邵建波 侯曉英 申向輝 李佳 劉欣 申志華 毛亞娟 劉艷超

隨著各影像學檢查方法的廣泛應用，甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率不斷升高，其中部分結(jié)節(jié)存在惡性風險，且所占比例持續(xù)上升［1-2］，因此準確評估甲狀腺結(jié)節(jié)的性質(zhì)具有重要的臨床應用價值。超聲檢查具有良好的空間和時間分辨率，2020年中華醫(yī)學會超聲醫(yī)學分會發(fā)布的中國超聲甲狀腺影像報告與數(shù)據(jù)系統(tǒng)（Chinese thyroid imaging reporting and data system，C-TIRADS）［3］能夠提高常規(guī)超聲對甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的鑒別診斷效能。但C-TIRADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)惡性風險跨度大，其常規(guī)超聲表現(xiàn)存有一定重疊。超聲造影（contrastenhanced ultrasound，CEUS）在鑒別甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)方面表現(xiàn)良好，是常規(guī)超聲的有效補充手段［4］。此外，BRAF是甲狀腺惡性結(jié)節(jié)常見的突變基因，有助于甲狀腺乳頭狀癌的診斷［5］。本研究通過分析C-TIRADS 4類甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)CEUS特征與BRAF基因突變的相關(guān)性，并探討CEUS聯(lián)合BRAF基因突變對其鑒別診斷價值，以期為甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的早期診斷、治療方案的選擇及預后評估提供參考。

資料與方法

一、研究對象

選取2020年1月至2022年1月我院經(jīng)手術(shù)病理證實的126例甲狀腺結(jié)節(jié)患者（共126個結(jié)節(jié)），其中C-TIRADS 4A類52例（52個），其中男28例，女24例，年齡36～69歲，平均（47.28±8.74）歲，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）21.19～24.96 kg/m2，平 均（22.87±1.63）kg/m2，結(jié)節(jié)最大徑1.32～2.57 cm，平均（1.86±0.51）cm，其中21個甲狀腺腺瘤，31個結(jié)節(jié)性甲狀腺腫；C-TIRADS 4B類36例（36個），其中男20例，女16例，年齡35～70歲，平均（47.38±8.92）歲，BMI 21.13～24.79 kg/m2，平均（22.56±1.41）kg/m2，結(jié)節(jié)最大徑1.26～2.67 cm，平均（1.89±0.62）cm，均為甲狀腺乳頭狀癌；C-TIRADS 4C類38例（38個），其中男22例，女16例，年齡37～66歲，平均（47.55±8.32）歲，BMI 21.34～24.87 kg/m2，平均（22.91±1.56）kg/m2，結(jié)節(jié)最大徑1.35～2.61 cm，平均（1.81±0.45）cm，均為甲狀腺乳頭狀癌。各分類甲狀腺結(jié)節(jié)患者性別、年齡、BMI及結(jié)節(jié)最大徑比較差異均無統(tǒng)計學意義。納入標準：①所有甲狀腺結(jié)節(jié)均參照C-TIRADS指南［3］分類；②所有患者術(shù)前均行CEUS檢查，且均為首次發(fā)現(xiàn)的單發(fā)病灶，最大徑≥1.00 cm；③所有甲狀腺結(jié)節(jié)均經(jīng)病理證實且行BRAF基因突變檢測。排除標準：①既往有甲狀腺相關(guān)疾病及其治療史；②存在嚴重心臟及肝腎功能障礙者；③合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤病史者；④妊娠期或哺乳期患者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準（批準號：LSXM2022-042），所有患者檢查前均簽署知情同意書。

二、儀器與方法

1.CEUS檢查：使用西門子S 2000彩色多普勒超聲診斷儀，線陣探頭，頻率3～9 MHz或4～10 MHz；低機械指數(shù)（0.05～0.07）?；颊哂跈z查前已由肘靜脈建立靜脈通路，檢查過程中采取仰臥位，頸部完全暴露，平靜呼吸并盡量避免吞咽動作。造影劑使用SonoVue（意大利Bracco公司），使用前將25 mg造影劑溶于5 ml生理鹽水振蕩混勻。在對比模式下，經(jīng)肘靜脈快速注入1.8～2.0 ml造影劑混懸液，同時CEUS系統(tǒng)開始計時，每次對比度成像采集至少持續(xù)2 min。分析甲狀腺結(jié)節(jié)的CEUS特征［6］：①增強強度（分為低增強、等增強、高增強）；②增強均勻性（分為均勻性和不均勻性）；③增強模式（分為環(huán)形、向心性、離心性、彌漫性）。以上操作均由同一具有5年以上甲狀腺疾病診斷經(jīng)驗的超聲醫(yī)師完成。

