朱前彬，甘志承，李曉翠，張英杰，趙合明，黃先忠

研究報告

小鼠耳芥MAPKKK基因家族全基因組鑒定及進化與表達

朱前彬1,2，甘志承2，李曉翠1，張英杰1，趙合明2，黃先忠2

1. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832003 2. 安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，作物生物技術(shù)研究中心，鳳陽 233100

絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase kinases, MAPKKKs)是MAPK級聯(lián)的重要組成部分，在發(fā)育過程和脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。小鼠耳芥()是生活在新疆荒漠中的十字花科短命植物，具有很好的耐鹽能力。為了探索小鼠耳芥MAPKKK基因家族的進化和功能，本研究通過全基因組分析從小鼠耳芥基因組中鑒定了143個基因，分屬3個亞族：ZIK (20個)、MEKK (36個)和RAF (87個)。共線性分析表明小鼠耳芥與擬南芥和琴葉擬南芥分別存在74和72個共線性基因，說明該家族在小鼠耳芥基因組中發(fā)生了明顯的擴張；進化分析表明存在64對復(fù)制基因?qū)?，a/s均小于1，以純化選擇為主。利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析在鹽脅迫和不同組織中的表達特征，結(jié)果表明在250 mmol/L NaCl脅迫下，大多數(shù)基因上調(diào)表達，其中/和顯著上調(diào)表達；而在8個組織中，主要呈現(xiàn)6種表達模式；部分復(fù)制基因在鹽脅迫和組織中的表達模式存在差異。本研究結(jié)果為進一步解析小鼠耳芥MAPKKK基因家族成員響應(yīng)非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的復(fù)雜機制奠定了基礎(chǔ)。

MAPKKK；小鼠耳芥；短命植物；鹽脅迫；基因表達

由于植物的固著生長，一生要面臨不同的非生物脅迫。在應(yīng)對不同的非生物脅迫時，涉及到多個過程，包括信號感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工、翻譯和翻譯后蛋白修飾等[1]。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)級聯(lián)途徑是廣泛存在于真核生物的一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，每個基本的MAPK通路至少由MAPK激酶激酶(MAPKKK或MEKK)、MAPK激酶(MAPKK、MEK或MKK)和MAPK三種功能上相互連接的蛋白激酶組成[2]。當(dāng)感受到外界刺激時，MAPKKK最先被磷酸化激活，之后磷酸化激活MAPKK，進而激活MAPK。激活的MAPK可以磷酸化多個下游底物，包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、其他酶或結(jié)構(gòu)蛋白等，進而引起一系列細(xì)胞反應(yīng)[3～5]。

MAPKKK位于MAPK級聯(lián)的上游，基因家族成員較多，其主要結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域組成的多樣性更大[6]。對擬南芥()和水稻() MAPKKK結(jié)構(gòu)域的研究表明，MAPKKK基因家族可分Raf、MEKK和ZIK三個亞家族[6,7]。Raf-like和ZIK-like蛋白具有C端激酶結(jié)構(gòu)域和長N端調(diào)控結(jié)構(gòu)域[8]。ZIK亞家族成員具有N端激酶結(jié)構(gòu)域，而MEKK亞家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)保守度較低，其中激酶結(jié)構(gòu)域位于N端或C端，或位于蛋白的中心部分[3,9]。

功能研究表明MAPK級聯(lián)途徑參與植物生長發(fā)育的各個方面。例如擬南芥MEKK1-MKK4/5- MPK3/6參與植物的免疫反應(yīng)[10]；MAPKKK18/17- MAPKK3-MAPK1/2/7可依賴于脫落酸(abscisic acid, ABA)，調(diào)控葉片衰老和響應(yīng)干旱脅迫[11,12]；MAPKKK4-MKK4/5-MPK3/6參于植物的生長發(fā)育[13]。煙草()NPK1 (nucleus and phragmoplast-localized protein kinase 1)屬于MAPKKK家族，NPK1-MEK1-NQK1調(diào)控?zé)煵莸纳L發(fā)育及煙草花葉病毒感染的反應(yīng)[14,15]。陸地棉()可以通過GhMAP3K15- GhMKK4-GhMPK6級聯(lián)激活轉(zhuǎn)錄因子參與陸地棉的干旱響應(yīng)[16]。OsMAP3K10-OsMKK4- OsMAPK6途徑參與調(diào)節(jié)水稻籽粒大小和粒重[17,18]，OsMKKK70-OsMKK4-OsMAPK6調(diào)控水稻籽粒大小及葉夾角[19]。

