王因花，孔雨光，李慶華，吳德軍，燕麗萍，許 濤，魯儀增，翟國鋒

（1山東省林業(yè)科學(xué)研究院/山東省林木遺傳改良重點實驗室，濟南 250014；2山東省國土空間規(guī)劃院，濟南 250014；3濟南市園林和林業(yè)科學(xué)研究院，濟南 250000；4山東省林草種質(zhì)資源中心，濟南 250014；5淄博市魯山林場，山東淄博 256100）

0 引言

紫椴(Tilia amurensis)為椴樹科、椴樹屬的落葉喬木，東北地區(qū)主要的造林樹種，集觀賞、用材、經(jīng)濟、食用、藥用等多種價值于一體，尤以質(zhì)量優(yōu)良的椴樹蜜著稱。目前，紫椴資源日益減少，已被列入國家二級保護植物[1]。多年來，濫砍亂伐導(dǎo)致紫椴種群的數(shù)量大大下降，加之紫椴種子具有深休眠的特性，僅依靠其自身自然繁殖難以滿足保護這一珍貴樹種的需要。因此，探明紫椴種子休眠原因并找到打破休眠的方法對于保護紫椴這一珍貴資源顯得尤為重要。

休眠是椴樹屬植物種子的共性[2]。對于椴樹屬植物種子休眠的原因，學(xué)者們很早就展開了研究，鄒學(xué)忠等[3]認為紫椴種皮結(jié)構(gòu)致密，透水透氣性差，種皮、胚乳均含有發(fā)芽抑制物質(zhì)是導(dǎo)致紫椴種子休眠的主要原因，這與王海南[4]的觀點較為一致；劉艷秋[5]通過對紫椴種子解剖構(gòu)造的觀察及對種皮透性和種子內(nèi)發(fā)芽抑制物的測定，認為發(fā)芽抑制物是引起紫椴種子休眠的主要因素；尹黎燕等[6]則認為椴樹種子的休眠是多種因素造成的，除堅硬的種皮和發(fā)芽抑制物質(zhì)外，種子本身也存在生理后熟；也有學(xué)者認為紫椴種皮的致密性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了紫椴種子的休眠[7]。史鋒厚等[8]通過對南京椴種子休眠機理的研究，認為胚乳是造成南京椴種子休眠的關(guān)鍵因素，但其作用機理如何尚需更深入的研究；歐洲銀葉椴的果皮、種皮存在嚴(yán)重的透性障礙，種子各部分都存在大量的抑制物質(zhì)導(dǎo)致了其深度休眠[9]；王九齡等[10]通過對紫椴的種皮構(gòu)造、生理后熟、發(fā)芽抑制物等方面的研究認為，紫椴種子的休眠是由綜合因素造成的，抑制物質(zhì)的存在是其中一個重要原因。

本研究在已有研究的基礎(chǔ)上，對紫椴種子的萌發(fā)特性進行了探討，并以此為依據(jù)進行了休眠解除方法的研究，以期能為加快紫椴種苗繁育提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用紫椴種子采自山東省濟南市泉城公園。去掉果皮及雜物，取其干凈種子為實驗材料，千粒重為44.3g。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子透性研究 取未經(jīng)處理的種子（以下簡稱對照種子）和經(jīng)濃H2SO4處理5分鐘的種子各100粒，稱重后放入燒杯中，在25℃的恒溫條件下進行吸脹實驗，每隔12 h取出一次，吸干表面水分后進行稱重，直至種子恒重飽和為止，計算各自的吸水率，每個處理3次重復(fù)。吸水率的計算見公式(1)。

1.2.2 種子萌發(fā)特性探究 將紫椴種子進行不同程度的剝除處理后進行發(fā)芽試驗，每處理取50粒種子，重復(fù)3次。具體剝除部位見表1。

表1 紫椴種子萌發(fā)特性試驗設(shè)計

1.2.3 種子休眠解除方法的研究 采用隨機區(qū)組實驗設(shè)計，分別采用濃H2SO4處理+低溫層積、GA3處理+低溫層積、濃H2SO4處理+GA3處理+低溫層積的方法，進行紫椴種子休眠解除方法的探討，以未經(jīng)處理的種子為對照，低溫層積前具體的種子預(yù)處理方法見表2。預(yù)處理后，隨即在0～5℃的條件下對種子進行低溫混沙層積；種子發(fā)芽測定溫度皆為25℃，光照8 h。

表2 紫椴種子休眠解除方法試驗設(shè)計

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 23.0進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 種皮透性探究

