劉蕓如，趙范范，葉慧敏，商迎輝，李夢潔，黃漢昌，勞鳳學(xué)

（北京聯(lián)合大學(xué)功能因子與腦科學(xué)研究院，北京市生物活性物質(zhì)和功能食品重點實驗室，北京 100191）

阿爾茨海默病（alzheimer disease，AD）是與衰老相關(guān)的最普遍的神經(jīng)退行性疾病，對全球超過4 000萬 人造成影響[1-2]，已成為一個重大的公共衛(wèi)生問題，給個人、社會和經(jīng)濟帶來巨大負擔[2-3]。AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）退行性疾病，其特征為病理性腦標志，例如淀粉樣蛋白β（amyloid-β，Aβ）斑塊、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和微管相關(guān)Tau蛋白磷酸化變化[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細胞中具有重要功能，包括翻譯后修飾、折疊和新合成的分泌蛋白組裝，對細胞的生存至關(guān)重要。因此，任何影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的外部或內(nèi)部因素最終都會導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成、翻譯和折疊的中斷，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)未折疊或錯誤折疊，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一類有益于人類健康的非黃酮類多酚化合物，存在于紅葡萄、紅酒和其他植物性食品中，常用作腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的化學(xué)預(yù)防劑[5]。天然的Res存在兩種異構(gòu)體：順式和反式（圖1），在自然界中Res大多以反式構(gòu)象存在。由于具有多種生物學(xué)特性，包括抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護活性，已引起研究人員廣泛關(guān)注[6]。Res可以間接激活沉默信息調(diào)節(jié)因子-1（silent information regulator-1，SIRT1）的表達[7]并對AD病例產(chǎn)生神經(jīng)保護[8]。SIRT1可調(diào)節(jié)多種底物活性，包括p53和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活物1α[9]，從而減少Aβ積累和改善線粒體功能障礙。

圖1 Res化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical formula of resveratrol

本實驗用衣霉素（tunicamycin，TM）處理原代神經(jīng)元細胞，建立ERS模型，用Res對其進行干預(yù)，測定細胞存活率、細胞周期、自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達水平，研究Res對TM引起的細胞自噬、凋亡、周期的調(diào)節(jié)作用，為Res的功能性作用研究及AD的預(yù)防和治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級昆明系性成熟小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008。雌鼠：9～12 周齡，體質(zhì)量（25±5）g；雄鼠：11～12 周齡，體質(zhì)量（30±5）g。雌性鼠每籠5 只群養(yǎng)，雄性鼠每籠1 只單獨飼養(yǎng)。環(huán)境溫度保持在20～22 ℃，12 h/12 h光照黑暗交替環(huán)境，按常規(guī)飼養(yǎng)。

DMEM/F12營養(yǎng)培養(yǎng)基、B-27無血清添加劑50X、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、StemPro accutase細胞解離試劑 美國Gibco公司；Res 北京索萊寶科技有限公司；TM（用二甲基亞砜溶解配制成質(zhì)量濃度10 μg/μL的儲存液，-20 ℃保存，使用時以培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度） 北京華越洋生物科技有限公司；抗Neu N單克隆抗體、抗鼠IgG辣根過氧化酶標記抗體北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司；細胞周期檢測試劑盒 北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

E191IR CO2細胞培養(yǎng)箱 美國金西盟公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Varioskan Flash多功能酶標儀、ND-1000型紫外-可見分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；流式細胞儀 美國BD公司；凝膠成像分析儀 日本Image Quant Rtecl公司；5840R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；043BR57802轉(zhuǎn)膜裝置、EN027015電泳裝置 美國Bio-Rad公司；TCS SP5激光共聚焦顯微鏡 德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 原代神經(jīng)元細胞的分離提取

