李 瑋 張慧和 朱政羽 趙 娜

抑郁癥臨床可見情緒低落、悲觀消極甚至更有自殺傾向和行為，常伴有軀體化癥狀，如頭暈頭痛、胸悶氣短、胃腸道不適、四肢乏力麻木等。調(diào)查顯示，全球抑郁癥患者約3.4 億人，而我國患有抑郁癥人數(shù)已達(dá)2600 萬，引發(fā)自殘、自殺風(fēng)險較高，大學(xué)生抑郁癥復(fù)發(fā)率也逐年增加[1-2]。目前單胺氧化酶抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥物和第二代抗抑郁藥物等西藥均對改善抑郁癥狀有顯著效果，但不良反應(yīng)較大[3]。中醫(yī)藥治療抑郁癥具有減輕西藥不良反應(yīng)、綜合調(diào)理等優(yōu)勢，臨床可根據(jù)辨證分型選擇方藥。頤腦解郁方由柴胡、郁金、槲寄生、百合、五味子、白芍組成，具有疏肝解郁、調(diào)暢情志作用，可以改善抑郁癥患者血清多巴胺、5-羥色胺、去甲腎上腺素含量，從而改善抑郁癥，但其具體作用機制仍不明確[4-5]。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中醫(yī)藥治療疾病研究提供了很多新的依據(jù)，備受關(guān)注，其結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)信息，進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)木W(wǎng)絡(luò)分析，并進(jìn)行交集選取靶點，進(jìn)一步分析出中藥治療疾病的相關(guān)信號通路。分子對接是對藥物的受體和藥物分子之間的分子結(jié)合模式以及親和力進(jìn)行模擬分析，是計算機時代輔助藥物研究的一種新型研究方式。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討頤腦解郁方治療抑郁癥的作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 頤腦解郁方活性成分獲取 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://tcmsp -e.com/）、Symmap 數(shù)據(jù)庫（www.symmap.org/search/）檢索頤腦解郁方各個中藥的化合物，口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為條件篩選頤腦解郁方的活性成分，并通過文獻(xiàn)檢索對雖不滿足上述條件，但卻有明顯藥效作用或中藥含量較多的活性成分予以補充。

1.2 頤腦解郁方活性成分靶點預(yù)測 通過TCMSP（https://tcmsp-e.com/）、Uniprot（https://www.uniprot.org/）、Symmap 數(shù)據(jù)庫（www.symmap.org/search/）網(wǎng)站將1.1篩選出的活性成分進(jìn)行活性成分靶點預(yù)測。

1.3 抑郁癥相關(guān)靶點搜集 通過檢索GeneCard（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、pharmgkb（https://www.pharmgkb.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.org/）數(shù)據(jù)庫關(guān)鍵詞為“Depression（抑郁癥）”，為提高結(jié)果的可信度GeneCards 選擇Relevance score≥5 的結(jié)果。將1.2 獲取的頤腦解郁方活性成分靶點與抑郁癥相關(guān)靶點取交集，取交集的靶點作為頤腦解郁方治療抑郁癥的潛在靶點。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用STRING 數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI），在“multiple protein”欄目輸入頤腦解郁方治療抑郁癥的潛在靶點，物種設(shè)定為“Homo sapiens”，置信度選擇“high confidence（0.700）”，獲取頤腦解郁方療效相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)，并將此網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 進(jìn)行可視化，采用插件CytoNCA 篩選關(guān)鍵基因。

1.5 功能富集分析 利用RStudio 進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，選用R 包“clusterProfiler”[6]，設(shè)定P-value＜0.01，并通過“ggplot2”包對顯著富集結(jié)果進(jìn)行作圖。

