田英姿，胡飛雪，王文博，莊文會，杜思鴻，劉思瑤，陳朋杰，趙培源

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

失眠主要表現(xiàn)為入睡困難和/或睡眠維持障礙，對日間功能有顯著影響，可導(dǎo)致情緒異常、注意力分散和認(rèn)知功能障礙，影響人們的日常生活[1]，有失眠癥狀者占中國成年人群的57%左右[2]。目前治療失眠的藥物以鎮(zhèn)靜催眠類藥物為主[3]，但長期服用會出現(xiàn)后遺效應(yīng)和藥物依賴甚至成癮[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些天然植物提取物具有鎮(zhèn)靜和催眠作用，如薰衣草精油中的芳樟醇能通過抑制大腦皮層中的谷氨酸（glutamic acid, Glu）受體介導(dǎo)的突觸后興奮而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜和潛在的神經(jīng)保護作用[5]，提示芳香植物揮發(fā)性化合物在改善睡眠方面具有潛在優(yōu)勢。蛇麻草是一種多年生草本植物，又稱啤酒花。據(jù)《新疆中草藥手冊》記載，蛇麻草有鎮(zhèn)靜安神、清煩助眠的功效。蛇麻草精油中成分豐富，含有多種單萜和倍半萜烯化合物，如β-月桂烯、α-葎草烯、β-石竹烯等，具有鎮(zhèn)靜、助眠、抗炎、抗氧化等生物學(xué)活性[6]，但具體機制有待探索。本研究擬采用香薰法觀察蛇麻草精油對失眠模型大鼠的助眠作用，并探討其潛在的作用機制，為未來開發(fā)助眠的補充和輔助療法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級 S D 大鼠共 7 2 只，6～8 周齡，體重 2 60～290 g，雌雄各半，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20190003；使用許可證號：SYXK（豫）2021-0015]。實驗大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，12 h 晝夜交替，室溫22～26℃，濕度40%～60%，大鼠自由攝食、飲水。所有動物實驗經(jīng)動物福利國際合作委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

對氯苯丙氨酸（PCPA）[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號：A190846]，戊巴比妥鈉[國藥集團化學(xué)試劑（北京）有限公司，批號：TP20160910]，蛇麻草精油（廣州慧怡生物科技有限公司），薰衣草精油[芙輝（天津）電子商務(wù)有限公司]，大鼠褪黑素（Melatonin, MT）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、大鼠γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）ELISA試劑盒、大鼠Glu ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公 司 ，貨 號 ：MM-0657R1、MM-0441R1、MM-0601R1），磷酸二氫鈉[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號：C2027088]，EDTA（北京索萊寶科技有限公司，批號：108J063），氯化鉀（美國AMRESCO 公司，批號：1206B06），1-辛烷磺酸鈉98%[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號：20190103024]，檸檬酸鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號：16493-1996），磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20190107），甲醇（天津市四友精細(xì)化學(xué)藥品有限公司，批號：632352-64487），pH 校準(zhǔn)液（上海研衡儀器有限公司，批號：9027-2007），高氯酸（西隴化工股份有限公司）。低溫離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器公司，型號：D1524R），曠場裝置（江蘇賽昂斯生物科技有限公司，型號：SA215.1），香薰燈（溫州超派電子商務(wù)有限公司，貨號：GX1168），自制香薰箱、多功能酶標(biāo)儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號：iMark]，高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：Vanquish Flex]。

1.3 實驗方法

本實驗流程如圖1 所示。

圖1 實驗流程圖

1.3.1 失眠模型的復(fù)制及分組 大鼠腹腔注射PCPA 懸濁液（300 mg/kg）復(fù)制失眠模型，連續(xù)4 d誘導(dǎo)失眠模型[7]。將PCPA 溶于含少量聚山梨酯的弱堿性溶液中，超聲5 h，使PCPA 懸濁液更易注射。觀察到大鼠失去正常晝夜節(jié)律，明顯暴躁，毛色枯燥、黯淡無光澤，提示模型復(fù)制成功。共復(fù)制失眠模型大鼠63 只，死亡3 只，成功60 只，隨機分為模型組、薰衣草精油組、蛇麻草精油低濃度組、蛇麻草精油中濃度組及蛇麻草精油高濃度組，每組12 只，雌雄各半，分別進行1～12 編號。另取12 只大鼠作為空白組，注射等量含少量聚山梨酯的弱堿性溶液。

