàn)場快速評估(rapid on-site evaluation，ROSE)是一種可在手術(shù)現(xiàn)場利用Diff-Quick（DQ）細(xì)胞染色液對IC 進(jìn)行快速染色及對標(biāo)本快速評估的診斷技術(shù)。目前，ROSE 技術(shù)主要應(yīng)用于超聲支氣管鏡的輔助檢查[6-7]，而應(yīng)用于乳腺癌SLNB 國內(nèi)外尚鮮見。本研究旨在通過ROSE技術(shù)對乳腺癌SLNB 進(jìn)行評估，并聯(lián)合冰凍檢查，對SLN 是否轉(zhuǎn)移進(jìn)行術(shù)中快速診斷，探討該技術(shù)在乳腺癌SLNB 中的臨床應(yīng)用及推廣價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

納入2019 年12 月至2021 年12 月于云南省腫瘤醫(yī)院確診的早期乳腺癌患者共375 例，均為女性，分為行SLNB 組195 例（A 組）、新輔助化療后行SLNB 組180 例（B 組），中位年齡A 組為55 歲、B 組為56 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）A、B 組患者均為經(jīng)病理證實為原發(fā)性乳腺癌可行手術(shù)的患者；2）A 組患者臨床體格檢查和影像學(xué)檢查均提示腋窩淋巴結(jié)陰性，B 組患者符合新輔助化療條件[5]且病理證實腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）既往有過患側(cè)腋窩、內(nèi)乳或胸部手術(shù)史；2）處于妊娠期或哺乳期女性；3）曾行放療、化療；4）合并其他腫瘤病史。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)和患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 研究方案 A 組患者均為臨床腋窩淋巴結(jié)陰性，所有檢出SLN 均術(shù)中行ROSE 評估，并聯(lián)合冰凍檢查，95% 乙醇固定后，IC 行細(xì)胞學(xué)巴氏染色及H&E 染色比較，術(shù)后常規(guī)行石蠟切片病理檢查；B 組患者均行新輔助化療，化療前均行腋窩淋巴結(jié)穿刺，臨床分期（c）T1～3N1～2M0 患者參照 Judy 等[8]研究行SLNB 及ALND，檢出的SLN 處理同A 組患者。

1.2.2 SLN 獲取 術(shù)中常規(guī)消毒鋪巾，SLN 示蹤劑1～2 mL 注射于乳暈區(qū)或腫瘤表面皮內(nèi)或皮下，適當(dāng)按壓，10～15 min 后手術(shù)切取SLN[9]。所有患者均獲取 SLN 枚數(shù)＞2 枚。

1.2.3 制片 將所取SLN 沿長軸以2 mm 間隔分切，每一個切面均在黏附玻片上印1 個印跡，每個淋巴結(jié)印3 個玻片。玻片1 進(jìn)行ROSE 染色，玻片2、3 以95%乙醇固定，行細(xì)胞學(xué)巴氏染色及H&E 染色（作為ROSE 技術(shù)準(zhǔn)確性驗證），組織切塊按照順序標(biāo)記后依次送術(shù)中冷凍檢查，術(shù)后石蠟切片病理檢查。

1.2.4 染色 1）將標(biāo)記的IC 玻片1 于DQ 的A 溶液中染色（玻片在染液中上下6～8 次或浸泡10～20 s）；2）將玻片置于磷酸鹽緩沖溶液中洗凈，可稍甩干；3）再將玻片浸泡于DQ 的 B 溶液中，方法同DQ的A 溶液；4）干燥玻片，及時鏡檢。所需試劑：DQ 的A 溶液（主要成分為曙紅、甲醇），DQ 的 B 溶液（主要成分為亞甲藍(lán)）及磷酸鹽緩沖液。

1.2.5 檢測 以淋巴結(jié)為單位，ROSE 染色在IC 任何一個切面中可見癌細(xì)胞判為轉(zhuǎn)移，未見癌細(xì)胞判為未轉(zhuǎn)移，可疑癌細(xì)胞等待冰凍進(jìn)一步確認(rèn)。SLNB 可見轉(zhuǎn)移者，根據(jù)《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2021 年版）》[5]，即刻對有必要的患者實施ALND。