1.6 分子對接 將關(guān)鍵靶點及其對應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對接實驗，驗證其相互作用活性，對接軟件選擇AutoDock Vina。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www1.rcsb.org/）下載，化合物從Uniport 數(shù)據(jù)庫下載。利用AutoDock Tools 對蛋白質(zhì)晶體和化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理，包括分離蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和原始配體、去除水分子和為結(jié)構(gòu)加電荷，轉(zhuǎn)換成“PDBQT”格式，利用Vina 軟件完成分子對接，提取對接結(jié)果，并使用Pymol 軟件對結(jié)合能力較強的結(jié)合模式進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 頤腦解郁方中藥活性成分搜集結(jié)果 將頤腦解郁方各個中藥組成進(jìn)行分析，對比相應(yīng)的活性化合物，共獲取頤腦解郁方活性化合物72 個，其中柴胡17 個、郁金15 個、槲寄生7 個、百合7 個、五味子13個、白芍13 個。

2.2 頤腦解郁方活性成分靶點預(yù)測及抑郁癥相關(guān)靶點搜集 經(jīng)過詳細(xì)的分析研究，共獲得頤腦解郁方活性成分靶點1363 個，抑郁癥相關(guān)靶點3236 個（見圖1）。將頤腦解郁方活性成分靶點與抑郁癥相關(guān)靶點取交集，作為頤腦解郁方治療抑郁癥的潛在作用靶點，共169 個（見圖2），并繪制藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（見圖3）。

圖1 抑郁癥疾病靶點韋恩圖

圖2 頤腦解郁方與疾病靶點韋恩圖

圖3 藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建頤腦解郁方 使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建核心治療靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4）。圖中169 個靶點存在3168 條相互作用。通過利用Cytoscape 中插件CytoNCA 篩選出網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點13、37 和74 個，其中IL6、VEGFA、TNF 等18 節(jié)點的DC、CC 和BC 超過整個網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)的平均值，說明TNF、AKT1、MAPK3、VEGFA、IL6、CASP3、JUN、PTGS2、TP53 這9 個靶點可能是頤腦解郁方治療抑郁癥的關(guān)鍵靶點（見圖5）。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 關(guān)鍵靶點篩選圖

2.4 功能富集分析

2.4.1 GO 富集分析結(jié)果 經(jīng)過GO 富集分析，共得到頤腦解郁方潛在治療靶點的GO 條目2983 條，其中生物學(xué)過程（biological process，BP）2624 條、分子功能（molecular function，MF）243 條以及細(xì)胞組分（cellular component，CC）116 條，顯著富集結(jié)果如圖6、圖7 所示。潛在治療靶點涉及的BP 主要為炎癥反應(yīng)（inflammation）、氧化應(yīng)激（oxidative stress）、脂多糖調(diào)節(jié)過程（lipopolysaccharide）等。

圖6 GO 富集分析氣泡圖

圖7 GO 富集分析柱狀圖

2.4.2 KEGG 富集分析結(jié)果 經(jīng)過KEGG 富集分析，共得到頤腦解郁方潛在治療靶點顯著富集的KEGG 通路194 條（見圖8、圖9）。194 條顯著富集的通路所涉及的生物過程主要包括免疫系統(tǒng)（immune system）、信號傳導(dǎo)（signal transduction）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（endocrine system）等。其中有IL-17 信號通路、TNF信號通路等。

圖8 KEGG 分析氣泡圖

圖9 KEGG 分析柱狀圖

2.5 分子對接結(jié)果 將關(guān)鍵靶點及其對應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對接實驗，驗證其相互作用活性，關(guān)鍵蛋白質(zhì)與其對應(yīng)的化合物的對接結(jié)果見表1；分子對接結(jié)果的平均結(jié)合能為-7.23 kcal/mol，低于-5 kcal/mol表明靶點蛋白和化合物具有較強的結(jié)合能力[7]。對接結(jié)合活性較強的結(jié)果進(jìn)行對接模式分析，由下圖可知，頤腦解郁方活性成分均深入活性位點，并與活性位點關(guān)鍵氨基酸殘基形成極性或非極性鍵，以穩(wěn)定配體和受體的結(jié)合。頤腦解郁方相互作用力分析結(jié)果顯示頤腦解郁方的活性成分主要通過氫鍵、疏水作用、pi 相互作用及范德華力與關(guān)鍵靶點的活性位點相結(jié)合，見表1、圖10。

