李強(qiáng) 龐仲輝 陶飛飛 徐文龍

(陜西省第四人民醫(yī)院，陜西 西安 710032)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種常見于老年人的以軟骨發(fā)生退行性變化為主要癥狀的骨科疾病[1-2]。骨關(guān)節(jié)的軟骨關(guān)節(jié)由大量的軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)構(gòu)成[3]，特別是軟骨基質(zhì)在骨關(guān)節(jié)發(fā)揮正常功能過程中扮演重要角色，但是軟骨基質(zhì)包括大量高度分化的無血管組織，因而導(dǎo)致其自我修復(fù)能力差，一旦發(fā)生基質(zhì)降解將對(duì)骨關(guān)節(jié)造成嚴(yán)重?fù)p傷[4-6]。

萆薢是一味傳統(tǒng)中藥，中醫(yī)理論認(rèn)為其具有利濕去濁和祛風(fēng)通痹的作用，因而中醫(yī)將其用以治療風(fēng)濕痹痛，關(guān)節(jié)不利，腰膝疼痛等疾病[7]。萆薢總皂苷是萆薢的主要成分，本研究前期研究已經(jīng)在體外證實(shí)萆薢總皂苷能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的分泌[8]，但是萆薢總皂苷對(duì)OA的體內(nèi)作用如何，尚未見報(bào)道，因此本研究在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討萆薢總皂苷對(duì)OA的體內(nèi)作用，并初步研究其發(fā)揮作用的調(diào)控因子。

1 儀器與材料

1.1儀器 FV3000激光共聚焦掃描儀(日本奧林巴斯公司)；VS120切片掃描儀(日本奧林巴斯公司)。

1.2試藥 萆薢總皂苷(貨號(hào):T4S0290，純度≥98%)、牛膝總皂苷(貨號(hào):T3912，純度≥98%)購自陶素生化；蘇木素、鹽酸乙醇、伊紅、乙醇、二甲苯、固綠染液、苦味酸、磷鉬酸、丙酮、多聚甲醛購自西安科昊生物；Col-Ⅱ(貨號(hào):ab325436)、NELL-1抗體(貨號(hào):ab653423)(Abcam 英國)；IL-1、TNF-α和MMP-13 ELISA試劑盒購自武漢天根生物。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只豚鼠，雄性，體重(812±65.34) g，普通清潔級(jí)，10周齡，購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2021-0103，動(dòng)物合格證號(hào)：No00343524；飼養(yǎng)在陜西省第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科研中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，所有豚鼠均按照要求規(guī)范飼養(yǎng)和操作。

2 方法

2.1豚鼠實(shí)驗(yàn)分組與給藥 取實(shí)驗(yàn)用豚鼠，隨機(jī)分為Con組、OA組、TRI組[6]和TSA[7]組，每組各10只?？瞻讓?duì)照組給予生理鹽水，治療組給予300 mg·kg-1萆薢總皂苷(TRI)，陽性對(duì)照組給予牛膝總皂苷200 mg·kg-1(TSA)，每天腹腔注射給藥1次，連續(xù)30 d。

2.2骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物造模 將豚鼠右膝關(guān)節(jié)包裹在骨關(guān)節(jié)炎模型造模支具內(nèi)，固定6 w。期間豚鼠正常飲食，保持足夠活動(dòng)空間，每天記錄豚鼠腿肢端血液循環(huán)情況、支具固定的穩(wěn)定性、豚鼠活動(dòng)量等情況[5]。

2.3HE染色 軟骨組織脫鈣處理后石蠟包埋，切片脫蠟，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化5 s；PBS洗片后氨水處理再水洗，伊紅染色5 min，最后水洗然后乙醇、二甲苯處理，樹脂封片。

2.4番紅O-固綠染色 軟骨組織脫鈣處理后包埋脫蠟；置于至60℃預(yù)熱的固綠染液中6 min；蒸餾水急洗1次；1.2%苦味酸飽和水溶液浸泡切片10 min后，再次使用蒸餾水漂洗；置于1%磷鉬酸水溶液中1 min，蒸餾水漂洗1 min；番紅O染液中著色3 min；70%、95%、100%乙醇分別脫水透明2次，二甲苯透明，樹脂封片。

2.5免疫熒光 軟骨組織脫鈣處理，用預(yù)冷的甲醇和丙酮混合液(1∶1)進(jìn)行固定，然后在1%TritonX-100/PBS中透化。洗片擦干后在4℃冰箱中和Col-II(1∶1000)抗體孵育過夜。次日4%多聚甲醛固定4 h，含15%蔗糖的PBS共孵育4 h，去離子水清洗玻片，使用激光共聚焦掃描分析切片。

2.6免疫組化 軟骨組織脫鈣處理，依次進(jìn)行石蠟切片脫蠟至水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、加NELL-1(1∶1000)一抗、加二抗、DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片以及切片掃描儀掃描分析。

2.7ELISA 抽取各組豚鼠骨關(guān)節(jié)液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)骨關(guān)節(jié)液中IL-1、TNF-α和MMP-13的含量。

3 結(jié)果

3.1TRI改善OA豚鼠關(guān)節(jié)骨組織損傷 與Con相比，OA組骨關(guān)節(jié)組織排列紊亂、骨結(jié)構(gòu)損傷，而TRI和TSA組豚鼠骨關(guān)節(jié)組織則排列有序，骨損傷顯著緩解，且TRI治療效果優(yōu)于TSA，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 HE檢測(cè)各組豚鼠關(guān)節(jié)骨組織損傷