1.3.2 治療方法 各組大鼠在自制香薰箱中進行香薰。自制香薰箱為1個長60 cm×寬60 cm×高40 cm 的2層箱體，每層9 格，格與外界、格與格之間通風(fēng)，如圖2 所示。薰衣草精油組與蛇麻草精油組進行香薰處理，香薰時精油香薰燈置于中間格子里，每個大鼠放在1個格子中，薰衣草精油組以0.20%濃度香薰，蛇麻草精油組分別以0.05%、0.10%、0.20%濃度香薰；模型組和空白組熏蒸餾水。每天8 h，連續(xù)5 d。實驗每天8:00～16:00 進行，周圍安靜，光線暗，溫度（22±1）℃。觀察動物模型復(fù)制和給藥前后毛色光澤、睡眠與精神狀態(tài)及飲食等變化并進行記錄。

圖2 自制香薰箱示意圖

1.3.3 大鼠行為學(xué)評價 戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實驗的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)期：實驗第9 天香薰結(jié)束后1 h，大鼠以40 mg/kg 給藥濃度腹腔注射戊巴比妥鈉溶液，根據(jù)翻正反射消失30 s 以上與否記錄睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)期的時間，以觀察到的蛇麻草精油最佳有效濃度（高濃度0.20%）進行后續(xù)實驗。曠場實驗評價大鼠精神狀態(tài)：實驗第10 天，在長100 cm×寬100 cm×高40 cm 的曠場中進行實驗，開始時將大鼠放至中間位置，使用ANY-maze軟件自動追蹤大鼠在曠場中的表現(xiàn)，記錄其3 min內(nèi)的行為，參數(shù)包括活動距離、穿格次數(shù)、理毛次數(shù)及站立次數(shù)，評價其精神狀態(tài)。每只動物實驗結(jié)束后用75%的酒精消毒。

1.3.4 標(biāo)本采集 實驗第10 天，大鼠稱重后注射相應(yīng)劑量的戊巴比妥鈉麻醉。血清收集：腹主動脈取血，靜置2 h 后于低溫離心機中以3 000 r/min離心15 min，將血清分離出置于4°C 冰箱內(nèi)保存。下丘腦采集：取腦，冰上分離大鼠下丘腦，以液氮迅速冷卻后，-80℃保存。松果體采集：開胸暴露心臟將灌注針頭插入心尖，剪開右心耳以開放靜脈血，夾閉腹主動脈后先灌注約100 mL 生理鹽水，在大鼠前肢及肺變白時停止灌注生理鹽水開始灌注多聚甲醛，腦組織白而硬時即表示灌注成功。取出腦組織的松果體用4%多聚甲醛溶液固定。

1.3.5 ELISA 檢測血清MT、GABA、Glu 含量 取大鼠血清，采用ELISA 法檢測各組大鼠血清中MT、GABA、Glu 含量，實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.3.6 高效液相色譜儀測定下丘腦中多巴胺（DA）、去加腎上腺（NE）、五羥色胺（5-HT）含量 取大鼠下丘腦，按照1 g∶10 mL 的比例向組織中加入預(yù)冷4℃的0.4 mol/L 高氯酸，勻漿后低溫離心（14 000 r/min，15 min，4℃），取上清液，用0.22 μm 濾膜過濾樣品后，高效液相色譜法檢測DA、NE、5-HT 含量。色譜條件：色譜柱為C18（2.1 mm×100 mm，3 μm），流動相A 為磷酸二氫鈉100 mmol/L，檸檬酸鈉50 mmol/L，EDTA 50 μmol/L，辛烷磺酸鈉1.7 mmol/L，氯化鉀2 mmol/L，流動相B 為甲醇，A∶B=95∶5，設(shè)定流動相流速0.3 mL/min，柱溫25℃，電化學(xué)檢測器應(yīng)用玻碳工作電極，工作電壓520 mV，增益為100 nV，進樣溫度4℃，進樣量20 μL。

1.3.7 松果體HE 染色 取大鼠松果體，常規(guī)脫水、包埋、切片、HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠松果體組織病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)