1.2.6 ROSE 技術(shù)質(zhì)量控制 SLN 取材后立即由術(shù)者在病理醫(yī)師協(xié)助下，于手術(shù)室進(jìn)行現(xiàn)場制片、染色，現(xiàn)場通過倒置顯微鏡觀察，病理醫(yī)師進(jìn)行診斷，確保過程嚴(yán)格規(guī)范。IC 后SLN 送術(shù)中冰凍、細(xì)胞學(xué)巴氏染色、H&E 染色及術(shù)后石蠟切片病理檢查。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析ROSE 診斷效能，計算 ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）的 95%CI 并分別進(jìn)行比較，采用 Medcalc V19.0.4 軟件進(jìn)行Z檢驗。敏感度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%，特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽性）例數(shù)×100%，診斷準(zhǔn)確率=（真陽性+真陰性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本特征

375 例患者的基本特征見表1。

表1 375 例乳腺癌患者基本特征

2.2 SLNB 后鏡下所見

每例患者術(shù)中常規(guī)取2～6 枚SLN，A 組和B 組患者分別共取SLN 為444 枚和479 枚。術(shù)中IC 行ROSE 染色，診斷平均時間為6.53 min/例（術(shù)中冰凍平均時間為36.42 min/例），A、B 組操作流程見圖1。如SLN 未見轉(zhuǎn)移，鏡下可清晰見到背景干凈無沉渣、紫蘭色大小一致的淋巴結(jié)細(xì)胞（圖2）；如SLN 可見轉(zhuǎn)移，鏡下可明確見到癌細(xì)胞深染，聚集呈“桑椹樣”團(tuán)塊（圖3），癌細(xì)胞呈異型性，較正常淋巴結(jié)細(xì)胞增大，形態(tài)不一，細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)比例增高，細(xì)胞核可見多形性、深染、染色質(zhì)粗顆粒狀、分布不均、核仁明顯、體積大，核分裂像增多。術(shù)中使用示蹤劑患者分別為亞甲藍(lán)63%（236/375），納米碳17%（64/375），核素聯(lián)合藍(lán)染料14%（52/375），吲哚菁綠（ICG）熒光法6%（23/375），采用不同示蹤劑獲取的SLN 對ROSE 評估診斷無影響。

圖1 研究方案操作流程

圖2 行SLNB 未見轉(zhuǎn)移的正常SLN 細(xì)胞

圖3 行SLNB 可見轉(zhuǎn)移的SLN 細(xì)胞

2.3 兩組的比較

A 組患者共取SLN 為 444 枚，經(jīng)ROSE 診斷轉(zhuǎn)移SLN 為30 枚，術(shù)后石蠟病理檢查確認(rèn)轉(zhuǎn)移ALN為 34 枚；B 組患者共取SLN 為479 枚，經(jīng)ROSE 診斷轉(zhuǎn)移SLN 為 91 枚，術(shù)后石蠟病理檢查確認(rèn)轉(zhuǎn)移ALN 為 97 枚（表2）。以術(shù)后石蠟病理檢查作為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制ROC 曲線，計算兩組4 種診斷方法的AUC、敏感度、特異度，與術(shù)后石蠟病理檢查診斷進(jìn)行比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。ROSE 技術(shù)的診斷效能與其他診斷方法一致（表3）。本研究發(fā)現(xiàn)，B 組0.8%（4/479）轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)新輔助化療后可見退化壞死（圖4）。新輔助化療后未對SLN 經(jīng)IC 行ROSE 診斷造成不良影響。