取孕期18 d小鼠，脫頸處死后浸泡于體積分數(shù)75%乙醇溶液中。在超凈臺內(nèi)解剖子宮，將胎盤包裹的胎鼠置于預(yù)冷的pH 7.6、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，逐個取出胎鼠的大腦皮質(zhì)，迅速用無菌鑷子剝離腦膜，剝離干凈的腦組織轉(zhuǎn)移至含有500 μL DMEM/F12營養(yǎng)培養(yǎng)基（V（DMEM）∶V（F12）＝1∶1）的2 mL離心管中，用1 mL移液管輕柔吹打，隨后將離心管置于冰上靜置10 min左右，使未被打散的組織塊沉淀于離心管底部；取上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，向組織塊中加入細胞解離試劑，置于37 ℃培養(yǎng)箱酶解15 min，適當吹打后加入至之前的上清液中，800 r/min離心5 min，棄上清液，加入神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSC）無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為1.0×109個/L，接種于用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 原代神經(jīng)元的免疫熒光鑒定

從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)8 d的原代神經(jīng)元，吸去培養(yǎng)液，用PBS輕輕漂洗細胞2 遍，加入質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定15 min。固定結(jié)束后，用PBS輕輕漂洗3 遍，每次漂洗10 min，以棄去多余的多聚甲醛。封閉1 h，棄上清液，加入一抗（抗鼠Neu N單克隆抗體），在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。棄一抗，用PBS輕輕漂洗3 次，結(jié)束后加入二抗（山羊抗兔FITC-IgG），37 ℃孵育1 h。棄二抗，再用PBS洗滌，加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染細胞核，室溫下作用3 min后吸去DAPI染液，用PBS洗滌，隨后加入抗熒光猝滅劑；共聚焦顯微鏡下進行觀察、拍照并做記錄。

1.3.3 ERS原代神經(jīng)元細胞模型的建立

將1.3.1節(jié)培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞直接分離提取成單細胞懸液，每孔100 μL接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h，加入不同質(zhì)量濃度梯度的TM溶液（0（對照）、0.625、1.25、2.5、5、7.5、10 μg/mL）處理24 h（37 ℃、5% CO2條件下，下同），每個質(zhì)量濃度設(shè)置6 個復(fù)孔；確定最佳TM損傷處理質(zhì)量濃度（2.5 μg/mL）后，利用2.5 μg/mL TM分別處理神經(jīng)元細胞0（對照）、8、12、18、24、36 h，每個時間設(shè)置6 個復(fù)孔。利用酶標儀測定450 nm波長處OD值，并確定TM最佳損傷處理質(zhì)量濃度和處理時間。用2.5 μg/mL的TM處理原代神經(jīng)元細胞24 h，進行后續(xù)實驗操作。用下式計算細胞存活率。

1.3.4 Res干預(yù)條件的篩選以及細胞分組與給藥

根據(jù)細胞存活率篩選Res的最佳干預(yù)條件，神經(jīng)元細胞經(jīng)不同濃度（0（對照）、0.625、1.25、2.5、5、10、15、20、25 μmol/L）Res預(yù)處理10 h后再加入質(zhì)量濃度2.5 μg/mL TM處理24 h，結(jié)果顯示5 μmol/L Res處理保護效果最好；利用5 μmol/L Res分別處理神經(jīng)元細胞0、2、6、10、14、24 h，再加入質(zhì)量濃度2.5 μg/mL TM處理24 h，結(jié)果顯示Res處理10 h保護效果最好。用TM最佳損傷質(zhì)量濃度建立ERS原代神經(jīng)元細胞模型，實驗分組設(shè)置為對照組、TM組、Res組和Res＋TM組。其中對照組不做處理，TM組僅使用質(zhì)量濃度2.5 μg/mL TM處理，Res組僅使用5 μmol/L Res處理，R10T組先用5 μmol/L Res預(yù)處理10 h后，再加入質(zhì)量濃度2.5 μg/mL TM后處理24 h；R0T組用5 μmol/L Res和2.5 μg/mL TM同時處理24 h。為了探究Res保護神經(jīng)元的作用機制，R10T組細胞在加入TM處理之前以及R0T組同時加入Res和TM處理之后分別先用ERS抑制劑4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）預(yù)處理4 h或GSK-3β抑制劑SB216763預(yù)處理2 h，然后再加TM處理。

