李紅俊 王靜 范欽 劉蜻蜻 陳海燕 洪文娟 余卓銳 成家茂

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展的中間環(huán)節(jié)，隨著肝纖維化程度加重，可引起全身血流動力學的變化，嚴重時可引起肝腎綜合征，致死率較高，因此早期發(fā)現(xiàn)肝纖維化對腎臟血流動力學的改變，以及臨床監(jiān)測腎損傷的程度、預防肝腎綜合征的發(fā)生有著重要參考價值［1］。腎損傷在肌酐（Cr）升高之前僅表現(xiàn)腎血流量和腎小球濾過率降低，研究［2］表明，腎皮質血流減少是發(fā)生腎損傷的關鍵因素。常規(guī)影像學技術CT、MRI及PET診斷早期腎損傷并不敏感，且所得參數(shù)差異也較大。超聲造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）可提高超聲對低速血流的探測效果，實時、定量評估腎組織內血流灌注信息［3］。鐵皮石斛作為我國傳統(tǒng)中藥材，能夠改善肝纖維化［4］，本課題組前期研究［5］發(fā)現(xiàn)高劑量鐵皮石斛（7.5 g/kg）較低劑量（1.5 g/kg）能夠顯著降低肝組織中轉化生長因子-β1的表達，抑制活化人肝星狀細胞系-LX2的增殖，促進其凋亡進而改善肝纖維化，使全身及腎臟血供得以改善，具有腎保護作用。然而，鐵皮石斛對肝纖維化后腎損傷時微循環(huán)灌注的影響鮮有報道。本實驗應用CEUS定量評估高劑量鐵皮石斛對肝纖維化后大鼠腎損傷時微循環(huán)灌注的影響，旨在為其改善腎損傷作用提供可靠的動物實驗依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物

選取同批次健康SPF級SD雄性大鼠24只，6～8周齡，體質量240～265 g，平均（250±20）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（川）2021-030。所有大鼠均在大理大學動物實驗室飼養(yǎng)，普通飲食、飲水，定期消毒。本實驗經(jīng)我院動物倫理委員會審核批準（批準號：20210115J0382）。

二、實驗方法

1.動物模型建立及分組：將24只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、鐵皮石斛干預組，每組各8只；其中模型組、鐵皮石斛干預組大鼠分別于皮下注射肝臟毒性藥物四氯化碳橄欖油溶液5 ml/kg，每周2次，連續(xù)注射5周，建立肝纖維化大鼠模型。參照本課題組前期研究［5］方法，采用高劑量鐵皮石斛鮮榨汁（7.5 g/kg，鐵皮石斛鮮株由云南立卡生物科技有限公司提供）對鐵皮石斛干預組予以每天早上9時開始灌胃1次，正常組及模型組則同步予以等量生理鹽水灌胃；均連續(xù)灌胃4周。每日灌胃后及處死前分別觀察各組大鼠飲食、飲水、精神狀態(tài)、毛發(fā)、大小便、活動情況，以及體質量變化等。

2.CEUS檢查：檢查前用10%水合氯醛溶液（0.35 ml/100 g）行腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥固定于平板上，75%酒精全身消毒，剃除腹部毛發(fā)。使用東芝Aplio 500彩色多普勒超聲診斷儀，L5-14線陣探頭，頻率5.0～7.5 MHz；機械指數(shù)0.08，聚焦范圍置于中間位置。探頭置于大鼠腎臟（本研究選取右腎為觀察對象）最大冠狀截面，CDFI定位于腎動脈主干，常規(guī)超聲觀察腎臟長徑、前后徑、腎皮質厚度及血流情況；然后切換至CEUS模式，經(jīng)尾靜脈團注SonoVue（意大利Bracco公司），劑量0.1 ml/kg，隨即注射0.2 ml生理鹽水沖管，同時以57幀/s速度采集從造影劑注入至注射后3 min的動態(tài)圖像，實時觀察從腎門腎動脈主干到腎皮質的造影劑增強過程。存儲動態(tài)圖像，應用儀器自帶分析軟件進行脫機分析。盡可能取同一深度和位置、直徑為0.4 mm的圓形取樣框貼近腎包膜下最外層皮質為感興趣區(qū)，繪制腎皮質血流灌注時間-強度曲線，定量分析達峰時間（TTP）、峰值強度（PSI）、曲線上升斜率（A）和曲線下面積（AUC）。所有參數(shù)均重復測量3次取平均值。