MAPKKK在眾多物種中已被系統(tǒng)鑒定，擬南芥中有80個MAPKKK[6]，水稻中有75個[7]，小麥()中有155個[20]，玉米()中有74個[21]，陸地棉中有157個[22]。小鼠耳芥()是十字花科鼠耳芥屬荒漠短命植物，具備生活周期短、結(jié)實量大、光合效率高、抗旱耐鹽等特點[23,24]。李曉翠等[25]從小鼠耳芥基因組中鑒定了16個基因，發(fā)現(xiàn)存在多對復(fù)制基因?qū)?。本研究對小鼠耳芥中MAPKKK基因家族的成員進行了全基因組鑒定，分析了基因和蛋白的結(jié)構(gòu)域特征、比較進化、響應(yīng)鹽脅迫及組織表達特征。本研究結(jié)果豐富了植物MAPKKK級聯(lián)信號通路，為后續(xù)進一步解析MAPK級聯(lián)參與小鼠耳芥生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫的機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

短命植物新疆小鼠耳芥為本實驗室保存，小鼠耳芥種子消毒及室內(nèi)培養(yǎng)參照Huang等[23]描述的方法進行。采集小鼠耳芥生長8天的下胚軸和子葉，30天的根、莖尖和莖，60天的莖生葉，65天的花和70天的果莢，用于組織表達分析。小鼠耳芥高鹽脅迫處理采用250 mmol/L NaCl處理28天小鼠耳芥幼苗，在脅迫處理0、12、24和48 h后分別取葉片組織。以上材料均重復(fù)3次取樣，后立即液氮冷凍，–80℃保存。

1.2 數(shù)據(jù)來源

從Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl. org/index.html)下載擬南芥和琴葉擬南芥()的基因組數(shù)據(jù)。小鼠耳芥基因組數(shù)據(jù)為本實驗室提供(數(shù)據(jù)暫未公開)。從TAIR網(wǎng)站(https://www. arabidopsis.org/)下載擬南芥MAPKKK氨基酸序列。從NCBI Sequence Read Archive (SRA; http://www. ncbi.nlm.nih.gov/sra)中獲取小鼠耳芥MAPKKK基因在鹽脅迫不同時間點(0、0.5、3、6、12、12、24和48 h，登錄號為PRJNA417986)[24]和不同組織(下胚軸、子葉、成熟根、莖尖、莖、莖生葉、花和果莢，登錄號為PRJNA721579)的FPKM值。

1.3 MAPKKK基因家族成員的全基因組鑒定及命名

以擬南芥MAPKKK氨基酸序列作為query，與小鼠耳芥蛋白數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP比對，參數(shù)設(shè)置-value≤1e–5，其余參數(shù)為默認(rèn)值。刪去重復(fù)序列后，將候選的MAPKKK氨基酸序列提交到PfamScan (http://pfam.xfam.org)，進一步鑒定特有的MAPKKK保守結(jié)構(gòu)域-蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。使用ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測ApMAPKKK蛋白的分子量和等電點。亞細(xì)胞定位通過ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry. phtml)進行預(yù)測。參照李曉翠等[25]描述的方法命名小鼠耳芥基因。