2.C-TIRADS 4類診斷標準［3］：惡性超聲特征包括縱橫比＞1、實性、極低回聲、點狀強回聲（可疑微鈣化）、邊緣模糊/不規(guī)則或甲狀腺外侵犯；良性超聲特征為點狀強回聲（具有彗星尾征）。計數(shù)上述惡性超聲特征的數(shù)量，每一項惡性特征計1分，如存在彗星尾征則減1分。其中，1分：C-TIRADS 4A類，低度可疑惡性（惡性率2%～10%）；2分：C-TIRADS 4B類，中度可疑惡性（惡性率10%～50%）；3～4分：C-TIRADS 4C類，高度可疑惡性（惡性率50%～90%）。

3.BRAF基因突變檢測：所有患者均由病理科醫(yī)師選擇最佳石蠟內(nèi)固定塊進行基因檢測，確保腫瘤組織部分＞20%。使用上海賽默飛世爾科技有限公司的核酸提取試劑（4465804）提取DNA。BRAF基因突變檢測使用上海賽默飛世爾科技有限公司的Applied Biosystems TaqMan突變檢測試劑盒（castPCR技術(shù)），嚴格按照儀器與試劑盒說明書完成檢測。

4.聯(lián)合診斷［5］：C-TIRADS 4B、4C類或BRAF基因突變陽性即診斷為甲狀腺惡性結(jié)節(jié)。

三、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以頻數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)CEUS特征與BRAF基因突變的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析CEUS特征、BRAF基因突變單獨及聯(lián)合診斷C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、C-TIRADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)CEUS特征比較

C-TIRADS 4B、4C類甲狀腺結(jié)節(jié)低增強（66.67%、73.68%）、不均勻增強（94.44%、89.47%）、向心性增強（97.22%、89.47%）占比均高于C-TIRADS 4A類，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表1和圖1～3。

圖1 C-TIRADS 4A類患者（女，67歲）常規(guī)超聲、CEUS及病理圖

表1 C-TIRADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)CEUS特征比較 個

二、C-TIRADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)BRAF基因突變結(jié)果比較

126個甲狀腺結(jié)節(jié)中，58個甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)生BRAF基因突變，發(fā)生率為46.03%，其術(shù)后病理結(jié)果均為甲狀腺乳頭狀癌。C-TIRADS 4B、4C類甲狀腺結(jié)節(jié)BRAF基因突變陽性占比高于C-TIRADS 4A類，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 C-TIRADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)BRAF基因突變結(jié)果比較 個

圖2 C-TIRADS 4B類患者（女，67歲）常規(guī)超聲、CEUS及病理圖

圖3 C-TIRADS 4C類患者（女，41歲）常規(guī)超聲、CEUS及病理圖

三、C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)CEUS特征與BRAF基因突變的相關(guān)性分析

由于C-TIRADS 4B、4C類甲狀腺結(jié)節(jié)均為惡性，行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)CEUS特征（低增強、不均勻增強、向心性增強）與BRAF基因突變陽性均呈顯著正相關(guān)（r=0.793、0.872、0.895，均P＜0.05）。

四、CEUS特征、BRAF基因突變單獨及聯(lián)合診斷C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的效能

ROC曲線分析顯示，CEUS特征聯(lián)合BRAF基因突變診斷C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的曲線下面積（0.973）、敏感性（100%）、特異性（94.60%）均較其單獨診斷效能高。見表3和圖4。

圖4 CEUS特征、BRAF基因突變單獨及聯(lián)合診斷C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的ROC曲線圖

表3 CEUS特征、BRAF基因突變單獨及聯(lián)合診斷C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的效能

討 論

超聲是診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的首選影像學方法，臨床上對于C-TIRADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)大多會進一步選擇超聲引導下細針穿刺細胞學檢查，但是由于穿刺獲得組織樣本較少、細胞染色不佳、細胞重疊、其他細胞及雜質(zhì)成分過多等原因均可能導致診斷結(jié)果假陰性或良惡性不明確等，且其為有創(chuàng)檢查，易導致并發(fā)癥。因此，尋找一種準確、安全的檢查方法具有重要臨床應用價值。CEUS在鑒別診斷甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)及分析淋巴結(jié)受累方面具有重要價值［7］。而BRAF是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，BRAF突變可通過BRAF磷酸化及活化MEK蛋白（MEK1及MEK2），從而引起MAPK通路下游的活化，調(diào)節(jié)細胞的增殖及存活，因此BRAF突變可被視為導致癌細胞生長的驅(qū)動因素［5，8］。本研究旨在探討CEUS聯(lián)合BRAF基因突變對C-TIRADS 4類甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的鑒別診斷價值。