3.腎功能檢測及病理學檢查：分別于造模第5周末及鐵皮石斛灌胃后第4周末處死大鼠，提前1 d收集24 h尿液。于空腹狀態(tài)下進行充分麻醉，常規(guī)消毒后開腹，暴露心臟及腹主動脈，剪斷腹主動脈并取血5 ml，送昆明塞維爾檢驗公司檢測尿Cr、血Cr和血尿素氮（BUN），并計算內生肌酐清除率（Ccr）代替腎小球濾過率，公式為［6］：Ccr（ml·min-1·kg-1）=尿Cr（mg/dl）×24 h尿量（ml）/血Cr（mg/dl）×2440（min）×體質量（kg）。隨后將灌注針管從腹主動脈刺入，剪破心腔，500 ml生理鹽水緩慢滴灌，直至心臟流出液呈無色。待肝臟、腎臟發(fā)白后，剪取右腎和部分肝葉，置于10%福爾馬林溶液中固定48 h以上，常規(guī)脫水、石蠟包埋，行肝、腎組織切片，厚3 μm。HE及Masson染色后置于光鏡下觀察各組大鼠肝組織病理改變，并評估高劑量鐵皮石斛干預對大鼠腎組織損傷的影響。

三、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、各組大鼠一般情況及平均體質量變化比較

正常組全部大鼠均存活，模型組和鐵皮石斛干預組由于造影劑過量或造影觀察時間過久各死亡1只。正常組大鼠飲食、精神、活動均正常，體質量增長較快；模型組大鼠攝食量及自主行為減少，精神明顯變差，毛發(fā)發(fā)黃、脫落，體質量增長緩慢，后期消瘦明顯；鐵皮石斛干預組較模型組各項癥狀均有所減輕，體質量增加。各組大鼠體質量變化整體呈上升趨勢，見圖1。

圖1 各組大鼠體質量隨時間變化曲線圖

二、各組大鼠腎臟常規(guī)超聲及CEUS檢查結果比較

1.常規(guī)超聲檢查結果：各組大鼠腎臟均呈蠶豆形，腎包膜光滑、清晰；CDFI示見各組大鼠腎動脈管腔內血流信號充盈良好，色彩明亮度肉眼未見明顯差異。各組大鼠腎臟長徑、前后徑和腎皮質厚度比較差異均無統(tǒng)計學意義。見圖2和表1。

表1 各組大鼠腎臟大小比較（±s） mm

表1 各組大鼠腎臟大小比較（±s） mm

組別正常組模型組鐵皮石斛干預組F值P值長徑18.363±0.427 18.050±0.994 18.200±0.475 0.420＞0.05前后徑8.625±0.962 8.575±0.306 8.600±0.227 0.014＞0.05腎皮質厚度2.388±0.181 2.188±0.295 2.275±0.104 1.851＞0.05

圖2 各組大鼠腎臟常規(guī)超聲圖像

2.CEUS檢查結果：經(jīng)大鼠尾靜脈團注SonoVue后，各組均按腎動脈主干、段動脈、葉間動脈、弓形動脈、腎皮質、腎髓質、腎竇的順序依次增強，模型組及鐵皮石斛干預組腎臟造影的增強速度慢于正常組，正常組增強區(qū)域造影劑分布細密、均勻，模型組較正常組稀疏、粗糙，鐵皮石斛干預組次之；待造影劑達峰值后，則按腎竇、腎髓質、腎皮質的順序依次廓清。與正常組比較，模型組和鐵皮石斛干預組大鼠腎皮質TTP延長，PSI和A均降低，AUC增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，鐵皮石斛干預組大鼠腎皮質TTP縮短，PSI和A均增高，AUC減小，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2和圖3。