1.4 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)和蛋白motif分布

通過ClustalW程序[26]將擬南芥和小鼠耳芥MAPKKK蛋白進行多重序列比對，參數(shù)為默認(rèn)值。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining樹[27]。利用小鼠耳芥基因組gff3文件，使用GSDS (http:// gsds.gao-lab.org/)分析ApMAPKKK基因家族的外顯子和內(nèi)含子分布。ApMAPKKK蛋白質(zhì)的保守motif使用MEME網(wǎng)站(http://meme-suite.org/tools/meme)進行分析，motif長度范圍為10～50個氨基酸殘基，motif最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目為10個，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.5 比較進化分析

共線性分析使用MCScanX軟件[28]預(yù)測擬南芥、琴葉擬南芥與小鼠耳芥物種間同源基因，參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。分別將3個物種的基因組兩兩BLASTP比對，-value≤1e–5，提取MAPKKK基因家族中的基因重復(fù)對信息，篩選出3個物種間的直系同源基因。使用TBtools[29]中的Multiple Synteny Plot功能對MAPKKK直系同源基因的共線關(guān)系進行可視化分析。

基因復(fù)制事件通過多重序列比對和共線性分析來揭示。旁系同源基因的確定滿足條件：比對長度大于較長基因的90%；核苷酸一致性大于90%的情況下才被視為復(fù)制基因[21,30]。使用DnaSP 6.0軟件[31]計算a (非同義替換率)和s (同義替換率)，通過旁系同源基因間的a/s來評估進化過程中對復(fù)制基因的選擇壓力。a/s大于1、小于1或等于1分別表示正、負(fù)或中性演化[32]。

1.6 ApMAPKKK表達模式分析

借助R語言中的熱圖程序包將鹽脅迫和不同組織表達數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2(FPKM+1)處理，之后可視化為熱圖，采用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。RNA提取及反轉(zhuǎn)錄參照Huang[23]等方法，qRT-PCR參照牛西強等[33]描述方法進行，PCR儀為ABI ViiA7實時熒光定量PCR儀(Life Technologies，美國)。使用Primer 3.0工具(https://bioinfo.ut.ee/ primer3-0.4.0/)設(shè)計基因的特異性擴增引物(附表1)，以為內(nèi)參基因[25]，利用2–ΔCT法計算基因不同組織的相對表達量[34]；利用2–ΔΔCT法計算基因響應(yīng)不同非生物脅迫下的相對表達量[34]。采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析(<0.05)，GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

1.7 ApMAPKKK啟動子的順式作用元件分析

以每個基因起始密碼子上游2500 bp序列作為該基因的啟動子序列，提交至PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)，預(yù)測啟動子區(qū)的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠耳芥MAPKKK基因家族成員的鑒定、系統(tǒng)進化、基因結(jié)構(gòu)和motif分布

從小鼠耳芥全基因組中一共鑒定到143個基因，它們均具有保守的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(附圖1)。這些候選基因的染色體定位、蛋白理化性質(zhì)等信息見附表2。結(jié)果表明MAPKKK蛋白由223個氨基酸()到1380個氨基酸()組成，蛋白質(zhì)分子量介于25.75～152.11 kDa之間，等電點范圍4.14～9.90。蛋白質(zhì)定位預(yù)測結(jié)果顯示，MAPKKK蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。

對小鼠耳芥MAPKKK基因家族進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠耳芥MAPKKK基因家族分為3個亞家族：MEKK (36)、RAF (87)和ZIK (20) (圖1，附圖2A)。比較3個亞族所含的外顯子和內(nèi)含子個數(shù)發(fā)現(xiàn)(附圖2B)，RAF亞族基因的外顯子個數(shù)在2～17之間，差異較大。MEKK亞族基因結(jié)構(gòu)差異最大，其中14個只含有1個外顯子，15個含8～17個外顯子，4個含有23～24個外顯子，表明該亞家族在進化過程中發(fā)生了大量的外顯子獲取和缺失。ZIK亞族基因結(jié)構(gòu)較為保守，大多數(shù)含有7個外顯子。