圖10 活性成分與靶蛋白分子對接圖

表1 核心成分與核心靶點的分子對接（kcal/mol）

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分析對接對頤腦解郁方治療抑郁癥進(jìn)行深入的分析和研究，通過TCMSP、Symmap 數(shù)據(jù)庫分析及文獻(xiàn)補充，共篩選出頤腦解郁方中藥物的72 種活性成分，對應(yīng)1363 個靶點。通過Cytoscape 中插件CytoNCA 的篩選，獲得了頤腦解郁方治療抑郁癥關(guān)鍵靶點有9 個分別為TNF、AKT1、MAPK3、VEGFA、IL6、CASP3、JUN、PTGS2、TP53，其中IL6 是促炎細(xì)胞因子，其在抑郁癥的發(fā)病機制過程中有著顯著的作用[8]。MAPK3 是MAPK 信號通路中的一員，許多參與神經(jīng)營養(yǎng)因子信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵基因均與MAPK 活性相關(guān)[9]。研究顯示，抑郁患者血清中IL-6、TNF 水平與抑郁癥嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，其中TNF-α 拮抗劑可以通過調(diào)節(jié)MAPK 信號通路，從而引起各種抑郁癥狀[10]。TNF 為促炎細(xì)胞因子，它可激活I(lǐng)L-6 和TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子，還可調(diào)節(jié)MAPK 等基因，調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)及組織細(xì)胞重塑[11]。VEGFA 介導(dǎo)的血管生成，會加重炎癥反應(yīng)，并與抑郁嚴(yán)重程度成正相關(guān)[12]。有文獻(xiàn)研究顯示，靶基因TP53 在細(xì)胞周期阻滯、凋亡、衰老、DNA 修復(fù)以及細(xì)胞代謝等過程中起到相當(dāng)重要的作用[13]。PTGS2 是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶，既是一種雙加氧酶又是一種過氧化物酶，是非甾體類藥物的作用靶點之一，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[14]。

頤腦解郁方療效相關(guān)靶點的GO 分析結(jié)果顯示，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、脂多糖等生物學(xué)過程顯著富集，通過KEGG 富集分析，共篩選出30 條顯著富集的分子通路，其中有IL-17 信號通路、TNF 信號通路等。這2 條信號通路主要是與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞代謝密切相關(guān)[15]，結(jié)合上述的9 個靶點的分析，頤腦解郁方對抑郁癥的作用機制可能是通過影響TNF、AKT1、MAPK3、VEGFA、IL6、CASP3、JUN、PTGS2、TP53因子的表達(dá)進(jìn)一步影響抑郁癥的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞代謝等過程。

分子對接結(jié)果關(guān)鍵蛋白質(zhì)與其對應(yīng)的化合物顯示，山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）與關(guān)鍵靶點PTGS2、TP53 具有較強的結(jié)合活性，說明這些中藥化合物可能是頤腦解郁方發(fā)揮藥效的關(guān)鍵組分。山柰酚具有抗抑郁的作用[16]。β-谷甾醇是一種植物甾醇，可以緩解小鼠抑郁行為[17]。本研究提示頤腦解郁方關(guān)鍵組分與PTGS2、TP53 等炎癥因子對接緊密，提示山柰酚、β-谷甾醇等是頤腦解郁方抑制抑郁癥炎癥反應(yīng)的主要中藥化合物。圖10 顯示出了頤腦解郁方活性成分與靶蛋白分子活性位點相結(jié)合，目前針對中藥化合物的研究較少，可以作為未來的研究方向。綜上所述，中藥化合物山柰酚、β-谷甾醇為頤腦解郁方治療抑郁癥的關(guān)鍵化合物。

因此，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的詳細(xì)分析結(jié)果和數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖得知，頤腦解郁方可能通過多個中藥化合物作用于多個分子靶點發(fā)揮其對抑郁癥的治療作用，其分子機制主要涉及抑制抑郁癥炎癥反應(yīng)，減弱氧化應(yīng)激等方面，此結(jié)果可以為頤腦解郁方治療抑郁癥提供一定的依據(jù)，但上述所得結(jié)果主要來源生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，存在一定的局限性，還需要進(jìn)一步嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭游飳嶒灪团R床試驗進(jìn)行驗證。