1.3.5 原代神經(jīng)元細胞周期檢測

將藥物處理后的神經(jīng)元細胞消化并再次收集，洗滌后加入預(yù)冷的體積分數(shù)95%乙醇溶液，4 ℃下固定，再加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液染色30 min。染色后24 h內(nèi)用流式細胞儀檢測紅色熒光（激發(fā)波長488 nm）。使用Cellquestpro軟件收集數(shù)據(jù)，使用Flow Jo軟件分析細胞周期。

1.3.6 細胞凋亡率檢測

神經(jīng)元細胞經(jīng)藥物處理并消化后，用PBS洗滌2 次，按Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒說明書步驟制備所需染色液并進行流式細胞儀分析。分析前用200 目濾網(wǎng)過濾細胞。檢測完成后，運行計算機軟件分析并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.7 Western blot檢測

細胞培養(yǎng)與藥物處理同1.3.1節(jié)和1.3.4節(jié)。收集神經(jīng)元細胞用于蛋白的提取，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2～3 次后，將培養(yǎng)皿置于冰上，在皿內(nèi)加入150 μL細胞裂解液并與細胞混勻，使用細胞刮收集細胞于培養(yǎng)皿中，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000×g離心15 min后收集上清液，收集的蛋白樣品中加入5×十二烷基硫酸鈉Loading Buffer（V（樣品）∶V（5×十二烷基硫酸鈉Loading Buffer）＝4∶1），放入熱水中煮沸變性，BCA法測定上清液中蛋白質(zhì)量濃度。等濃縮膠完全凝固以后，用微量移液槍吸取相應(yīng)蛋白樣品，將蛋白樣品緩慢注入到上樣孔內(nèi)，設(shè)定電壓為80 V，時間100 min。將目標蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，利用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃條件下振蕩過夜孵育。TBST緩沖液10 min洗滌3 次，二抗37 ℃孵育2 h，用TBST緩沖液洗滌3 次。將ECL A液和ECL B液等體積混合后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光膜上條帶。用β-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件分析條帶的灰度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，每組進行3 次重復(fù)。采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，并用Origin 9.1軟件作圖。數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多因素比較采用Bonferroni法。P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代神經(jīng)元細胞及鑒定

培養(yǎng)24 h后，原代神經(jīng)元分化為軸突。分化后觀察神經(jīng)元形態(tài)，胞體呈橢圓形或圓形，有清晰暈圈。神經(jīng)元按狀態(tài)分為3 種類型：1）雙極神經(jīng)元，其胞體兩側(cè)有一個突起；2）多級神經(jīng)元，其胞體有一個長突起和多個短突起；3）假單胞菌級神經(jīng)元，其胞體只出現(xiàn)一個長突起，但迅速分散成T形（圖1）。

圖1 神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察Fig. 1 Morphological observation of neurons

對神經(jīng)元進行熒光鑒定，利用DAPI染核來標記細胞核，結(jié)果如圖2A所示；Neu N僅在分化神經(jīng)元細胞中表達，用山羊抗兔FITC-IgG進行標記，呈紅色熒光（圖2B）；二者圖像疊加如圖2C所示，圖2D是正常狀態(tài)下的神經(jīng)元細胞，通過圖2C中呈現(xiàn)熒光的細胞可確定該細胞為神經(jīng)元。

圖2 神經(jīng)元細胞鑒定Fig. 2 Identification of neuronal cells

2.2 TM和Res對海馬神經(jīng)元細胞增殖的影響

2.2.1 TM作用質(zhì)量濃度的篩選

ERS是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，大量未折疊或異常折疊蛋白質(zhì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)過負荷。TM是一種N-糖鏈抑制劑，可以阻礙新合成的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的糖基化修飾，使糖鏈加工受阻，從而形成脫糖蛋白，誘導(dǎo)ERS。根據(jù)細胞存活率篩選TM的最佳作用質(zhì)量濃度，通常當細胞存活率下降至60%左右時（即下降40%）為最有效的損傷處理質(zhì)量濃度。如圖3所示，與對照組相比，TM質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL時開始出現(xiàn)顯著抑制作用（P＜0.05），當TM質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL和5 μg/mL時，原代神經(jīng)元細胞的存活率分別為64.22%和55.27%。由于原代培養(yǎng)的神經(jīng)元敏感性較強且本身存在一定的ERS[10]，本實驗選擇質(zhì)量濃度2.5 μg/mL的TM建立ERS神經(jīng)元細胞模型。