PCPA 注射第2 天，與空白組比較，模型組大鼠表現(xiàn)出亢奮，活動增加，暴躁，飲食減少，飲水量明顯增加。注射第4 天，大鼠失去正常晝夜節(jié)律，明顯暴躁，毛色枯燥、黯淡無光澤，提示模型復(fù)制成功。連續(xù)5 d 每天8 h 香薰處理后，與模型組比較，薰衣草精油組和蛇麻草精油高濃度組大鼠精神狀態(tài)平和，暴躁情況改善，飲食飲水趨于正常。

2.2 各組大鼠行為學(xué)比較

2.2.1 戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠效果 香薰后6 組大鼠睡眠潛伏期、睡眠持續(xù)期比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，模型組大鼠睡眠潛伏期較空白組延長（P＜0.05），睡眠持續(xù)期較空白組縮短（P＜0.05）；薰衣草精油組大鼠與蛇麻草精油高濃度組大鼠睡眠潛伏期較模型組縮短（P＜0.05），睡眠持續(xù)期較模型組延長（P＜0.05）；蛇麻草精油低濃度組睡眠潛伏期與睡眠持續(xù)期與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；蛇麻草精油中濃度組睡眠潛伏期與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而睡眠持續(xù)時間與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；蛇麻草精油高濃度組睡眠潛伏期與薰衣草精油組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而睡眠持續(xù)期延長（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠睡眠潛伏時間和持續(xù)時間比較（n=8，）

表1 各組大鼠睡眠潛伏時間和持續(xù)時間比較（n=8，）

注 ：①與空白組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與薰衣草精油組比較，P ＜0.05。

睡眠持續(xù)時間/h 5.24±1.21 1.97±1.34①4.97±0.31②2.04±0.66 4.21±0.47②5.18±1.07②③41.935 0.000組別空白組模型組薰衣草精油組蛇麻草精油低濃度組蛇麻草精油中濃度組蛇麻草精油高濃度組F 值P 值睡眠潛伏時間/min 4.89±0.42 6.13±0.37①4.91±0.93②6.14±1.31 5.97±1.19 4.94±0.27②8.295 0.000

2.2.2 曠場實驗結(jié)果 空白組、模型組、薰衣草精油組及蛇麻草高濃度組大鼠活動距離、穿格次數(shù)、理毛次數(shù)、站立次數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，模型組大鼠活動距離、穿格次數(shù)、理毛次數(shù)及站立次數(shù)較空白組縮短或減少（P＜0.05）；薰衣草精油組和蛇麻草精油高濃度組大鼠活動距離、穿格次數(shù)、理毛次數(shù)及站立次數(shù)較模型組增加（P＜0.05）；蛇麻草精油高濃度組與薰衣草精油組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠自發(fā)性活動行為和探索行為比較 （n=8，）

表2 各組大鼠自發(fā)性活動行為和探索行為比較 （n=8，）

注 ：①與空白組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別空白組模型組薰衣草精油組蛇麻草精油高濃度組F 值P 值站立次數(shù)28.53±9.16 7.68±7.44①21.46±10.05②17.98±5.36②14.244 0.000活動距離/cm 17.70±3.05 8.18±5.31①12.23±2.64②13.40± 2.44②11.967 0.000穿格次數(shù)131.00±18.36 66.17±36.46①97.33±16.62②103.50±21.89②11.347 0.000理毛次數(shù)26.50±7.26 8.00±6.60①17.56±5.88②14.62±2.83②9.936 0.000

2.3 各組大鼠血清MT、GABA、Glu 含量及Glu/GABA的比較

空白組、模型組、薰衣草精油組及蛇麻草精油高濃度組大鼠血清MT、GABA、Glu 含量及Glu/GABA 的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，模型組大鼠血清MT、GABA 含量較空白組減少（P＜0.05），Glu 含量較空白組增多（P＜0.05），Glu/GABA 較空白組升高（P＜0.05）；薰衣草精油組和蛇麻草精油高濃度組大鼠血清 MT、GABA 含量較模型組均增多（P＜0.05），Glu 含量較模型組均減少（P＜0.05），Glu/GABA 較模型組降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清MT、GABA、Glu含量及Glu/GABA的比較 （n=8，）