本研究中C-TIRADS 4A類甲狀腺結(jié)節(jié)病理結(jié)果為甲狀腺腺瘤（21個）和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（31個）；C-TIRADS 4B、4C類甲狀腺結(jié)節(jié)病理結(jié)果均為甲狀腺乳頭狀癌。而CEUS結(jié)果顯示，C-TIRADS 4B、4C類甲狀腺結(jié)節(jié)大部分表現(xiàn)為低增強（66.67%、73.68%）。既往研究［9］表明甲狀腺惡性結(jié)節(jié)是一種乏血供的惡性腫瘤，其組織內(nèi)部的血管密度顯著低于病灶周圍正常的甲狀腺組織，因此CEUS主要表現(xiàn)為低增強。然而與之不同的是，C-TIRADS 4B、4C類甲狀腺結(jié)節(jié)中仍有少部分表現(xiàn)為高增強，分析其原因可能與結(jié)節(jié)大小有關(guān)，研究［10］表明，甲狀腺結(jié)節(jié)最大徑過小，其組織內(nèi)部無或較少血管形成，而直徑較大者在多種血管生長因子的作用下，出現(xiàn)大量新生血管以滿足腫瘤組織的迅速增長，從而表現(xiàn)為高增強。多數(shù)C-TIRADS 4A類甲狀腺結(jié)節(jié)表現(xiàn)為均勻性增強（67.31%），而多數(shù)分C-TIRADS 4B、4C類表現(xiàn)為不均勻增強（94.44%、89.47%），分析其主要原因可能為甲狀腺良性結(jié)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)中血管分布均勻且走行規(guī)則，而甲狀腺惡性結(jié)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)中血管分布不均勻且走行彎曲；另外，當甲狀腺惡性結(jié)節(jié)出現(xiàn)浸潤性生長及新生血管功能不全時，病變組織會發(fā)生玻璃樣變性及間質(zhì)纖維化，從而導致部分區(qū)域缺血［11］。少數(shù)C-TIRADS 4A類甲狀腺結(jié)節(jié)表現(xiàn)為不均勻增強（32.69%），可能與本研究中C-TIRADS 4A類甲狀腺結(jié)節(jié)的病理類型有關(guān)，部分結(jié)節(jié)性甲狀腺腫在疾病發(fā)展過程中發(fā)生組織出血或細胞缺氧等［12］，從而表現(xiàn)為不均勻增強，這類甲狀腺結(jié)節(jié)與惡性結(jié)節(jié)鑒別較困難。此外，本研究根據(jù)造影劑的填充方式，將增強模式分為環(huán)形、向心性、離心性、彌漫性增強，結(jié)果顯示大部分C-TIRADS 4B、4C類甲狀腺結(jié)節(jié)表現(xiàn)為向心性增強（97.22%、89.47%），分析原因可能為甲狀腺惡性結(jié)節(jié)周圍區(qū)域的新生血管數(shù)量較中央?yún)^(qū)域多［13］，從而造成造影劑向中心填充增強的表現(xiàn)。

BRAF基因突變參與早期甲狀腺癌的發(fā)生，其中最常見的BRAF基因突變是V600E［14］。本研究126個甲狀腺結(jié)節(jié)中58個發(fā)生BRAF基因突變，發(fā)生率為46.03%，其術(shù)后病理結(jié)果均為甲狀腺乳頭狀癌。研究［15］報道，甲狀腺乳頭狀癌中BRAF V600E突變的存在與腫瘤侵襲性行為有關(guān)，且腫瘤侵襲性與腫瘤大小無關(guān)，提示即使是直徑較小的BRAF基因突變陽性腫瘤也較BRAF基因突變陰性腫瘤具有更高的侵襲性風險。

本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)CEUS特征（低增強、不均勻增強、向心性增強）與BRAF基因突變陽性呈顯著正相關(guān)（均P＜0.05）。說明C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的CEUS特征可在一定程度上有效地反映其細胞惡性增殖的生物學行為。

本研究ROC曲線分析還發(fā)現(xiàn)，CEUS特征聯(lián)合BRAF基因突變診斷C-TIRADS 4類甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的曲線下面積（0.973）、敏感性（100%）、特異性（94.60%）均較其單獨診斷效能高，說明CEUS聯(lián)合BRAF基因突變有助于提高對C-TIRADS 4類甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的鑒別診斷價值。

綜上所述，CEUS與BRAF基因突變聯(lián)合診斷有助于提高對C-TIRADS 4類甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的鑒別診斷價值。但本研究樣本量較小，且惡性結(jié)節(jié)占比較高，可能導致統(tǒng)計的偏倚，待今后擴大樣本量進行深入研究。