馬 剛，納 莉，王 婷，黃 菱，李凱璇

肺癌是威脅人類健康的重大疾病，是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，預后差，5年生存率低于15%[1]。黑種草子是阿拉伯地區(qū)及我國新疆、云南、西藏等地的特色植物?，F(xiàn)代研究表明，黑種草子具有止咳平喘、抗腫瘤、保肝、降脂等多方面藥理功效[2-4]。百里醌是黑種草子的主要成分之一。文獻報道百里醌對肺癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞有抑制增殖、促進凋亡的作用[5]。ATQTHB是由MUJAHID YUSUFI等學者[6]首先合成并報道的百里醌類似物之一，研究發(fā)現(xiàn)ATQTHB對胰腺癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用。ATQTHB對肺癌細胞是否也具有抑制增殖的作用，目前尚未見到文獻報道。本研究以人肺腺癌A549細胞為主要研究對象，研究百里醌類似物ATQTHB對其增殖是否具有抑制作用，為抗腫瘤藥物篩選提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料：人肺腺癌細胞系A549和人正常肺上皮細胞系BEAS-2B均購自中國細胞資源庫保藏中心。CCK-8試劑盒購買自北京索萊寶公司；流式凋亡檢測試劑盒采購自北京達科為生物公司；小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、小鼠抗人BAX多克隆抗體購買自美國Abcam公司；內參Actin抗體、HRP-兔抗小鼠IgG抗體購自北京金杉中橋公司。RPMI 1640和胎牛血清(FBS)購自美國invitrogen公司。Percoll試劑和PBS緩沖液購自北京索萊寶公司。CCK-8檢測采用全波長分光光度儀(美國Thermo公司)；流式檢測采用美國貝克曼庫爾特有限公司CytoFLEX流式細胞儀；Western blot實驗電泳、轉膜及曝光系統(tǒng)是美國Bio-rad公司設備。

1.2 實驗設計：①委托藥明康德公司人工合成百里醌類似物ATQTHB，純度95%。②隨后，采用CCK-8細胞增殖實驗分析不同濃度的ATQTHB(18.75、37.5、75、150、200、300、400、600 μg/mL)對肺癌A549細胞增殖是否具有抑制作用以及最適干預濃度。③采用最適濃度干預，分為5組：空白對照組、A549細胞組、A549細胞+ATQTHB干預組、人正常肺上皮細胞(BEAS-2B)組、BEAS-2B細胞+ATQTHB干預組。采用CCK-8法分析細胞增殖抑制情況，采用流式細胞術檢測細胞凋亡水平，采用western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達水平。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 CCK-8檢測細胞增殖：取對數(shù)生長期A549細胞或BEAS-2B細胞分別種入96孔板， 200 μl每孔含有 1×104個細胞， 培養(yǎng)24 h后分別加入200 μl終濃度為18.75、37.5、75、150、200、300、400、600 μg/mL的ATQTHB溶液，對照孔僅加入完全培養(yǎng)基。孵育48 h后吸去上液，加入50 μg/mL的CKK-8溶液100 μl，培養(yǎng)4 h后吸去上液，加入150 μl DMSO，脫色搖床振蕩10 min后用酶標儀檢測 570 nm/490 nm 密度值(OD值)。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡：經上述各組處理后收集細胞，用PBS清洗2遍，4 ℃、400×g離心5 min。調整細胞濃度為1×106個/mL，采用流式凋亡試劑盒中FITC-Annexin V和PI的4 ℃避光孵育30 min后，PBS清洗2遍，4 ℃，400×g離心5 min。細胞重懸于300 μl PBS緩沖液，經100目濾網過濾后，用Beckman公司CytoFLEX流式細胞儀上樣檢測。使用LEGENDplex軟件(美國Biolegend公司)分析數(shù)據。

1.3.3 Western blot分析：提取總蛋白后制備等量樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,并將蛋白質轉至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，洗膜后分別加入一抗：小鼠抗人Bcl-2抗體、小鼠抗人BAX抗體，4 ℃孵育過夜。取出平衡室溫后加入兔抗小鼠 HRP-IgG二抗，室溫孵育1 h，加入增強化學發(fā)光顯色液，立即采用ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光拍照。條帶灰度掃描分析用Image J灰度分析軟件，結果以目的蛋白條帶灰度值/內參灰度值表示。本研究以Actin為內參。