表3 各組大鼠血清MT、GABA、Glu含量及Glu/GABA的比較 （n=8，）

注 ：①與空白組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別空白組模型組薰衣草精油組蛇麻草精油高濃度組F 值P 值Glu/GABA 6.94±0.90 14.59±2.69①9.13±1.08②8.62±2.41②11.689 0.001 MT/（μmol/L）56.72±5.06 44.07±3.33①67.29±5.62②67.88±4.16②35.254 0.000 GABA/（μmol/L）5.09±0.60 3.37±0.51①4.32±0.56②3.97±0.59②5.388 0.014 Glu/（μmol/L）35.30±6.28 48.18±6.28①39.07±3.46②42.42±6.82②7.236 0.005

2.4 各組大鼠下丘腦中DA、NE、5-HT含量比較

空白組、模型組、薰衣草精油組及蛇麻草精油高濃度組大鼠下丘腦中DA、NE、5-HT 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，模型組大鼠下丘腦中5-HT 含量較空白組減少（P＜0.05），NE 和 DA 含量較空白組增多（P＜0.05）；薰衣草精油組和蛇麻草精油高濃度組大鼠下丘腦中5-HT 含量較模型組均增多（P＜0.05），NE 和 DA 含量較模型組減少（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠下丘腦中DA、5-HT、NE含量的比較（n=8，μmol/L，）

表4 各組大鼠下丘腦中DA、5-HT、NE含量的比較（n=8，μmol/L，）

注 ：①與空白組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別空白組模型組薰衣草精油組蛇麻草精油高濃度組F 值P 值DA 2.46±0.27 3.91±0.23①2.53±0.14②2.50±0.12②5-HT 4.39±0.12 3.25±0.13①4.26±0.11②4.34±0.12②NE 55.51±5.67 61.23±5.14①57.24±8.43②55.95±6.79②6.001 0.010 64.426 0.000 108.862 0.000

2.5 各組大鼠松果體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的比較

光學(xué)顯微鏡下，空白組松果體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞清晰均勻、排列規(guī)則緊密；模型組松果體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞排列分散雜亂、邊界模糊，數(shù)目減少且有大量空泡樣變性存在，細(xì)胞核縮小且位置異常；與模型組比較，薰衣草精油組與蛇麻草精油高濃度組細(xì)胞數(shù)目明顯恢復(fù)，空泡樣變性減少。見圖3。

圖3 各組大鼠松果體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài) （HE染色×400）

3 討論

芳香植物精油通過香薰法進入鼻腔后，一方面可通過鼻黏膜進入嗅覺傳導(dǎo)通路，形成神經(jīng)沖動，沿嗅神經(jīng)傳導(dǎo)至相應(yīng)的腦區(qū)產(chǎn)生活化作用，另一方面可進入肺部參與血液循環(huán)發(fā)揮作用[8-9]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為芳香之品“能順氣，安神定志，合五臟”，調(diào)暢氣機，入心經(jīng)，可鎮(zhèn)靜安神、助眠除煩。本研究采用蛇麻草精油香薰法干預(yù)失眠大鼠，發(fā)現(xiàn)能改善其睡眠狀態(tài)，提高自主活動能力，顯示出蛇麻草精油潛在的治療優(yōu)勢。

PCPA 是一種色氨酸羥化酶抑制劑，通過抑制5-HT 誘導(dǎo)失眠。腹腔注射PCPA 后，大鼠睡眠潛伏期延長，睡眠持續(xù)期縮短，睡眠、覺醒周期紊亂，與前期文獻(xiàn)報道[10]一致，表明模型復(fù)制成功；0.2%蛇麻草精油香薰干預(yù)后，大鼠一般狀態(tài)明顯改善，毛色潤澤，睡眠潛伏期縮短，睡眠持續(xù)期延長，表明蛇麻草精油香薰可改善失眠大鼠的睡眠狀況。曠場實驗常用于觀察大鼠在新環(huán)境中的自主行為、活躍度和緊張度以評價大鼠焦慮抑郁心理以及精神狀態(tài)，其中水平運動和垂直運動可以分別反映大鼠的探究能力及興奮性、空間認(rèn)知能力及警覺性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的運動距離、穿格次數(shù)、理毛次數(shù)和站立次數(shù)均降低，即水平運動與垂直運動均減少，由此可知，模型組大鼠情緒緊張，自主活動受限、警覺性較高，而經(jīng)0.2%蛇麻草精油香薰后大鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)、自主行為活動恢復(fù)，水平運動與垂直運動增加，警覺性降低。