3.2TRI抑制豚鼠關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解 與Con相比，OA組軟骨組織顯著退化，軟骨基質(zhì)明顯發(fā)生降解，而TRI和TSA組豚鼠軟骨組織退化減弱且軟骨基質(zhì)降解作用被抑制，且TRI抑制軟骨基質(zhì)降解效果優(yōu)于TSA，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.3TRI促進(jìn)豚鼠關(guān)節(jié)Ⅱ型膠原的表達(dá) 與Con相比，OA組Col-Ⅱ顯著減少，而TRI和TSA組Col-Ⅱ表達(dá)顯著增高，且TRI促表達(dá)作用強(qiáng)于TSA。

圖2 番紅-O固綠檢測(cè)各組豚鼠關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解

3.4TRI抑制IL-1、TNF-α和MMP-13的表達(dá) 與Con相比，OA組炎性因子IL-1、TNF-α和MMP-13顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而TRI和TSA抑制IL-1、TNF-α和MMP-13表達(dá)，且TRI抑制作用強(qiáng)于TSA，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 免疫熒光檢測(cè)各組豚鼠關(guān)節(jié)軟骨組織Col-Ⅱ表達(dá)

圖4 ELISA檢測(cè)各組豚鼠關(guān)節(jié)液IL-1、TNF-α和MMP-13表達(dá)

3.5TRI促進(jìn)軟骨組織NELL-1的表達(dá) 與Con相比，OA組NELL-1表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而TRI和TSA組NELL-1表達(dá)則明顯增高，且TRI組表達(dá)顯著高于TSA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 免疫組化檢測(cè)各組豚鼠關(guān)節(jié)軟骨組織NELL-1表達(dá)

4 討論

軟骨組織發(fā)生退行性變化是造成OA發(fā)生的重要因素[9-11]，多發(fā)于老年人，臨床癥狀主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)慢性疼痛，尤其是負(fù)重性疼痛[12-14]，給老年患者生活和心理帶來嚴(yán)重的不便。但是目前針對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的藥物治療主要是口服非甾體類抗炎藥以及硫酸氨基葡萄糖，或者關(guān)節(jié)內(nèi)注射玻璃酸鈉，需要患者長期用藥，效果不確切，胃腸道反應(yīng)大，治療效果有限[15]，因此針對(duì)OA的治療藥物研發(fā)一直是臨床骨科的研究熱點(diǎn)。

有研究表明傳統(tǒng)中藥牛膝含藥關(guān)節(jié)液(主要藥效成為為牛膝總皂苷)能夠有效促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖和膠原表達(dá)[16]，但是牛膝根部入藥，采集不方便，產(chǎn)量較小，炮制工藝較為繁瑣。傳統(tǒng)中醫(yī)除了用牛膝治療關(guān)節(jié)疼痛外，還常用到萆薢，也取得很好的治療效果。與牛膝相比，萆薢主要是葉部入藥，采集方便，炮制簡單[17]，且現(xiàn)代中藥藥理學(xué)已經(jīng)證實(shí)萆薢發(fā)揮作用的主要藥效成分為萆薢總皂苷[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)萆薢總皂苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎模型豚鼠具有顯著的治療作用，其緩解OA豚鼠軟骨組織損傷且抑制軟骨基質(zhì)的降解，這對(duì)治療OA尤為重要，同時(shí)發(fā)現(xiàn)萆薢總皂苷對(duì)軟骨組織損傷改善和軟骨基質(zhì)降解抑制作用優(yōu)于牛膝總皂苷，Col-II是組成軟骨基質(zhì)的主要成分，萆薢總皂苷顯著促進(jìn)Col-II表達(dá)，且促進(jìn)作用強(qiáng)于牛膝總皂苷，這為OA治療藥物研發(fā)提供一種新的藥物和治療策略。OA往往伴隨著炎性反應(yīng)發(fā)生，炎性因子在OA的發(fā)生過程中起到重要作用，體外研究發(fā)現(xiàn)萆薢總皂苷有效抑制炎性因子IL-1、TNF-α和MMP-13表達(dá)，為萆薢總皂苷的抗炎作用提供科學(xué)依據(jù)。NELL-1是一種外分泌型糖蛋白蛋白，研究表明NELL-1是一種有效的骨誘導(dǎo)因子，可以有效地促進(jìn)骨的生長[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道NELL-1能夠顯著改善和減輕OA中軟骨細(xì)胞的凋亡[20]，因此實(shí)驗(yàn)中采用免疫組化觀察萆薢總皂苷給藥后NELL-1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萆薢總皂苷和牛膝總皂苷均可顯著促進(jìn)NELL-1的表達(dá)，但是萆薢總皂苷給藥組NELL-1陽性表達(dá)顯著高于牛膝總皂苷給藥組，這表明萆薢總皂苷很可能通過調(diào)控NELL-1發(fā)揮治療OA的作用，為OA的發(fā)生機(jī)制和萆薢總皂苷的作用靶點(diǎn)提供一定理論依據(jù)。

綜上所述，本研究明確萆薢總皂苷能夠在體內(nèi)顯著改善OA發(fā)生過程中骨結(jié)構(gòu)損傷，同時(shí)能夠抑制軟骨基質(zhì)降解以及發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)萆薢總皂苷可能通過調(diào)控NELL-1分子發(fā)揮以上作用，但是具體調(diào)控途徑和機(jī)制不明，因此下一步研究組將重點(diǎn)探討萆薢總皂苷調(diào)控NELL-1的具體信號(hào)通路，完善萆薢總皂苷治療OA的理論依據(jù)，同時(shí)為OA的藥物治療提供新的研究方向和治療方法。