表2 各診斷技術(shù)可見轉(zhuǎn)移SLN 數(shù)目（枚）

表3 各診斷技術(shù)Z 檢驗及McNemar 檢驗比較

圖4 新輔助化療后ROSE 染色的SLN 轉(zhuǎn)移可見部分退化壞死（ROSE×40）

3 討論

IC 與冰凍均是術(shù)中評估乳腺癌SLN 的可靠方法，可作為SLN 轉(zhuǎn)移而行ALND 的依據(jù)[9]。ROSE 可作為一種IC 快速染色的新技術(shù)聯(lián)合冰凍應(yīng)用于乳腺癌SLNB 診斷[10]。與其他診斷技術(shù)相比，IC 對SLN 轉(zhuǎn)移具有高度特異度，本研究采用ROSE 技術(shù)的A、B 組特異度分別為97.56%、98.43%，與Petropoulou 等[11]研究發(fā)現(xiàn)行IC 的特異度高達(dá) 98.75%相一致。以術(shù)后石蠟病理檢查作為金標(biāo)準(zhǔn)，ROSE 技術(shù)顯示出等同于冰凍、細(xì)胞學(xué)巴氏染色及H&E 染色的診斷效能，且不同示蹤劑對于ROSE 染色均無不良影響。

研究顯示，術(shù)中冰凍聯(lián)合其他診斷技術(shù)評估SLN 可提高診斷敏感度[12]。本研究ROSE 技術(shù)與冰凍檢查相結(jié)合，在提高準(zhǔn)確性同時，提高了診斷效率。ROSE 平均用時6.53 min/例即可診斷，若ROSE 結(jié)果為陰性，患者可轉(zhuǎn)至復(fù)蘇室等待冰凍結(jié)果，二者均為陰性則手術(shù)結(jié)束，加快了手術(shù)室的周轉(zhuǎn)利用；若ROSE明確1～2 枚及以上SLN 轉(zhuǎn)移，且術(shù)前評估不能行術(shù)后放療的患者，則可即刻實施ALND[9]，減少不必要麻醉等待時間（平均29.89 min/例）。

ROSE 所需設(shè)備僅一臺倒置顯微鏡，試劑價格低廉易獲取、儲存要求低，試劑及顯微鏡均可常備置于手術(shù)室。其染色方法步驟簡單，學(xué)習(xí)曲線短，不同示蹤劑不影響染色效果，染色制片后便可于手術(shù)室現(xiàn)場由病理科醫(yī)師對SLN 是否轉(zhuǎn)移進(jìn)行診斷。

目前，ROSE 技術(shù)存的局限性主要因孤立腫瘤細(xì)胞蔟（isolated tumor cells，ITCs）以及腫瘤大小≤2.0 mm微轉(zhuǎn)移病灶的癌細(xì)胞簇的體積極小，難以在玻片上留下印跡，可能影響IC 導(dǎo)致術(shù)中ROSE 的假陰性(false negative，F(xiàn)N)。但跟據(jù)《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2021 年版）》，僅有ITCs 的淋巴結(jié)不判定為SLN 轉(zhuǎn)移，無需行ALND，因此對術(shù)中術(shù)式的抉擇不會造成不良影響；對于腫瘤大小≤2.0 mm 微轉(zhuǎn)移病灶，因術(shù)中ROSE 與冰凍檢查相結(jié)合，亦可確保術(shù)中進(jìn)一步的策略選擇[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，新輔助化療后 0.8%（4/479）極低比例的轉(zhuǎn)移SLN 經(jīng)新輔助化療后呈退化壞死，但未對ROSE 診斷的準(zhǔn)確性造成不良影響。本研究對于初診確認(rèn)腋窩淋巴結(jié)陽性患者行新輔助化療后，對腋窩淋巴結(jié)處理較為謹(jǐn)慎，均給予ALND。ROSE 技術(shù)的開展，且與冰凍檢查相結(jié)合，可為后續(xù)提高術(shù)前cN1、經(jīng)新輔助化療病理分期（yp）N0 患者的豁免ALND 提供更為準(zhǔn)確及可靠的依據(jù)。

綜上所述，ROSE 作為一種新的評估方法聯(lián)合冰凍用于乳腺癌SLNB，具有良好的臨床應(yīng)用前景及推廣價值。