王 芹 李立恒 王鐘華 楊永超 馮建梅 胥愛文 安 峰 申葉春

（河北北方學院附屬第一醫(yī)院口腔科，張家口 075000）

牙髓血運重建技術(shù)通過徹底有效的根管消毒，盡量保護殘留牙髓組織、牙髓干細胞和根尖乳頭干細胞等，形成以血凝塊為主的再生支架并提供生長因子，最后進行嚴密的冠方封閉，為干細胞增殖和分化提供良好的環(huán)境，從而促使牙根繼續(xù)發(fā)育[1]。血管生成是從已有的毛細血管發(fā)展成新血管的過程。它是一個基本的生理過程，對胚胎發(fā)育、排卵和傷口修復至關重要，與關節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變和腫瘤生長等病理條件有關[2]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在血管生成中起著中心作用，促進新毛細血管的形成，對內(nèi)皮細胞增殖、遷移和存活至關重要[3]。在生理和病理條件下，VEGF的調(diào)節(jié)對許多組織的新生血管形成至關重要[3]。研究表明，VEGF在牙髓干細胞向內(nèi)皮細胞的分化中起著關鍵作用，可促進牙髓干細胞的存活，分化內(nèi)皮細胞的增殖和血管的出芽以及通透性[4]，但VEGF在牙髓血運重建后的表達及其分子機制仍不明確。為了更好地了解牙髓血運重建術(shù)后VEGF在根尖周組織中的表達規(guī)律，本研究擬通過建立大鼠磨牙牙髓血運重建術(shù)動物模型，觀察牙髓血運重建術(shù)對VEGF的影響。

1 材料和方法

1.1 動物模型建立

30只6 ～ 8 周齡健康的 SPF 級雌性 SD 大鼠，體重 （177.83±11.04） g，由廣東醫(yī)學動物實驗中心提供。將30只SD大鼠隨機編號分成實驗組、對照組及空白組，各組具體操作如下：

（1）實驗組：水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，牙科顯微鏡下對術(shù)區(qū)消毒和清理（圖1A）。利用無菌手術(shù)器械將第一磨牙開髓，沿近遠中方向去髓，生理鹽水和1.25%NaClO交替沖根管內(nèi)洗殘留牙髓組織，用針損傷根尖刺激出血（圖1B），用生理鹽水棉簽止血，待其凝固后使用三氧化物多聚體（MTA）覆蓋血凝塊面，以流動樹脂進行填充（圖1C）。（2）對照組：將下頜第一磨牙開髓，牙髓腔直接開放于口腔環(huán)境3周形成根尖周炎。（3）空白組：大鼠牙齒不做任何處理。

圖1 牙科顯微鏡下磨牙牙髓血運重建動物模型建立

術(shù)后每日觀察下頜第一磨牙填充物情況，如若脫落則需重新進行牙髓血運重建。

1.2 標本采集

在牙髓血運重建術(shù)后3周麻醉處死大鼠，剝離下頜第一磨牙及其周圍組織，一部分用100%甲醇或4%多聚甲醛在4℃下固定24 h，經(jīng)脫鈣、脫水、透明、浸蠟后包埋；另一部分組織置于液氮中保存。

1.3 HE染色

包埋的石蠟標本沿著牙齒頰舌面做連續(xù)切片（厚度為5 μm），經(jīng)脫蠟復水后用蘇木精-伊紅進行HE染色，光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.4 VEGF基因表達檢測

將置于液氮中的磨牙組織研磨至粉末狀后，使用Trizol試劑（Invitrogen，美國）按照說明書提取總RNA。采用iScript-cDNA合成試劑盒（Bio-Rad，美國）合成cDNA。用SYBR-Green PCR試劑盒（Bio-Rad公司）進行實時熒光定量PCR擴增反應，并使用CFX-96快速實時PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）進行檢測大鼠源性VEGF基因的表達，引物序列見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)熔融曲線分析驗證。使用2-ΔΔct方法，通過管家基因Actin-β值計算靶基因的相對表達水平。

表1 RT-PCR引物序列信息

1.5 VEGF免疫組化染色

石蠟切片放置在載玻片上，在60℃培養(yǎng)箱中過夜，在二甲苯中脫蠟并通過分級醇（100%，95%，75%）再水化。將抗大鼠VEGF一抗（Cell Signaling Technology ，美國）以1∶100稀釋后滴加在組織切片上孵育，4℃過夜。孵育完畢后TBST洗去一抗，用過氧化物酶偶聯(lián)二抗在室溫下避光孵育1 h后與3， 3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物-染色原反應孵育2 min。孵育好的切片用蘇木精復染3 min，通過分級醇脫水。最后在切片上滴加中性樹脂，用蓋玻片封片，應用光學顯微鏡觀察組織中VEGF蛋白的表達。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用±s表示，實驗樣本間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