通過MEME在線程序?qū)?43個MAPKKK進行保守motif分析，共預(yù)測出10個保守的motif，其分布見附圖2C。RAF亞族基因基本包含10個motif；MEKK亞族基因大多由9個motif (motif 1～9)構(gòu)成；ZIK亞族基因基本由8個motif (motif 1～6、motif 8～9)組成，例外的是，ApZIK1-1只包motif 1和motif 4。盡管每個亞族基因的motif組成不同，但它們共有的motif卻以完全相同的順序排列，其中motif 4為保守激酶結(jié)構(gòu)域。

2.2 小鼠耳芥與擬南芥、琴葉擬南芥MAPKKK基因的共線性分析

共線性關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥中存在74個小鼠耳芥共線基因(圖 2)，、、、、和在小鼠耳芥中沒有相對應(yīng)的共線基因，基因數(shù)量約是的兩倍，二者直系同源基因存在191對共線性關(guān)系。而琴葉擬南芥雖然染色體數(shù)量比擬南芥多，但僅含有72個小鼠耳芥共線基因(圖2)，二者直系同源基因存在185對共線性關(guān)系。以上結(jié)果表明，MAPKKK基因家族成員在小鼠耳芥中發(fā)生了擴張。旁系同源基因?qū)Ψ治霰砻?附表3)，小鼠耳芥MAPKKK基因家族有64個復(fù)制基因?qū)?，其?/互為旁系同源，///互為旁系同源。另外，、、、、和在小鼠耳芥中沒有相對應(yīng)的旁系同源基因，可能在進化過程中發(fā)生了丟失，且復(fù)制基因?qū)Φ腶/s皆小于1 (附表4)，表明進化中以純化選擇為主。

2.3 ApMAPKKK響應(yīng)250 mmol/L NaCl脅迫下的表達特征

通過分析小鼠耳芥經(jīng)250 mmol/L NaCl脅迫7個不同時間點的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到143個基因的差異表達情況。結(jié)果表明，有132個基因存在差異表達(附表5)，其中MEKK、RAF、ZIK亞族分別包含35、80、17個(圖3A)。熱圖結(jié)果顯示，132個響應(yīng)高鹽脅迫主要呈現(xiàn)4種表達特征(C1～C4) (圖3A)。C1組成員大多在鹽脅迫處理后逐漸下調(diào)表達；C2組成員在鹽脅迫初期和末期表達量高，但在中間時期表達量較低；相反，C3組成員在鹽脅迫處理中期表達上調(diào)，但在脅迫的初期和后期表達量低；C4組的成員大多在鹽脅迫的后期逐漸上調(diào)表達。

圖1 擬南芥和小鼠耳芥MAPKKK家族蛋白序列系統(tǒng)進化樹

圖2 擬南芥、琴葉擬南芥和小鼠耳芥中MAPKKK基因共線性關(guān)系

黑色圓柱分別代表擬南芥、小鼠耳芥、琴葉擬南芥的5條、16條、8條染色體，黑色線條表示物種間共線性關(guān)系。

圖3 ApMAPKKK基因在250 mmol/L NaCl脅迫下不同時間點的表達特征

A：在鹽脅迫不同時間點的表達圖譜；B：qRT-PCR分析12個基因(A圖中紅色字體)鹽脅迫的表達特征。不同的小寫字母表示統(tǒng)計顯著性差異(< 0.05)。

利用qRT-PCR分析了12個基因(、、、、、、、、、、和)在0、12、24和48 h鹽脅迫中的表達(圖3B)，結(jié)果與RNA-seq分析結(jié)果相一致，進一步證明小鼠耳芥基因響應(yīng)鹽脅迫表達特征。其中，、和在鹽脅迫12 h表達上調(diào)，但隨后逐漸下調(diào)表達。在鹽脅迫后始終呈下調(diào)表達。和在鹽脅迫12 h呈下調(diào)表達，24 h后又恢復(fù)表達。在鹽脅迫24 h后呈上調(diào)表達。、、和在鹽脅迫后始終呈上調(diào)表達，在鹽脅迫12 h和48 h呈上調(diào)表達而在24 h呈下調(diào)表達。