圖3 不同質(zhì)量濃度的TM對原代神經(jīng)元細胞活性的影響Fig. 3 Dose-dependent effect of TM on the viability of primary neurons

2.2.2 TM作用時間的篩選

如圖4所示，與對照組相比，TM處理12 h后細胞存活率為79.74%，顯著下降（P＜0.05），TM處理24 h后細胞存活率為64.72%，極顯著下降（P＜0.01），TM處理36 h后細胞存活率為50.85%，高度顯著下降（P＜0.001），說明TM處理時間過長，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，不利于后續(xù)實驗進行。因此建立ERS神經(jīng)元細胞模型時，TM處理時間設(shè)置為24 h。

圖4 不同TM處理時間對原代神經(jīng)元細胞活性的影響Fig. 4 Effect of TM treatment time on the viability of primary neurons

2.2.3 Res作用濃度的篩選

如圖5所示，隨著Res濃度的升高，神經(jīng)元的細胞存活率在升高到一定程度后不斷降低。與TM組相比，5 μmol/L Res組的細胞存活率為80%左右（P＜0.05）；當Res濃度為0.625、1.25 μmol/L和2.5 μmol/L時，與TM組相比無顯著性差異（P＞0.05），說明Res預(yù)處理濃度較低時不能發(fā)揮作用；當Res濃度為15 μmol/L時，細胞存活率為64.73%，與TM組存活率幾乎持平。當Res濃度為25 μmol/L時，細胞存活率為43.73%，與TM組相比存在極顯著差異（P＜0.01），表明當Res濃度超過15 μmol/L時，失去保護神經(jīng)細胞的功能。綜上，預(yù)處理10 h濃度為5 μmol/L的Res能減弱TM引起神經(jīng)元細胞的ERS作用，提高神經(jīng)元存活率，延緩神經(jīng)元的凋亡。因此，本實驗后續(xù)選擇Res處理濃度為5 μmol/L。

圖5 不同濃度Res預(yù)處理對TM引起的原代神經(jīng)元細胞損傷的影響Fig. 5 Dose-dependent effect of Res on cell viability of primary neurons damaged by TM

2.2.4 Res作用時間的篩選

由圖6可知，與TM組相比，Res預(yù)處理14 h后細胞存活率顯著升高（P＜0.05），但細胞存活率低于Res預(yù)處理10 h組。這一結(jié)果說明Res保護神經(jīng)元的作用受到預(yù)處理時間的影響，預(yù)處理時間太短發(fā)揮不了保護作用，時間過長會失去保護作用，可能是由于Res的生物活性發(fā)生了改變，其原因需要進一步探究。因此，選擇Res預(yù)處理時間為10 h。

圖6 Res預(yù)處理時間對TM引起的原代神經(jīng)元細胞損傷的影響Fig. 6 Effect of Res preconditioning time on cell viability of primary neurons damaged by TM

2.3 TM誘導(dǎo)原代神經(jīng)元內(nèi)ERS信號通路的激活

熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是一類應(yīng)激蛋白，該蛋白可以短時間結(jié)合其他蛋白，并協(xié)助其進行正確折疊。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）屬于熱休克蛋白Hsp70亞家族，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。GRP78對保證蛋白質(zhì)進行正常的糖基化和折疊、膜蛋白和分泌蛋白的正確定位以及阻止異常的蛋白是必不可少的。氧化應(yīng)激、化學(xué)毒性、糖基化抑制劑（如TM）和缺氧等條件可以誘導(dǎo)GRP78表達從而引發(fā)ERS。因此，GRP78水平是ERS的重要檢測指標。

如圖7所示，與對照組相比，質(zhì)量濃度2.5 μg/mL TM處理24 h后，GRP78相對表達量高度顯著升高（P＜0.001），進一步驗證了ERS原代神經(jīng)元細胞模型建立成功。與TM組相比，R10T組GRP78相對表達量極顯著降低（P＜0.01），而R0T組GRP78相對表達量差異不顯著。結(jié)果表明，Res預(yù)處理神經(jīng)元可以下調(diào)GRP78表達，緩解TM所引起的原代神經(jīng)元ERS。