實驗期間動物進食、活動情況良好，未觀察到實驗磨牙牙體斷裂或填充物脫落。

2.1 HE染色結(jié)果

術(shù)后3周的HE染色結(jié)果顯示：空白組的牙髓為松散的結(jié)締組織，內(nèi)含血管、纖維等其他細胞外基質(zhì)，膠原纖維有序排列，根尖孔未完全閉合，呈開放狀。對照組壞死的牙髓組織充滿整個組織髓腔和根管，根管內(nèi)有明顯的炎癥細胞浸潤，根管內(nèi)未見新生組織形成。與對照組相比，進行了牙髓血運重建術(shù)的實驗組大鼠磨牙根管內(nèi)未見明顯炎癥細胞浸潤，根管內(nèi)長滿新生組織，內(nèi)含血管樣結(jié)構(gòu)，組織結(jié)構(gòu)上更接近正常牙髓結(jié)構(gòu)，見圖2。

圖2 3組大鼠下頜第一磨牙HE染色（100×）

2.2 VEGF基因表達水平結(jié)果

如圖3所示，在3組大鼠磨牙組織樣本中觀察到，VEGFmRNA在牙髓血運重建術(shù)后中的表達水平顯著提高（P＜0.01），而VEGFmRNA在對照組中的表達水平下調(diào)明顯（P＜0.01）。

圖3 各組VEGF的基因表達情況

2.3 VEGF免疫組化染色結(jié)果

石蠟切片VEGF免疫組化染色顯示：部分細胞呈褐色（如圖4），VEGF在空白組、實驗組、對照組中均呈有表達，與空白組和對照組相比， 實驗組牙髓組織內(nèi)腔周圍觀察到一些VEGF強陽性細胞，表明新生血管形成；與空白組相比，對照組中VEGF陽性較弱。按VEGF陽性率從高到低的排序是實驗組＞空白組＞對照 組。

圖4 3組大鼠下頜第一磨牙VEGF免疫組化染色（200×）

3 討論

顯微牙髓血運重建術(shù)是用于治療年輕恒牙牙髓壞死的方法。通過在顯微數(shù)字技術(shù)下操作，徹底有效地根管消毒后，盡量地保護牙髓干細胞、牙乳頭間充質(zhì)細胞和牙周韌帶干細胞。然后利用根管內(nèi)血凝塊，提供良好的干細胞增殖和分化微環(huán)境，達到促進牙根繼續(xù)發(fā)育的目的[5]。牙髓血運重建的種子細胞來源主要為牙髓干細胞、根尖乳頭干細胞、牙周膜干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞[6]。這些干細胞在信號分子、蓋髓劑MTA等誘導下?lián)碛胁煌姆只瘽撃?，可以形成牙髓、牙本質(zhì)和牙周韌帶[7]。Stambolsky等人發(fā)現(xiàn)對犬類進行牙髓血運重建術(shù)后，未成熟犬齒牙髓顯示出血管再生[8]。成牙本質(zhì)細胞是高度分化的細胞，能產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)，為此，持續(xù)需要大量的氧氣和營養(yǎng)，因而牙髓細胞對血管破裂導致的血液供應中斷反應靈敏，從而導致細胞壞死[9-10]。

在本研究中，對照組大鼠磨牙經(jīng)過開髓暴露牙髓后，石蠟切片HE染色發(fā)現(xiàn)髓腔內(nèi)產(chǎn)生大量壞死細胞以及根尖周出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，而進行了牙髓血運重建術(shù)的實驗組大鼠則可看到根管內(nèi)有豐富的血管新生，未見明顯炎癥細胞浸潤，在組織結(jié)構(gòu)上更接近正常牙髓結(jié)構(gòu)，表明牙髓血運重建術(shù)促進了牙髓內(nèi)血管的新生并且減少了炎癥細胞的浸潤。牙髓血運重建術(shù)后3周的RT-PCR結(jié)果顯示：大鼠磨牙組織中VEGF基因表達水平顯著提高，磨牙組織免疫組化染色結(jié)果也證明牙髓腔內(nèi)出現(xiàn)了比空白組和對照組更大量的VEGF陽性細胞，證實了血管的新生。VEGF可促進牙髓內(nèi)血管生成，增加牙髓內(nèi)微血管密度。VEGF可能是在牙髓組織破壞時產(chǎn)生的缺氧條件下分泌的[11-12]。眾所周知，缺氧刺激的HIF-1α是VEGF的有效轉(zhuǎn)錄因子[13]。VEGF可能在牙髓血運重建術(shù)后被牙髓干細胞誘導分泌，從而觸發(fā)局部牙髓血管生成[14]。

4 結(jié)論

本文初步證明，牙髓血運重建術(shù)可顯著促進大鼠磨牙中VEGF的表達，從而促進牙髓中血管的生成和牙髓組織的修復，由此提示：VEGF在臨床牙髓壞死和根尖周炎治療中具有潛在的應用價 值。