柯建飛 項(xiàng)國(guó)謙

肝細(xì)胞肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是指由肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生的癌腫，死亡率高[1]。肝細(xì)胞肝癌的病因和發(fā)病機(jī)理尚未明確，起病隱匿，病情發(fā)展迅速，早期手術(shù)切除是最有效的治療方法[1-2]。異常凝血酶原（protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ）是指由于維生素K 缺乏或者由于服用維生素K 拮抗劑而產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)。PIVKA-Ⅱ是凝血Ⅱ因子（凝血酶原）的PIVKA體，因此也被稱為異常凝血酶原。PIVKA-Ⅱ可出現(xiàn)在維生素K 缺乏或肝細(xì)胞肝癌患者的血清中，是診斷肝細(xì)胞肝癌的另一個(gè)重要指標(biāo)，可與血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）互為補(bǔ)充。正常個(gè)體中無(wú)PIVKA-Ⅱ，但在肝病和肝細(xì)胞肝癌患者中即便未出現(xiàn)維生素K 缺乏，也可能存在PIVKA-Ⅱ。近年來(lái)，多數(shù)學(xué)者主張采取PIVKA-Ⅱ聯(lián)合AFP 檢測(cè)的方式診斷早期肝細(xì)胞肝癌[3-6]，大大提高了早期肝細(xì)胞肝癌的檢出率。本文探討PIVKA-Ⅱ在肝細(xì)胞肝癌中的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2020 年11 月至2021 年3 月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院確診的肝細(xì)胞肝癌患者45 例，肝硬化患者36 例。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》的相關(guān)要求。肝細(xì)胞肝癌病例診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019 年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)，肝硬化病例診斷符合2010 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染分會(huì)制訂的《病毒性肝炎防治指南》中關(guān)于病毒性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有病例均無(wú)維生素K 缺乏、無(wú)自身免疫性疾病及血液系統(tǒng)疾病，均未服用維生素K 及維生素K 拮抗劑類藥物。同時(shí)選取同時(shí)期健康體檢者40 例作為對(duì)照組。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理審查，倫理編號(hào)：ZN-20220401-0056-01。

1.2 儀器與試劑 PIVKA-Ⅱ采用美國(guó)雅培公司提供的ARCHITECT i2000 全自動(dòng)免疫分析儀及配套異常凝血酶原測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)（試劑批號(hào)：26891LP30）。AFP 采用美國(guó)雅培公司提供的ARCHITECT i4000SR 全自動(dòng)免疫分析儀及配套試劑盒進(jìn)行檢測(cè)（試劑批號(hào)：29510FN00）。

1.3 樣本采集 按照要求，靜脈穿刺采取三組研究對(duì)象促凝血5 mL。靜置10 min，3000 r/min 離心10 min，觀察血清無(wú)溶血。將澄清樣本轉(zhuǎn)移至樣品杯或新試管中，以備檢測(cè)。

1.4 PIVKA-Ⅱ檢測(cè) 異常凝血酶原（PIVKA-Ⅱ）采用兩步法免疫檢測(cè)，運(yùn)用Chemiflex 技術(shù)，即CMIA技術(shù)與靈活的檢測(cè)模式的結(jié)合，定量檢測(cè)人血清PIVKA-Ⅱ。（1）混合樣本、稀釋液和PIVKA-Ⅱ抗體包被的順磁性微粒子。樣本中的PIVKA-Ⅱ與PIVKA-Ⅱ抗體包被的微粒子相結(jié)合。（2）沖洗后進(jìn)入第二步，加入吖啶酯標(biāo)記的凝血酶原抗體結(jié)合物，形成反應(yīng)混合物。（3）再次沖洗后，將預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液加入到反應(yīng)混合物中。（4）測(cè)量產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，以相對(duì)發(fā)光單位（RLU）表示。樣本中的PIVKA-Ⅱ含量與發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)到的RLU 值之間成正比。血清PIVKA-Ⅱ的參考區(qū)間為≤40 mAU/mL。

1.5 AFP 檢測(cè) AFP 檢測(cè)采用直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)的雙抗體夾心法。（1）分配10 μL 樣品到比色杯內(nèi)。（2）分配50 μL 標(biāo)記試劑和250 μL 固相試劑，在37 ℃條件下孵育7.5 min。（3）分離、吸出未結(jié)合試劑，然后用試劑水洗滌比色杯。（4）配制酸性試劑和堿性試劑各300 μL，啟動(dòng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。測(cè)量產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，以相對(duì)發(fā)光單位（RLU）表示。樣本中的AFP 含量與發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)到的RLU 值之間存在正比關(guān)系。血清AFP 的參考區(qū)間為≤20 ng/mL。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩變量之間行相關(guān)分析。使用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清PIVKA-Ⅱ和AFP 的診斷效能。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組研究對(duì)象一般資料比較 肝細(xì)胞肝癌組45 例，年齡（59.75±11.41）歲，男34 例（76%），女11例（24%）；肝硬化組36 例，年齡（64.05±7.62）歲，男25 例（69%），女11 例（31%）；對(duì)照組40 例，年齡（58.60±14.15）歲，男28 例（70%），女12 例（30%）。三組研究對(duì)象年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 不同組別血清PIVKA-Ⅱ、AFP 水平比較 肝細(xì)胞肝癌組血清PIVKA-Ⅱ水平明顯高于肝硬化組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肝硬化組和對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三組之間AFP 水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組血清PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平比較（）

表1 各組血清PIVKA-Ⅱ表達(dá)水平比較（）

注：PIVKA-Ⅱ?yàn)楫惓Ｄ冈籄FP 為甲胎蛋白；與肝硬化組、對(duì)照組比較，aP＜0.05

2.3 PIVKA-Ⅱ、AFP 單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肝細(xì)胞肝癌診斷效能分析 PIVKA-Ⅱ和AFP 單獨(dú)檢測(cè)的敏感性明顯低于PIVKA-II+AFP 聯(lián)合檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 血清PIVKA-Ⅱ、AFP 單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌診斷效能（%）