圖7 Res對ERS原代神經(jīng)元模型中GRP78表達水平的影響Fig. 7 Effect of Res on GRP78 expression level in ERS primary neurons

2.4 Res作用于ERS原代神經(jīng)元細胞模型后對原代神經(jīng)元細胞的影響

如圖8所示，與對照組相比，TM組細胞凋亡率高度顯著升高（P＜0.001）。與TM組相比，R10T組細胞凋亡率極顯著降低（P＜0.01），為（12.30±0.64）%。結(jié)果表明，5 μmol/L Res能抑制TM引起的原代神經(jīng)元細胞凋亡。

圖8 Res對TM誘導(dǎo)后的原代神經(jīng)元細胞凋亡率的影響Fig. 8 Effect of Res on the apoptosis rate of primary neurons damaged by TM

2.5 Res對ERS神經(jīng)元細胞模型ERS的影響

2.5.1 Res對ERS神經(jīng)元細胞模型中Caspase 3表達水平的影響

ERS激活后，可以通過肌醇依賴性激酶1α（inositol requiring enzyme 1α，IRE1α）下游的信號通路引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase 3，引起細胞凋亡。為探究Res作用于ERS原代神經(jīng)元細胞模型后對細胞凋亡的影響，用Western blot法檢測了Caspase 3蛋白的表達情況。如圖9所示，用TM處理后，相較于對照組，細胞中Caspase 3相對表達量高度顯著上調(diào)（P＜0.001）。相較于TM組細胞，R10T組細胞中Caspase 3的表達顯著下調(diào)（P＜0.05）。

圖9 Res對ERS原代神經(jīng)元模型中Capase 3表達水平的影響Fig. 9 Effect of Res on caspase 3 expression in ERS primary neurons

2.5.2 Res對ERS原代神經(jīng)元細胞模型中GRP78、GSK3β和p-GSK3β表達水平的影響

用Western blot法同時檢測了GRP78、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）、磷酸化糖原合成酶激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase 3β，p-GSK3β）蛋白的表達情況。如圖10所示，與TM組相比，R10T組GRP78相對表達量顯著下降（P＜0.05），GSK3β相對表達量下降（P＞0.05），p-GSK3β相對表達量高度顯著升高（P＜0.001）。4-PBA是一種化學(xué)分子伴侶，可促進蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的運輸和折疊，可作為緩解ERS的抑制劑[11]。SB216763是有效的GSK-3β抑制劑，可抑制GSK3β活性[12]。加入4-PBA后，4P TM組和TM組相比GRP78、p-GSK3β相對表達量均極顯著下降（P＜0.01），GSK3β相對表達量顯著下降（P＜0.05）。加入SB216763后，不論是預(yù)先加SB216763還是后加SB216763的TM組，與單獨TM組相比，p-GSK3β相對表達量極顯著或高度顯著性下降（P＜0.01、P＜0.001），GRP78相對表達量無顯著性差異（P＞0.05），即GSK3β不影響GRP78表達。

圖10 Res對ERS原代神經(jīng)元細胞模型中GRP78、GSK3β和p-GSK3β表達水平的影響Fig. 10 Effect of Res on GRP78, GSK3β and p-GSK3β expression in ERS primary neurons

2.6 Res對ERS原代神經(jīng)元細胞模型中自噬和凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.6.1 Res對TM處理引起B(yǎng)eclin1蛋白表達量的影響

Res能緩解由TM引起的原代神經(jīng)元細胞ERS，此階段會引起自噬的變化。用Western blot同時檢測了Beclin-1、LC3B蛋白的表達情況。如圖11所示，與對照組相比，TM組Beclin-1相對表達量極顯著上調(diào)（P＜0.01），LC3B相對表達量無顯著變化（P＞0.05）。與TM組相比，R10T組Beclin-1、LC3B相對表達量顯著上調(diào)（P＜0.05）。