2.4 ApMAPKKK基因組織表達特征

為了解基因在小鼠耳芥不同組織中的表達特征，本研究利用小鼠耳芥8種組織(胚軸、子葉、根、莖、莖生葉、花、果莢和莖尖)的RNA-seq繪制表達熱圖(圖4A)，結(jié)果表明，在8個組織中有125個差異表達的基因(附表6)，主要表現(xiàn)6種表達特征(C1～C6)。C1組成員在莖尖表達量較高。C2組成員在花中表達量較高。C3組成員在下胚軸、子葉和根中高表達。C4組成員下胚軸、子葉、莖和莖生葉中高表達，C5組成員大多在下胚軸、子葉、根、莖和莖生葉中高表達而在莖尖低表達，C6組成員均在下胚軸高表達。

利用qRT-PCR進一步分析了12個基因在8種組織中的表達情況(圖4B)，結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)并不完全吻合，但整體表達特征和表達熱圖一致。在下胚軸、根和莖尖中表達量較高在其他組織中表達量相似。和2只在花中高表達。和在下胚軸高表達而在花中低表達。、和在下胚軸高表達。在下胚軸、根和果莢中高表達。子葉和根中高表達。和在下胚軸和莖中高表達，而在根、莖生葉和花中基本不表達。

3 討論

本研究從小鼠耳芥基因組中共鑒定出143個基因，大約是擬南芥的1.79倍[6]。系統(tǒng)進化分析表明，小鼠耳芥MAPKKK家族可分為3個亞家族——RAF、MEKK和ZIK。每個亞族均有保守激酶結(jié)構(gòu)域(附圖1)，其中RAF亞族具有GTxx(W/Y)MAPE保守激酶域；MEKK亞族均包含G(T/S)Px(W/Y/F)MAPEV保守基序；ZIK亞族基因的激酶保守域是TPEFMAPE(L/V)Y。ApRAF29-1關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域缺少一個谷氨酸Glu (E)，MEKK9、MEKK11和MEKK18相對擬南芥、小鼠耳芥中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域更加保守。分析小鼠耳芥MAPKKK家族成員的motif分布和外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)(附圖2)，MEKK亞族在進化過程中發(fā)生了大量的外顯子獲取和缺失，這與小麥、玉米和陸地棉相一致[20～22]。RAF和ZIK亞族內(nèi)的大部分基因的基因結(jié)構(gòu)是保守的，但同時也存在一些外顯子數(shù)量差異較大的基因，甚至在復(fù)制基因?qū)χg，也存在此現(xiàn)象，如/及的基因結(jié)構(gòu)存在明顯的差異。研究表明，內(nèi)含子的獲取或缺失是進化過程中選擇壓力的結(jié)果，基因傾向于進化成不同的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)并發(fā)揮不同的功能[35,36]。ApMAPKKK基因家族的各亞族成員都具有相似的motif組成，RAF具有所有的10個motif，MEKK含有9個motif，ZIK僅含有8個motif。研究表明，RAF亞族是MAPKKK基因家族的起源[37]。ZIK亞組又被稱為WNK (with no lysine)，目前尚未被證實可以磷酸化MKK[21]，這可能與其缺少2個motif有關(guān)。ApMAPKKK家族成員在保持主要功能域結(jié)構(gòu)保守的同時(所有基因都包含motif 4-激酶結(jié)構(gòu)域)，還存在許多結(jié)構(gòu)分歧，甚至在復(fù)制基因中也存在結(jié)構(gòu)分歧現(xiàn)象(如和；和；和)，這些結(jié)果表明基因結(jié)構(gòu)的多樣性，暗示著進化中小鼠耳芥基因產(chǎn)生了新的功能。

