王晨亮 薛國(guó)輝 陳雪禮 劉曉峰 張仕佩 華琳 李觀華▲

1.江西省九江市第一人民醫(yī)院病理科，江西九江 332000；2.江西省九江市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西九江 332000

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率都很高，乳腺癌發(fā)病率在女性超過35歲之后會(huì)大大增加，55～65歲達(dá)到發(fā)病高峰，乳腺癌發(fā)病也日益年輕化[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2018年全球新增乳腺癌病例中就有62.6萬(wàn)人因乳腺癌死亡，對(duì)現(xiàn)代女性的健康帶來(lái)了極大威脅[2-3]。現(xiàn)今乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，了解乳腺癌發(fā)病的機(jī)制，從分子角度了解乳腺癌是具有意義的[4]。三陰性乳腺癌占乳腺癌總數(shù)的15%～20%，是一類較為特殊的乳腺癌類型[5]。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2，孕激素受體和雌激素受體表達(dá)均為陰性時(shí)患者屬于三陰性乳腺癌[6]。三陰性乳腺癌惡性程度較高，侵襲能力很強(qiáng)，易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，疾病后果較為嚴(yán)重，預(yù)后不良，且死亡率較高[7]。LAIR-1是人類絲氨酸/蘇氨酸激酶（aurora/ipllp kinase，AIK）中的一個(gè)蛋白類型，曾被稱為乳腺癌擴(kuò)增激酶（breasttumor amplified kinase，BTAK）。在細(xì)胞有絲分裂過程中，紡錘體形成和胞質(zhì)分裂尤為關(guān)鍵，LAIR-1是紡錘體形成所必須的蛋白。LAIR-1與細(xì)胞有絲分裂具有相關(guān)性，在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)[8]。本研究探討LAIR-1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況及臨床價(jià)值，旨在為三陰性乳腺癌的評(píng)估診斷治療提供一定參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月至2020年12月于九江市第一人民醫(yī)院治療的55例原發(fā)性乳腺癌患者為研究對(duì)象，收集患者的癌組織及癌旁組織（距離癌組織5 cm以上）。其中三陰性乳腺癌25例，非三陰性乳腺癌30例；年齡24～67歲，平均（44.64±13.98）歲；病理TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期31例。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過（倫理批號(hào)：2022-087）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者粗針穿刺確診為乳腺癌，術(shù)前均已進(jìn)行放化療；②患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者伴有其他器官惡性腫瘤；②患者合并有嚴(yán)重的多器官功能障礙；③患者有精神疾病；④臨床資料不全。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)55例乳腺癌組織和乳腺癌旁組織中LAIR-1的表達(dá)水平。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑LAIR-1兔抗人單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），EDTAKA抗原修復(fù)原液pH8.0、抗鼠兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB染色液、PBS磷酸鹽沖洗液、蘇木素-伊紅染液、二甲苯。以上藥物和試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2.3 免疫組化步驟切片：將癌組織蠟塊處理為厚度為2 μm的石蠟切片，放置于60℃烤箱中進(jìn)行烤片處理以固定組織切片。脫蠟水化：用二甲苯浸泡脫蠟，共進(jìn)行三次，每次10 min；后分別用95%、85%、65%的酒精沖洗殘余二甲苯，共進(jìn)行2次，每次10 min。沖洗：現(xiàn)用蒸餾水沖洗3次，每次3 min，再用PBS液沖洗3次，每次3 min。組織抗原修復(fù)：將組織切片放入高壓鍋內(nèi)，加入檸檬酸緩沖液浸沒組織切片，沸騰后緩慢加熱3 min，冷卻處理，再用PBS溶液沖洗3次，每次3 min。滅活內(nèi)源性過氧化物酶：將過氧化氫溶液滴在片上室溫下反應(yīng)15 min，隨后用PBS溶液沖洗3次，每次3 min。加入一抗和二抗：將比例為1∶200的LAIR-1兔抗人單克隆抗體滴入各個(gè)組織切片之中，放入冰箱一整夜；第二天取出切片，將切片用PBS溶液沖洗3次，每次持續(xù)3 min。DAB顯色：將DAB顯色液滴入組織切片，陽(yáng)性呈棕黃色。蘇木素復(fù)染：使用蒸餾水沖洗切片3 min，將切片放置于蘇木素染色液中3 min，然后放于鹽酸分化液浸泡5 s，完畢后沖洗15 min，隨后放入無(wú)水酒精脫水處理兩次，每次1 min。封片：將切片充分晾干后用中性樹脂再次固定，不留氣泡，晾干鏡檢。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