2.4 PIVKA-Ⅱ、AFP 單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌時(shí)ROC 曲線分析 PIVKA-Ⅱ臨界值為47.715 mAU/mL時(shí)，診斷肝細(xì)胞肝癌的曲線下面積為0.884；AFP 臨界值為4.35 μg/L 時(shí)，診斷肝細(xì)胞肝癌的曲線下面積為0.787；PIVKA-Ⅱ+AFP 聯(lián)合檢測(cè)時(shí)ROC 曲線下面積為0.901，PIVKA-Ⅱ、AFP 單獨(dú)檢測(cè)分別與PIVKA-Ⅱ+AFP 聯(lián)合檢測(cè)曲線下面積比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 PIVKA-Ⅱ、AFP 單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)原發(fā)性肝癌時(shí)ROC 曲線

2.5 各組PIVKA-Ⅱ、AFP 檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率比較肝細(xì)胞肝癌組血清PIVKA-II 或AFP 檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率為71.1%（32/45），肝硬化組為11.1%（4/36），對(duì)照組為17.5%（7/40），三組數(shù)據(jù)總體均數(shù)存在著統(tǒng)計(jì)差異（χ2=39.92，P＜0.001）。肝細(xì)胞肝癌組與肝硬化組、對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肝硬化組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組血清PIVKA-Ⅱ、AFP 檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率比較[例（%）]

3 討論

肝細(xì)胞肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率高居所有腫瘤死亡率第二位[7-8]。其原因除了缺乏有效的治療方式外，更重要的是肝細(xì)胞肝癌早期無(wú)明顯的癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已是晚期。肝細(xì)胞肝癌晚期的治療方式有限、治療效果也不理想。目前常用的肝癌檢測(cè)方法包括超聲檢查結(jié)合血清標(biāo)志物AFP 測(cè)定，但是二者均有不足。超聲檢查不易發(fā)現(xiàn)早期肝癌。血清標(biāo)志物AFP 是目前最常用的肝癌標(biāo)志物，但其易受到肝硬化、梗阻性膽道系統(tǒng)疾病等影響。同時(shí)AFP 可以在多種腫瘤中表現(xiàn)出較高的濃度，因此它在診斷早期肝癌時(shí)的特異性和靈敏性都不理想，漏診率也較高，也無(wú)法進(jìn)行治療后的療效判斷[9-10]。

PIVKA-Ⅱ是維生素K 缺乏或采用華法林或苯丙香豆素進(jìn)行治療的患者中的一種異常脫羧基凝血酶原（DCP）。由于PCP 不能通過(guò)結(jié)合鈣離子與磷脂聯(lián)結(jié)，因此存在功能缺陷。PIVKA 測(cè)量可在常規(guī)凝血試驗(yàn)結(jié)果變化前或出血前便檢出維生素K 缺乏。正常個(gè)體中無(wú)PIVKA-Ⅱ，但肝病和肝臟惡性腫瘤患者中即便未出現(xiàn)維生素K 缺乏，也可能存在PIVKA-Ⅱ[11]。多項(xiàng)研究表明，PIVKA-Ⅱ?qū)υ\斷肝細(xì)胞肝癌的特異性高于AFP，能明顯提高肝細(xì)胞肝癌的檢出率，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)早治療的目標(biāo)。Parameter、APASL 和JSH等權(quán)威指南和共識(shí)都推薦將PIVKA-Ⅱ作為肝細(xì)胞肝癌篩查、輔助診斷及預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。亞太肝病學(xué)會(huì)及日本肝病學(xué)會(huì)推薦將其用于高危人群的篩查、肝病的輔助診斷、治療效果的監(jiān)測(cè)和預(yù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)工具。中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)最新發(fā)布的《慢性乙肝防治指南》，也推薦使用PIVKA-Ⅱ，與AFP 互為補(bǔ)充，提高肝細(xì)胞肝癌的早期診斷率。同時(shí)肝癌的早發(fā)現(xiàn)也極大的提高了其疾病的預(yù)后，提高了肝癌患者生活質(zhì)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，PIVKA-Ⅱ既可輔助診斷肝細(xì)胞肝癌，也可用于肝細(xì)胞肝癌和肝硬化的鑒別診斷，降低肝癌的誤診率和漏診率。PIVKA-Ⅱ水平彌補(bǔ)了AFP特異性差的缺陷，為臨床診斷HCC 提供了新的高特異性的血清學(xué)指標(biāo)。而PIVKA-Ⅱ和AFP 聯(lián)合檢測(cè)可提高HCC 檢出的敏感性，有助于肝癌的及早發(fā)現(xiàn)。且血清PIVKA-Ⅱ水平能提示肝細(xì)胞肝癌的嚴(yán)重程度，為臨床早期診斷提供強(qiáng)有力的支撐條件[12-15]。

綜上所述，PIVKA-Ⅱ不僅有較高的特異性，還可用于肝細(xì)胞肝癌和肝硬化的鑒別診斷。通過(guò)ROC曲線發(fā)現(xiàn)，PIVKA-Ⅱ和AFP 聯(lián)合檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌的敏感性遠(yuǎn)大于單獨(dú)檢測(cè)，可大幅提升早期肝細(xì)胞肝癌的診斷效能。同時(shí)也可為肝癌的早期診斷提供新的思路和方向，為患者爭(zhēng)取更多的治療方法和治療時(shí)間。本研究由于入選患者不多，樣本量不足，后期還需更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)予以證實(shí)。