2 結果

2.1 不同濃度百里醌類似物ATQTHB對A549細胞增殖的影響：分別采用濃度為18.75、37.5、75、150、200、300、400、600 μg/mL的ATQTHB溶液作用于A549細胞，CCK-8結果表明，各個濃度均具有顯著抑制腫瘤細胞增殖作用(P<0.05)。濃度在18.75～300 μg/mL，抑制細胞增殖程度在各濃度之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。當百里醌類似物ATQTHB濃度為400 μg/mL時，肺癌A549細胞增殖抑制作用強于300 μg/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；濃度在400～600 μg/mL時差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，ATQTHB最佳抑制細胞增殖濃度應為400 μg/mL，無顯著劑量依賴性，見圖1(目錄后)。

2.2 百里醌類似物ATQTHB具有抑制A549細胞增殖的作用：采用上述最適濃度400 μg/mL ATQTHB分別干預肺癌A549細胞和人正常肺上皮細胞BEAS-2B，結果表明，與A549細胞組相比，ATQTHB干預對A549細胞增殖具有顯著抑制作用(P<0.05)；而ATQTHB干預后，人正常肺上皮細胞BEAS-2B增殖具有下降趨勢，但與未干預組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖2(目錄后)。

2.3 流式檢測ATQTHB對A549細胞凋亡的影響：與A549組相比，A549+ATQTHB 400 μg/mL干預組的A549細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與BEAS-2B組相比，BEAS-2B+ATQTHB 400 μg/mL干預組的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3(目錄后)。

2.4 Western blot檢測細胞凋亡結果：與A549細胞組相比，A549細胞+ATQTHB 400 μg/mL干預組的抑制凋亡蛋白Bcl-2表達顯著減少(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax表達水平顯著增加(P<0.05)；與BEAS-2B細胞組相比，BEAS-2B+ATQTHB組兩種蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4(目錄后)。

3 討論

百里醌具有明顯的抗腫瘤效應，但因百里醌的半數(shù)抑制濃度(IC50)過高，成為其向藥品研發(fā)過程中的瓶頸，因此學者們把百里醌抗腫瘤的研究轉向了百里醌類似物[7]。本研究旨在評價百里醌類似物ATQTHB對肺癌細胞增殖的作用。研究發(fā)現(xiàn)ATQTHB能夠顯著抑制人肺癌A549細胞的增殖，最適濃度為4 00 μg/mL，并且呈現(xiàn)劑量的非依賴性。ATQTHB能夠抑制肺癌細胞的增殖，這與之前文獻中報道的百里醌類似物ATQTHB對乳腺癌具有較好的抑制作用的結果一致[8]。但是為何會出現(xiàn)劑量非依賴性、以及百里醌類似物的毒副作用等諸多問題尚不清楚，需要后續(xù)實驗支撐。

為了更好地分析ATQTHB的抑制增殖作用是針對肺癌細胞而非針對正常肺上皮細胞，本研究采用兩種細胞同時開展400 μg/mL ATQTHB干預實驗，發(fā)現(xiàn)ATQTHB能有效抑制肺癌細胞增殖，而對正常肺上皮細胞增殖沒有明顯抑制作用，提示ATQTHB如果用于治療肺癌，可能會在產生較小副作用的情況下發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。有研究表明，ATQTHB可明顯誘導人胰腺癌細胞系BxPC-3的凋亡[1]。也有文獻報道，百里醌能夠通過調控趨化因子和炎癥因子的釋放而發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。此外，百里醌有效成分能夠有效調節(jié)肺損傷的氧化應激[10]，而該抗氧化應激作用可能是基于Nrf-2途徑實現(xiàn)的[11]。本研究中涉及的具體機制仍需要在接下來的研究中闡明。為了進一步說明ATQTHB導致癌細胞增殖抑制的原因，本研究檢測了細胞凋亡率。結果表明，ATQTHB可通過促進A549細胞凋亡發(fā)揮抑制肺癌細胞增殖的作用，這與之前文獻中報道的百里醌對其他腫瘤的作用相類似[12-13]。研究表明，納米組成的百里醌活性成分對于胰腺癌細胞的增殖具有顯著抑制作用[12]。而另一項研究也發(fā)現(xiàn)，百里醌的衍生產物具有抗乳腺癌的作用[13]。

本研究檢測了凋亡相關分子Bcl-2和BAX，結果表明，ATQTHB能夠減少A549細胞抑制凋亡的Bcl-2、增加促凋亡的BAX的表達量，進一步表明ATQTHB可通過調控Bcl-2與BAX促進肺癌細胞凋亡，從而抑制肺癌細胞增殖。在一項針對SK-OV-3卵巢癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，百里醌活性成分能夠通過調節(jié)Bcl-2和Bax促進細胞的凋亡[14]。百里醌類似物能夠通過促進凋亡而抑制直腸癌細胞Caki-1的增殖，而其機制與JAK2/STAT3介導的Bcl-2和Bax調控有關[15]。本研究中涉及的凋亡具體相關分子通路機制，仍需要后續(xù)進一步研究去證實。