選擇4個(gè)視野，按照染色程度區(qū)分陽(yáng)性和陰性細(xì)胞，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下。①按細(xì)胞核和細(xì)胞漿染色程度計(jì)分：不顯色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。②按照顯色比例計(jì)分：選擇4個(gè)高倍鏡視野，100個(gè)細(xì)胞，顯色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)0%～25%，計(jì)1分；顯色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)25%～50%，計(jì)2分；顯色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)50%～75%，計(jì)3分；顯色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)＞75%，計(jì)4分。③按照兩者乘積得分判定：（-）陰性：0分；（+）弱陽(yáng)性：1～4分；（++）中等陽(yáng)性：5～8分；（+++）強(qiáng)陽(yáng)性：9～12分。考慮統(tǒng)計(jì)方便性，將（-）陰性和（+）弱陽(yáng)性歸為陰性組，將（++）中等陽(yáng)性和（+++）強(qiáng)陽(yáng)性歸為陽(yáng)性阻。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布后行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAIR-1在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

LAIR-1在乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 LAIR-1在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況[n（%）]

2.2 LAIR-1在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

LAIR-1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平為（3.227±1.025），高于在癌旁組織中的表達(dá)（1.184±0.523），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.167，P＜0.001）。

2.3 三陰性及非三陰性乳腺癌LAIR-1表達(dá)水平的比較

55例患者中，三陰性乳腺癌25例，非三陰性乳腺癌30例。LAIR-1在三陰性乳腺癌腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)（0.952±0.287），高于非三陰性乳腺癌的表達(dá)水平（0.613±0.325），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.107，P＜0.001）（圖1）。

圖1 LAIR-1在三陰性及非三陰性乳腺癌組織中的免疫組化（200×）

2.4 不同臨床特征乳腺癌患者的LAIR-1表達(dá)水平比較

不同腫瘤直徑和TNM分期患者的LAIR-1表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。年齡＞35歲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者的LAIR-1表達(dá)水平高于年齡≤35歲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 不同臨床特征乳腺癌患者的LAIR-1表達(dá)水平比較（±s）

表2 不同臨床特征乳腺癌患者的LAIR-1表達(dá)水平比較（±s）

臨床特征例數(shù)LAIR-1表達(dá)t值P值年齡（歲）≤35＞35腫瘤直徑（mm）≤2＞2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性陽(yáng)性TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ8.642＜0.001 7 48 0.526±0.238 1.042±0.131 0.658 0.514 18 37 0.691±0.138 0.722±0.175 4.030＜0.001 38 17 0.132±0.157 0.718±1.067 1.243 0.219 24 31 1.502±0.254 1.437±0.126

3 討論

乳腺癌的形成、發(fā)生和發(fā)展是多種因素共同參與的一個(gè)非常復(fù)雜的生物過程。目前乳腺腫瘤的研究熱點(diǎn)集中在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路在腫瘤形成過程中發(fā)揮的作用（活化或調(diào)控異常）及機(jī)制[10]。

本研究顯示，LAIR-1基因在乳腺癌和正常乳腺旁正常組織的比較中呈現(xiàn)高表達(dá)。LAIR-1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)更高，這是較為特異的表現(xiàn)。在＞35歲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的患者乳腺腫瘤中呈高表達(dá)，表明LAIR-1與患者年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定程度上的相關(guān)性。AKT傳導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡、放化療拮抗等作用過程中起著比較關(guān)鍵的作用。該通路在乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌等部位惡性腫瘤中發(fā)揮了一定作用，并為靶向治療提供了新的思路[11]。AKT全稱是蛋白激酶B，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，LAIR-1是其中的一個(gè)家族成員。LAIR-1是紡錘體形成所必須的蛋白。紡錘體形成、配裝缺失，細(xì)胞周期阻滯凋亡能夠抑制活體乳腺癌的生長(zhǎng)[12]。以往的研究顯示[13]，被轉(zhuǎn)染活化的AKT基因在細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中發(fā)揮著穩(wěn)定的惡性表型，此結(jié)果一定程度上說明了該基因在細(xì)胞異常活化和惡化過程中作用，在乳腺癌，前列腺癌，肝癌中均發(fā)現(xiàn)AKT活性顯著升高。LAIR-1作為中心體調(diào)節(jié)蛋白，LAIR-1活性增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致中心體過度復(fù)制分離，有絲分裂紡錘體裝配出現(xiàn)錯(cuò)誤，繼而導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性缺失，染色體異常分離刺激抑制癌癥基因缺失，更易導(dǎo)致癌癥細(xì)胞快速分化增殖引發(fā)惡性腫瘤[14]。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，AKT基因家族在人類的細(xì)胞中表達(dá)較低，只有在細(xì)胞有絲分裂過程中更容易被表達(dá)和激活，近年來(lái)此細(xì)胞通路成為抗癌靶向藥物中最有價(jià)值的靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌的分期中，AKT基因扮演著重要角色，乳腺癌分期、AKT基因都與非整倍體密切相關(guān)。在大鼠的實(shí)驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)了大鼠乳腺腫瘤與AKT下游基因的相關(guān)，由此推測(cè)BTAK除了在形成異倍體、腫瘤惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用外，還可激活下游基因促使腫瘤發(fā)生發(fā)展[16]。

綜上所述，LAIR-1對(duì)三陰性乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中呈現(xiàn)促進(jìn)作用。