圖3 各組大鼠腎臟CEUS圖

表2 各組大鼠CEUS腎皮質血流灌注參數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠CEUS腎皮質血流灌注參數(shù)比較（±s）

與正常組比較，★P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。TTP：達峰時間；PSI：峰值強度；A：曲線上升斜率；AUC：曲線下面積

組別正常組模型組鐵皮石斛干預組F值P值AUC（dB·s）1748.663±127.832 2436.937±298.097★2064.837±121.928★△23.725＜0.05 TTP（s）1.363±0.302 2.163±0.239★1.850±0.230★△16.476＜0.05 PSI（dB）89.138±8.042 73.163±5.823★79.788±3.296★△14.126＜0.05 A（dB/s）96.988±8.448 78.688±6.401★88.425±5.963★△13.605＜0.05

三、各組大鼠腎功能指標比較

與正常組比較，模型組和鐵皮石斛干預組大鼠血Cr、BUN水平升高，Ccr水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，鐵皮石斛干預組大鼠血Cr、BUN水平下降，Ccr水平上升，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠腎功能指標比較（±s）

表3 各組大鼠腎功能指標比較（±s）

與正常組比較，★P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。Cr：肌酐；BUN：尿素氮；Ccr：內生肌酐清除率

組別正常組模型組鐵皮石斛干預組F值P值Ccr（ml·min-1·kg-1）4.46±0.37 2.54±0.42★3.79±0.22★△62.02＜0.05血Cr（μmol/L）30.14±4.44 64.68±8.00★56.65±9.40★△9.99＜0.05血BUN（mmoL/L）6.24±1.60 13.82±5.13★10.11±2.38★△45.56＜0.05

四、各組大鼠肝、腎組織病理學變化比較

光鏡下，大鼠肝組織HE及Masson染色結果顯示，正常組肝小葉結構正常，肝索以中央靜脈為中心呈輻射狀緊密排列，匯管區(qū)未見炎性細胞浸潤和纖維化；模型組肝索排列紊亂，肝細胞內可見大量脂肪空泡，匯管區(qū)明顯擴展，并見炎性細胞浸潤、大量纖維間隔和假小葉形成；鐵皮石斛干預組較模型組肝纖維化呈不同程度改善，匯管區(qū)炎性細胞浸潤減輕，纖維間隔和假小葉分布減少。見圖4。腎組織HE染色結果顯示，各組大鼠腎小球、腎小管和間質區(qū)均未見明顯異常病理改變。見圖5。