圖11 Res對ERS原代神經(jīng)元細胞模型自噬的影響Fig. 11 Effect of Res on autophagy in ERS primary neurons

2.6.2 Res對ERS細胞模型的保護作用與自噬之間的關(guān)系

如圖12所示，為了闡明Res作用于ERS細胞模型后的保護作用與自噬之間的關(guān)系，4-PBA抑制ERS，與TM組相比，加入4-PBA的各分組LC3B相對表達量高度顯著下降（P＜0.001），加入4-PBA的TM組Bcl2相對表達量極顯著下降（P＜0.01），加入4-PBA的R0T組和R10T組Bcl2相對表達量均高度顯著下降（P＜0.001)，說明在初期階段ERS被抑制，導(dǎo)致自噬下調(diào)，會造成神經(jīng)元的死亡。加入SB216763處理組中，后加入SB216763的R10T組Bcl2相對表達量與TM組相比顯著上調(diào)（P＜0.05），預(yù)先加入SB216763的R10T組與TM組相比極顯著下調(diào)（P＜0.01）。Bcl2是一種抗凋亡蛋白，根據(jù)其在不同的細胞所利用的模型系統(tǒng)不同，Bcl2對細胞自噬與凋亡的調(diào)控也不同。當Bcl2位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時，Bcl2與Beclin-1結(jié)合在一起，此時抑制Beclin-1促進自噬的功能。當Bcl2被磷酸化后，與Beclin-1分離，釋放Beclin-1，促進自噬。研究表明[13]，一般情況下Beclin-1與Bcl2結(jié)合，使Beclin-1免于切割，Bcl2表達量較少時，不會抑制Beclin-1促進自噬的功能，從而增強自噬，促進細胞存活[13]。但當二者分離時，Beclin-1會被切割，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位到線粒體，失去誘導(dǎo)自噬的功能，此時Bcl2相對表達量上調(diào)，發(fā)揮其抗凋亡特性。因此Beclin-1可能在增強自噬方面起主導(dǎo)作用，而Bcl2起維持自噬的作用。Beclin-1可能不僅是調(diào)節(jié)自噬的重要蛋白，而且也是調(diào)節(jié)自噬和凋亡兩條途徑之間轉(zhuǎn)換的蛋白。

圖12 Res對ERS原代神經(jīng)元細胞模型中Beclin-1、LC3B和Bcl2表達水平的影響Fig. 12 Effect of Res on Beclin-1, LC3B and Bcl2 in ERS primary neurons

2.6.3 Res對ERS原代神經(jīng)元模型中Beclin1-C和Caspase 3表達水平的影響

C-末端片段易位至線粒體并使細胞對凋亡信號敏感，而N-末端Beclin-1片段不能誘導(dǎo)自噬。為進一步探究自噬與凋亡之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系，用Western blot檢測了Beclin1-C、Caspase 3蛋白的表達情況。如圖13所示，與TM組相比，R10T組Beclin1-C、Caspase 3相對表達量均顯著或極顯著下調(diào)（P＜0.05、P＜0.01）。與TM組相比，加入4-PBA的TM組Caspase 3相對表達量極顯著升高（P＜0.01）。

圖13 Res對ERS原代神經(jīng)元模型中Beclin1-C和Caspase 3表達水平的影響Fig. 13 Effect of Res on Beclin 1-C and caspase 3 expression in ERS primary neurons

2.6.4 Res對ERS原代神經(jīng)元細胞周期的影響

成熟神經(jīng)元是終末分化的細胞，不具備增殖能力。在細胞周期中始終處于G1期。在某些病理情況下，成熟神經(jīng)元的細胞周期可以被激活，重新進入細胞周期。本實驗所提取的神經(jīng)元源自胎鼠，胎鼠腦內(nèi)存在大量未分化的神經(jīng)干細胞。因此，在體外培養(yǎng)神經(jīng)元成熟之前，存在細胞周期的變化。