本研究通過共線性分析，發(fā)現(xiàn)小鼠耳芥MAPKKK基因家族發(fā)生了明顯的擴張(圖2)。有研究發(fā)現(xiàn)須彌芥()為適應(yīng)青藏高原獨特環(huán)境，基因組中抗病相關(guān)的基因家族發(fā)生了明顯收縮，而抗紫外線等抗逆基因家族發(fā)生了擴張[38]。小鼠耳芥主要生長在新疆古爾班通古特沙漠南緣荒漠地帶，是一種和擬南芥近緣的早春短命植物[23,39]，MAPKKK基因家族在響應(yīng)逆境脅迫和生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[6]，而MAPKKK基因家族成員數(shù)目在小鼠耳芥中發(fā)生擴增，這種擴增可能與之適應(yīng)荒漠環(huán)境有關(guān)。

圖4 ApMAPKKK基因在小鼠耳芥不同組織中的表達特征

A：基因在8個不同組織中的表達熱圖；B：qRT-PCR分析12個基因(A圖中紅色字體)在8個組織中的表達。

基因響應(yīng)鹽脅迫主要表現(xiàn)出4種表達特征(圖3)，并且3個亞族的成員在4種表達特征中皆有分布，表明各亞族基因具有多樣的表達模式。尤其MEKK亞族的大部分基因(24個)在鹽脅迫處理后上調(diào)表達，這可能與它們啟動子區(qū)含有大量響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件有關(guān)(附圖3)，暗示MEKK亞族的基因積極響應(yīng)鹽脅迫，可能在小鼠耳芥耐鹽中起著重要作用。在擬南芥中MEKK1可激活MKK2-MPK4/MPK6級聯(lián)來正調(diào)控鹽脅迫[40]，基因在鹽脅迫后也表達上調(diào)。鹽脅迫會導(dǎo)致ABA、ROS及H2O2的積累[41～43]，////表達均受鹽脅迫誘導(dǎo)[44,45]。過表達////表現(xiàn)出對ABA的敏感，而敲除////表現(xiàn)出對ABA的不敏感[44]。本研究發(fā)現(xiàn)，在/、/、//和/啟動子區(qū)域均含有大量的ABA響應(yīng)元件(附圖3)，且它們均響應(yīng)鹽脅迫，暗示了它們可能通過ABA信號途徑從而響應(yīng)鹽脅迫。AtRAF43參與多種非生物脅迫響應(yīng)，突變體對鹽、H2O2和甘露醇等的耐受性明顯降低[46]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠耳芥/基因在鹽脅迫后上調(diào)表達(圖3)，暗示/在提高抗鹽能力方面起著重要作用。過表達基因可增強擬南芥對高鹽的耐受性[47]，但本研究發(fā)現(xiàn)/基因在鹽脅迫處理后下調(diào)表達(圖3)，暗示部分小鼠耳芥中的擬南芥直系同源基因在進化中可能產(chǎn)生了功能分歧。水稻在鹽脅迫和H2O2處理下，可在根部特異性誘導(dǎo)()，SERF1可與OsMEKK6結(jié)合，從而正調(diào)控鹽脅迫[48]，而本研究也發(fā)現(xiàn)小鼠耳芥/在鹽脅迫后上調(diào)表達(圖3)，暗示該基因在鹽脅迫中的重要作用。但有關(guān)基因的具體功能還需今后進一步深入研究。

大部分基因具有廣泛的組織表達特征，并有部分基因表現(xiàn)出組織特異性表達(圖4)，暗示它們在不同組織發(fā)育中的重要作用。例如/只在花中高表達，/只在莖尖高表達(圖4)。AtMKKK18-AtMKK3-AtMPK1/ 2/7是ABA依賴的信號通路，可調(diào)節(jié)葉片衰老[11]和干旱脅迫抗性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)在花中高表達，暗示在調(diào)控花發(fā)育中具有重要作用。基因復(fù)制引起的功能多樣性可能導(dǎo)致基因表達水平和蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變，基因復(fù)制是提高植物對新環(huán)境適應(yīng)性的主要驅(qū)動因素[49]。在小鼠耳芥中一些旁系同源基因表達模式也有很大的差異。如響應(yīng)高鹽脅迫處理后上調(diào)表達，而則下調(diào)表達；在莖尖中高表達，而則低表達。這些結(jié)果表明，盡管復(fù)制基因之間具有高的氨基酸相似性(附表3)，但它們在小鼠耳芥進化過程中可能獲得了新的功能，從而引起功能分化。