MT是松果體分泌的由交感神經(jīng)支配的胺類激素。MT 分泌量常隨晝夜節(jié)律波動，直接影響睡眠質(zhì)量和節(jié)律，分泌水平下降可導(dǎo)致睡眠質(zhì)量下降、節(jié)律紊亂、內(nèi)分泌紊亂和神經(jīng)功能障礙[12]。PCPA 能造成松果體細(xì)胞損傷[13]，影響MT的水平[14]，導(dǎo)致晝夜節(jié)律失調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清MT水平下調(diào)，松果體細(xì)胞排列紊亂、數(shù)目減少，而0.2%蛇麻草精油香薰后MT水平上調(diào)，松果體內(nèi)細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞邊界相對清晰，推測蛇麻草精油可以改善松果體結(jié)構(gòu)損傷，調(diào)節(jié)MT的分泌，改善大鼠的睡眠。

研究表明，MT 調(diào)節(jié)睡眠的作用與Glu 和GABA水平密切相關(guān)[15]。Glu 和GABA 廣泛參與睡眠機制調(diào)節(jié)，在興奮、抑制調(diào)節(jié)過程中起重要作用。Glu 是大腦神經(jīng)元突觸體內(nèi)的興奮性遞質(zhì)，GABA 為抑制性遞質(zhì)；Glu 含量增加則神經(jīng)元激活進而促使機體覺醒[16]；GABA 含量增加則抑制神經(jīng)元興奮從而促進睡眠[17]。MT 與其受體結(jié)合后能識別GABA 受體，通過增加氯離子內(nèi)流激活GABA 受體，從而上調(diào)GABA 表達(dá)水平。Glu/GABA 比值常用來評價中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能興奮和抑制狀態(tài)[18]。ELISA 法檢測血清GABA、Glu 的含量發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清GABA 含量下降，Glu 含量和Glu/GABA 比值升高，經(jīng)蛇麻草精油香薰后，以上指標(biāo)的變化均有不同程度逆轉(zhuǎn)。推測蛇麻草精油香薰法可能通過調(diào)節(jié)GABA、Glu 含量及兩者比值來調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)興奮性，改善睡眠。

5-HT 是具有抑制作用的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[19]，MT 與位于視交叉上核細(xì)胞膜上的高親和性G蛋白偶聯(lián)受體特異性結(jié)合可促使機體內(nèi)5-HT 含量增加[20]，導(dǎo)致覺醒時間縮短，影響睡眠、覺醒周期。NE 和DA 是具有興奮作用的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[21-22]。其中DA 能通過一系列催化反應(yīng)生成NE[23]。高水平的NE 對中樞系統(tǒng)具有興奮作用，使大腦處于異常興奮狀態(tài)，進而延長覺醒時間、縮短睡眠時間[24]。5-HT 和NE 維持了一種此消彼長的對立統(tǒng)一關(guān)系，共同調(diào)節(jié)機體的睡眠、覺醒周期。機體腦內(nèi)5-HT濃度升高時，NE 濃度相對降低，機體進入睡眠狀態(tài)，而NE 濃度升高時抑制5-HT 的釋放，機體進入覺醒狀態(tài)[25]。高效液相色譜儀測定各組大鼠下丘腦中NE、DA、5-HT 的含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蛇麻草精油香薰后，5-HT 含量增加，NE 和DA 含量減少，推測蛇麻草精油香薰法改善睡眠的作用可能與下調(diào)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)、上調(diào)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。

綜上所述，蛇麻草精油香薰法能改善失眠大鼠的入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間，其機制可能可能與改善松果體結(jié)構(gòu)，促進MT、抑制性遞質(zhì)GABA 及5-HT 的分泌，以及抑制興奮性遞質(zhì)Glu、NE、DA 的分泌有關(guān)。本實驗結(jié)果為蛇麻草精油香薰作為鎮(zhèn)靜助眠的輔助治療提供了理論依據(jù)。