如圖14所示，與對照組相比，Res單獨作用于原代神經(jīng)元時，G1/G0期細胞百分比下降，而S期細胞百分比上升，同時4N期細胞百分比極顯著上升（P＜0.01）。與TM組相比，Res單獨作用于原代神經(jīng)元時，S期細胞百分比極顯著上升（P＜0.01），R10T組S期細胞的百分比增加，且出現(xiàn)了4N期細胞?？梢猿醪脚袛啵琑es能使神經(jīng)元細胞周期重激活，促使神經(jīng)元細胞周期由G1/G0期向S期轉(zhuǎn)移。

圖14 Res對TM誘導(dǎo)后的原代神經(jīng)元細胞周期的影響Fig. 14 Effect of Res on cell cycle of primary neurons damaged by TM

3 討 論

AD是老年癡呆的最常見類型之一[14]。絕大多數(shù)AD發(fā)病年齡較晚，尚無明確的特異性指標對其進行檢測，容易錯過最佳治療時期。AD的標志性病理特征主要分為兩大類：一是老年斑；二是神經(jīng)原纖維纏結(jié)。這些變化最終伴隨著神經(jīng)元的逐漸損傷和死亡[15-16]。NSC是多能干細胞，可以分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞[17]。近年來，研究人員對利用干細胞技術(shù)在藥物研發(fā)、疾病建模和細胞治療方面的研究越來越感興趣，這些技術(shù)已被用于研究包括AD在內(nèi)的一系列人類疾病[18]。

在AD患者腦中，尚未發(fā)生病變的正常神經(jīng)元能檢測出ERS標志性蛋白增多的現(xiàn)象，即ERS發(fā)生于病理特征出現(xiàn)之前，是一種早期的應(yīng)激性反應(yīng)[19]。若ERS持續(xù)進行會導(dǎo)致神經(jīng)細胞內(nèi)過氧化物增多，凋亡信號通路被激活等一系列反應(yīng)，造成神經(jīng)細胞的損傷甚至死亡。因此，AD早期ERS的干預(yù)是預(yù)防此類疾病的一個新的切入點。

越來越多的研究表明，ERS一定程度上可以激活自噬，并調(diào)控自噬對細胞的作用效果，也可以作為應(yīng)答ERS從而緩解細胞損傷的一種機制[20]。神經(jīng)元中出現(xiàn)ERS時，異常折疊蛋白大量滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），當UPR信號不能緩解ERS狀態(tài)時則會啟動細胞凋亡程序[21]。GSK3β參與ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡，是多種信號通路的調(diào)節(jié)者[22]。但是關(guān)于GSK3β與ERS之間的上下游關(guān)系目前尚不清楚，有學(xué)者認為GSK3β可以調(diào)控ERS[23]，而有學(xué)者認為ERS可以影響GSK3β[24]。本研究通過構(gòu)建ERS神經(jīng)元細胞模型，分別加入4-PBA、SB216763兩種抑制劑，以探討ERS與GSK3β之間的關(guān)系。通過Western blot分析發(fā)現(xiàn)，TM作用于原代神經(jīng)元，可以激活ERS信號通路，上調(diào)相關(guān)蛋白GRP78、Caspase 3表達，使神經(jīng)元死亡。而Res能顯著降低神經(jīng)元的ERS，抑制神經(jīng)元死亡。加入4-PBA后，GRP78、P-GSK3β表達量下降，加入SB216763后，P-GSK3β表達量下降，GRP78無顯著變化，這說明GSK3β可能是ERS的下游信號分子，即TM引起ERS后，會抑制下游GSK3β的磷酸化，進而造成神經(jīng)元死亡。加入Res后，其可以通過促進GSK3β的磷酸化減少神經(jīng)元死亡。神經(jīng)元細胞發(fā)生ERS時會引起細胞自噬，當ERS被抑制時，自噬也會被抑制，Res作用于神經(jīng)元細胞時，可通過上調(diào)Beclin-1、LC3B蛋白的表達，保護Beclin-1不被Caspase切割，進一步增強或維持自噬水平。當Beclin-1發(fā)生切割時，意味著自噬功能逐漸減弱，此時Beclin1-C發(fā)揮促凋亡功能，這也意味著細胞由保護性自噬轉(zhuǎn)向凋亡。