已有的研究發(fā)現(xiàn)同一個基因可能參與多種生物學(xué)過程，包括生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)，以及植物的生長發(fā)育等。擬南芥中，MEKK1- MKK1/MKK2-MPK4級聯(lián)響應(yīng)冷脅迫和鹽脅迫[50]，并介導(dǎo)先天的免疫應(yīng)答反應(yīng)[51,52]；大豆中GmMEKK1通過增強GmMPK6的活性、抑制GmMPK3的激活來調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和免疫防御反應(yīng)[53]。說明MAPKKK基因家族成員的功能具有多樣性，同種基因可參與多條MAPK級聯(lián)信號途徑來響應(yīng)不同的外界脅迫。因此，更多植物基因的鑒定和功能研究，更加有利于揭示植物對外界信號的響應(yīng)機制。小鼠耳芥生長在新疆干旱、高溫的鹽堿地環(huán)境下，可能有大量的抗逆基因值得挖掘[25]，而小鼠耳芥MAPK級聯(lián)途徑作為響應(yīng)外界環(huán)境的信號通路，可幫助人們進行抗逆基因的初探索。

本文對MAPK級聯(lián)中的MAPKKK基因家族進行了全基因組鑒定、結(jié)構(gòu)與進化特征及響應(yīng)鹽脅迫與組織表達的特征分析，研究結(jié)果為今后揭示基因的功能奠定了基礎(chǔ)，也為探索植物與環(huán)境相適應(yīng)的分子機制研究提供了線索。今后的研究重點將通過反向遺傳學(xué)深入分析小鼠耳芥基因在鹽脅迫中發(fā)揮的功能及調(diào)控機制。

附加材料見文章電子版www.chinagene.cn。

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Genome-wide identification, phylogenetic and expression of MAPKKK gene family in

Qianbin Zhu1,2, Zhicheng Gan2, Xiaocui Li1, Yingjie Zhang1, Heming Zhao2, Xianzhong Huang2

Mitogen-activated protein kinase kinase kinases (MAPKKKs) are important components of the MAPK cascade and play crucial roles in development and stress responses.is an ephemeral Brassicaceae plant growing in Xinjiang desert regions, which possesses salt tolerance. To explore the evolution and function of the MAPKKK gene family in, 143 ApMAPKKK genes were identified fromgenome by genome-wide analysis, which were categorized into three subfamilies: ZIK (20), MEKK (36) and RAF (87). There existed 74 and 72 colinear genes between,and, respectively, indicating that this gene family expanded obviously ingenome. Evolutionary analysis revealed that there were 64 duplicated gene pairs witha/s less than 1, and purifying selection was dominant. RNA-seq data were used to analyze the expression characteristics ofgenes in response to salt stress and in different tissues. The results showed that mostgenes were up-regulated under 250 mmol/L NaCl stress. For example,/and/were substantially up-regulated. Tissue expression profiles showed thatmainly presented six expression patterns. Some duplicated genes were differentially expressed in response to salt stress and in different tissues. These results lay a foundation for further understanding the complex mechanism of MAPKKK gene family transduction pathway in response to abiotic stresses in.

MAPKKK;;ephemeral plant; salt stress; gene expression

2022-08-03;

2022-09-18;

2022-09-30

國家自然科學(xué)基金項目(編號：32270385, U1303302, 31060149)和安徽科技學(xué)院學(xué)科帶頭人引進人才啟動經(jīng)費項目(編號：NXYJ202001)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 32270385, U1303302, 31060149),the Talent Introduction Start-up Fund Project of Anhui Science and Technology University (No. NXYJ202001)]

朱前彬，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物與醫(yī)藥。E-mail: qianbinzhu@126.com

黃先忠，博士，教授，研究方向：植物響應(yīng)逆境生理生態(tài)適應(yīng)的分子機制。E-mail: huangxz@ahstu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-261

(責(zé)任編委: 孔凡江)