張 強(qiáng) ，楊曉亮，楊曉波,師宏斌，趙瑞寧，張 超

隨著老齡化社會(huì)的不斷進(jìn)展，在男性人群中前列腺增生的發(fā)病率不斷增高，越來(lái)越多的中老年男性正遭受著前列腺增生癥狀所致的痛苦，也越來(lái)越受到臨床工作者及研究者的重視和關(guān)注[1]。目前，對(duì)于前列腺增生的治療主要包括藥物治療和手術(shù)治療，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，手術(shù)治療的方式也呈現(xiàn)出多樣性[2]。然而，對(duì)于前列腺增生的治療缺乏特別安全有效的治療手段。因此，對(duì)于前列腺增生發(fā)病機(jī)制的研究顯得越來(lái)越重要。前列腺增生的病理生理特點(diǎn)有前列腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞非惡性增生[3]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的增殖和凋亡紊亂會(huì)致使上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)增殖，而轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(CD71)和鈣黏附蛋白E(E-cadherin)與細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)[4-6]。但目前關(guān)于這兩種蛋白在前列腺增生機(jī)制中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬探討CD71與E-cadherin在丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺組織中的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：6周齡12只昆明SD大鼠，雄雌各半，隨機(jī)分為模型組(n=6)和對(duì)照組(n=6)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SPF級(jí))提供，許可證號(hào)：SCXK(寧)2019-0001。

1.2 主要試劑和儀器：丙酸睪酮購(gòu)自上海通用藥業(yè)股份有限公司，兔來(lái)源的一抗CD71與E-cadherin抗體、山羊來(lái)源的二抗等購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，免疫組化試劑盒等購(gòu)自博士德生物有限公司，蛋白提取試劑盒購(gòu)自凱基生物有限公司。

1.3 模型建立及標(biāo)本制備：模型組大鼠皮下注射丙酸睪酮1 mL(2.5 mg/kg·d)[7]，對(duì)照組給予相同劑量生理鹽水皮下注射，連續(xù)4周，末次注射后，在無(wú)菌低溫下剖腹取前列腺，左側(cè)前列腺置于-80 ℃保存，右側(cè)前列腺用4%的多聚甲醛固定。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)：石蠟包埋前列腺組織進(jìn)行4 μm切片，60 ℃烤箱烤片4 h，二甲苯梯度脫蠟，無(wú)水乙醇梯度脫水，抗原修復(fù)，CD71和E-cadherin一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色。蘇木精復(fù)染，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.5 蛋白印跡檢測(cè)：蛋白提取、煮沸5 min，-80 ℃保存。SDS-PAGE電泳，一抗孵育：將抗β-actin按1∶10 000比例稀釋，一抗CD71與E-cadherin均按1∶2 000比例稀釋，室溫?fù)u床孵育；二抗孵育：山羊抗兔二抗按1∶10 000稀釋，室溫?fù)u床孵育；滴加超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物、暗室曝光，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠前列腺組織免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)：CD71與E-cadherin蛋白在前列腺上皮細(xì)胞細(xì)胞中的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中均有陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖1至圖2(封三)。

2.2 大鼠前列腺組織蛋白印跡檢測(cè)：模型組CD71與E-cadherin蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1與圖3至圖4(封三)。

3 討論

良性前列腺增生(BPH)是中老年男性患者常見(jiàn)的一種疾病，嚴(yán)重影響著中老年男性的身體健康及生活質(zhì)量，目前治療手段主要是藥物治療和手術(shù)治療，但手術(shù)治療后仍有一定的復(fù)發(fā)率。因此，對(duì)于BPH的發(fā)病機(jī)制研究越來(lái)越受到相關(guān)學(xué)者的重視。有研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生可能與細(xì)胞增殖與凋亡失衡、氧化應(yīng)激以及激素異常分泌等有關(guān)，具體發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚[3,8]。本實(shí)驗(yàn)室采用不去勢(shì)、皮下注射丙酸睪酮誘導(dǎo)大鼠前列腺模型更貼合中老年BPH患者的生理特點(diǎn)[7]。

CD71是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，在人體多種細(xì)胞中表達(dá)，其能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵的攝取，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，其與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合后主要表達(dá)于增殖細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而調(diào)控細(xì)胞對(duì)鐵的吸收，從而促進(jìn)DNA的合成，增進(jìn)細(xì)胞的增殖[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，增殖活躍的非腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，CD71的表達(dá)明顯增高，CD71在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況可間接反映腫瘤的增殖狀況[12-13]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺增生模型組，CD71表達(dá)明顯高于對(duì)照組，可間接看出前列腺上皮細(xì)胞中CD71的高表達(dá)對(duì)于上皮細(xì)胞的增生起到了重要作用。

E-cadherin是表皮-鈣黏附素，具有上皮細(xì)胞親和性的分子，是維持上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性和極性的跨膜糖蛋白[14]。研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有重要作用。隨著對(duì)E-cadherin研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其可影響Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖分化中起到了關(guān)鍵性的作用，同時(shí)，E-cadherin與β-catenin通路是相互融合的，而β-catenin在Wnt信號(hào)通路中又發(fā)揮著重要作用[15]。因此，E-cadherin與Wnt信號(hào)通路能協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化。本實(shí)驗(yàn)中，模型組前列腺上皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明前列腺上皮細(xì)胞E-cadherin高表達(dá)，致使細(xì)胞增殖分化能力增強(qiáng)，增加了前列腺上皮細(xì)胞的增殖能力，與前列腺增大有關(guān)。

丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺組織中CD71與E-cadherin高表達(dá)，其高表達(dá)可增加前列腺上皮細(xì)胞的增殖以及分化，使得前列腺不斷增大，從而導(dǎo)致前列腺增生疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)為前列腺增生的發(fā)病機(jī)制提供了新的科學(xué)依據(jù)，但疾病的發(fā)生是受多方面因素的影響，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。