圖4 各組大鼠肝組織病理圖（A～C為HE染色，×200；D～F為Masson染色，×200）

圖5 各組大鼠腎組織病理圖示腎小球、腎小管和間質區(qū)均未見明顯異常（HE染色，×200）

討 論

肝纖維化是肝細胞發(fā)生損傷時引起的一個可逆性修復反應，肝持續(xù)出現(xiàn)細胞外基質沉積和纖維結締組織增生，并以肝小葉結構紊亂、纖維間隔及假小葉形成為主要病理特征，進而影響肝臟的營養(yǎng)物質代謝。本實驗結果顯示，正常組體質量較模型組和鐵皮石斛干預組增長較快，鐵皮石斛干預組體質量較模型組增長，但較正常組大鼠低。表明肝纖維化導致大鼠營養(yǎng)吸收障礙，繼而出現(xiàn)體質量下降，符合肝纖維化后病理生理改變。當肝纖維化進入晚期（Ⅳ期）即肝硬化階段，全身及腎臟血流動力學會隨之發(fā)生改變，加之炎性細胞浸潤和細菌移位，易并發(fā)腎功能性損傷［2］；此外，肝纖維化后肝細胞和肝星狀細胞可產(chǎn)生大量的局部血管擴張劑，如一氧化氮、一氧化碳、內源性大麻素等，其可作用于局部內臟循環(huán)從而引起動脈血管舒張，進一步加重了腎臟微循環(huán)灌注的下降，極易誘發(fā)肝腎綜合征。肝腎綜合征作為肝纖維化后腎損傷較為嚴重的一種并發(fā)癥，是一組繼發(fā)于有效血容量下降、內源性血管活性物質失衡和腎血流量減少，并以腎功能不全為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，腎臟常無明顯病理改變［7］。目前預測肝纖維化后腎功能損傷和肝腎綜合征仍缺乏有效的評價方法，主要依靠臨床排除。Cr、BUN、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白和胱抑素C是臨床監(jiān)測腎功能最常見的標志物，但早期檢測的敏感性相對較低［8］。正常情況下腎皮質的血供豐富，約占總腎血流量的90%，腎臟的血流灌注情況直接影響腎功能，多數(shù)腎功能損傷或腎衰竭均與腎皮質血流灌注下降有關［9］。常規(guī)超聲是臨床評價腎臟形態(tài)及其血流動力學最簡便的方法，但其僅能在腎損傷的終末期才顯示腎臟形態(tài)學的改變，彩色多普勒超聲也僅能反映腎臟主要大血管主干的血流信息，無法評估腎皮質微循環(huán)灌注狀況。本實驗常規(guī)超聲檢查顯示，各組大鼠腎臟長徑、前后徑及腎皮質厚度比較差異均無統(tǒng)計學意義，表明常規(guī)超聲難以早期評估肝纖維化后腎損傷情況。

CEUS是在常規(guī)超聲基礎上通過觀察造影劑的顯影過程反映血流灌注情況，并繪制造影劑在血管內分布曲線，即時間-強度曲線，可定量評估腎血流動力學狀況，能為腎損傷后微循環(huán)灌注提供重要的功能學信息［10］。本實驗結果顯示，與正常組比較，模型組和鐵皮石斛干預組大鼠腎皮質TTP延長，PSI和A均降低，AUC增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，鐵皮石斛干預組大鼠腎皮質TTP縮短，PSI和A均增高，AUC減小，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與斯妍娜等［11］應用CEUS評價右美托咪定對兔腎缺血/再灌注損傷時微循環(huán)灌注的變化趨勢基本一致，故鐵皮石斛對肝纖維化大鼠腎損傷的作用機制可能與右美托咪定相似，主要通過抑制炎癥反應使腎臟中、小動脈舒張及減輕腎血管內血流瘀滯的雙重作用，從而發(fā)揮改善腎微循環(huán)灌注的效果。Zhao和Han［12］研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛可以降低糖尿病腎病大鼠白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等炎性因子的RNA表達水平，且呈劑量依賴性，抑制炎癥反應，恢復腎臟功能。同時，因鐵皮石斛對肝纖維化的改善作用，使全身循環(huán)不足的情況得以緩解，腎臟的血流灌注增加。本實驗應用CEUS進行評價時，由于腎臟微循環(huán)灌注的改善，使SonoVue微泡進入腎血管床的時間和廓清時間均縮短，從而表現(xiàn)為PSI和A均增高，AUC減少。另外，模型組和鐵皮石斛干預組大鼠肝組織HE及Masson染色均出現(xiàn)肝纖維化病理特征，且腎功能指標血Cr和BUN水平均升高，Ccr水平均下降，與正常組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），提示腎功能受損；但腎組織病理學檢查顯示腎小球、腎小管和腎間質均無明顯異常，表明肝纖維化引起了非器質性慢性腎損傷，鐵皮石斛干預組大鼠腎功能指標較模型組有所改善，證明鐵皮石斛能夠改善大鼠腎微循環(huán)灌注。

綜上所述，應用CEUS可實時、定量評估鐵皮石斛對肝纖維化模型大鼠腎損傷時微循環(huán)灌注的影響；且高劑量鐵皮石斛能改善肝纖維化大鼠腎損傷時的微循環(huán)灌注情況。但本實驗動物樣本較少，所采用的評價方法在有效性、穩(wěn)定性和可靠性等方面尚待進一步研究。