酚類主要分為黃酮類和非黃酮類。黃酮類多酚原花青素能通過降低磷酸化tau蛋白水平、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活性及激活蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）/真核細胞起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）和肌醇依賴性激酶1α（inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α）/凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）/C-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK）通路來抑制腦中產(chǎn)生的ERS和炎癥反應(yīng)[25]。其他黃酮類多酚有相似特點，并且能提高神經(jīng)元分化標志物（GAP-43、神經(jīng)纖維絲、突觸素等）的表達水平，如葛根、姜黃素、槲皮素、黃酮醇和阿魏酸等[26]。對于非黃酮類多酚，研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸能夠通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路中關(guān)鍵蛋白ERK1/2的磷酸化來發(fā)揮NSC增殖作用，誘導(dǎo)其分化[27]。Res是一類非黃酮類多酚，具有抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護等特性，可降低AD患者海馬Aβ肽的毒性和聚集[28]，促進神經(jīng)生長，防止海馬神經(jīng)元細胞損傷[29]。其抗氧化活性通過激活SIRT1在神經(jīng)元分化中發(fā)揮重要作用[30]，并通過去乙酰化和抑制p53活性來防止神經(jīng)元凋亡[31]，下調(diào)C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）和凋亡蛋白Caspase 3的表達抑制CHOP信號通路，通過調(diào)控Beclin-1、LC3B表達量進一步增強自噬或維持自噬。然而，目前確切的機制仍不清楚?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein，MMP-9）是一種與AD相關(guān)的炎癥標志物。Moussa等[32]研究報道，與安慰劑組相比，Res（1 g/d）治療52 周的患者MMP-9表達水平降低。此外，使用Res治療的AD患者腦脊液幾乎沒有減少，較少的患者腦中Aβ積累也較低[33]。Res可能增強了CNS，阻礙了MMP-9滲透，降低了炎性因子活性[34]。動物實驗證明，Res能通過線粒體通路對D-半乳糖致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用[35]，也能通過SIRT1-UCP2通路對氧糖剝奪模型大鼠NSC損傷具有保護作用[36]。綜上，Res對原代神經(jīng)元有保護作用，具有抗AD的潛力。

4 結(jié) 論

本實驗意在探究Res在神經(jīng)細胞內(nèi)對ERS的調(diào)控及對自噬、凋亡、周期的之間的交互關(guān)系。將原代神經(jīng)元細胞用TM進行處理，以誘導(dǎo)細胞內(nèi)ERS的產(chǎn)生，從而建立ERS細胞模型。結(jié)果表明，Res濃度為5 μmol/L時，能減弱TM引起的神經(jīng)元細胞的ERS作用，提高神經(jīng)元細胞存活率，延緩神經(jīng)元細胞凋亡。對原代神經(jīng)元細胞分組進行細胞周期檢測與分析，發(fā)現(xiàn)TM可以明顯阻滯G1/G0期細胞向S期轉(zhuǎn)變，而Res處理可以減輕TM誘導(dǎo)的G1期細胞阻滯。Western blot結(jié)果表明，TM可以誘導(dǎo)細胞自噬蛋白Beclin1-C、LC3B、Bcl2的表達，而Res均能起到逆轉(zhuǎn)作用。

綜上，利用TM在原代神經(jīng)元中誘導(dǎo)ERS，引起細胞自噬，而Res可通過調(diào)控Beclin-1、LC3B相對表達量進一步增強自噬或維持自噬，其可通過下調(diào)CHOP蛋白表達抑制CHOP信號通路，下調(diào)凋亡蛋白Caspase 3表達。Res抑制CHOP后，會進一步促進其下游細胞周期蛋白D1的表達，推動細胞周期由G1/G0期進入到S期，從而使細胞周期重激活，提高神經(jīng)元細胞存活率，以延長神經(jīng)元的存活時間。本實驗結(jié)果可為研究Res作用于ERS模型后自噬、凋亡和周期之間所發(fā)生的變化提供一定的理論參考。然而，ERS、凋亡、自噬和周期涉及了細胞多種不同途徑，各自的信號通路之間也存在錯綜復(fù)雜的關(guān)系，且兩者或者多者之間的具體調(diào)控機制需進一步深入探索。