對照種子及經(jīng)過濃H2SO4處理的種子吸水情況見圖1。由圖1可以看出，無論是對照種子還是酸蝕處理的種子，前12 h都是其快速吸水期，12 h以后兩者的吸水率增加幅度都趨于平緩。但由圖1中可以看出，酸蝕種子的吸水率明顯高于對照，浸泡12 h時，酸蝕種子吸水率為59.7%，而對照種子的吸水率僅為14.9%，至吸水飽和，酸蝕種子吸水率為73.0%，對照種子吸水率為20.3%。方差分析表明，兩者差異達極顯著水平(P<0.01)（方差分析表略）。

圖1 紫椴種子吸水曲線

2.2 紫椴種子萌發(fā)特性探究

2.2.1 紫椴完整種子萌發(fā)情況 將紫椴完整種子置于脫脂棉上進行培養(yǎng)，30天內(nèi)紫椴種子萌發(fā)率為0，說明紫椴種子存在休眠，不加處理很難萌發(fā)（見圖2）。

圖2 完整種子萌發(fā)情況

2.2.2 帶完整胚乳種子萌發(fā)情況 將紫椴種皮剝?nèi)?，保留完整胚乳，置于脫脂棉床觀察其萌發(fā)情況。結(jié)果表明，去掉種皮以后紫椴種子的萌發(fā)率依然很低。第1周未見有種子萌發(fā)，第2周有4%的種子萌發(fā)，至第30天發(fā)芽實驗結(jié)束，發(fā)芽率未再增長。說明去掉種皮以后，紫椴種子仍不能順利萌發(fā)，由此可以看出，種皮并不是制約紫椴種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素，胚乳對種子的萌發(fā)可能有很大的制約作用（見圖3）。

圖3 全胚乳種子萌發(fā)情況

2.2.3 剝除部分胚乳（根尖未露出）的紫椴種子萌發(fā)情況 去掉種皮，隨機切除部分胚乳（遠離根尖端），置于脫脂棉床進行培養(yǎng)。置床培養(yǎng)第1周，有6%的種子萌發(fā)出幼根，第2周共有20%的種子萌發(fā)，幼根呈現(xiàn)出明顯的伸長生長，且有白色根毛生出；第3周開始有部分萌發(fā)出幼根的種子子葉突破胚乳展開，至第4周發(fā)芽實驗結(jié)束，紫椴種子的萌發(fā)率為23.3%（見圖4）。

圖4 去掉部分胚乳的種子萌發(fā)情況

2.2.4 露出根尖的紫椴種子萌發(fā)情況 去掉紫椴種皮，并小心剝除包被根尖部分的胚乳（胚乳帽），露出根尖，置于脫脂棉床進行培養(yǎng)。培養(yǎng)第1周種子變化不大，第2周即有42%的種子胚根出現(xiàn)伸長生長，并有部分種子長出白色根毛，第3周已有64%的種子萌發(fā)出幼根，但僅有18%的種子子葉突破胚乳而展開，至第4周實驗結(jié)束，有84.7%的種子萌發(fā)出幼根，但其中僅有26%的種子子葉可以突破胚乳，子葉未突破胚乳的種子，其幼根的伸長生長也較差（見圖5）。

圖5 露出根尖的種子萌發(fā)情況

2.2.5 紫椴離體胚萌發(fā)情況 去掉紫椴種子的種皮和全部胚乳，將完整的離體胚取出置于脫脂棉床進行培養(yǎng)。結(jié)果表明，紫椴離體胚萌發(fā)迅速，置床第2天即可見胚根及下胚軸有明顯的伸長及彎曲生長，第1周即可見子葉變綠，第2周幼根變?yōu)榧t色并有白色根毛出現(xiàn)，至第3周，各離體胚已生長成為健壯完整的幼苗，紫椴離體胚萌發(fā)率達100%，由此可見紫椴的種胚本身并不存在休眠（見圖6）。

圖6 離體胚萌發(fā)情況

對各處理下紫椴種子的發(fā)芽率進行方差分析及多重比較，結(jié)果表明（見表3）。各處理的發(fā)芽率差異達到了極顯著水平（P<0.01，方差分析表略）。由此可見，不同的胚乳切除方式對紫椴種子發(fā)芽率的影響很大，胚乳在紫椴種子的休眠中起到了關(guān)鍵作用。

表3 不同處理方式下紫椴種子發(fā)芽率多重比較

2.3 種子休眠解除方法的研究

2.3.1 單獨使用濃H2SO4處理對紫椴種子萌發(fā)的影響將紫椴種子用濃H2SO4分別處理5、10、15 min后進行低溫層積，30天后取出做發(fā)芽實驗，結(jié)果見表4。由表4中結(jié)果可以看出，單獨使用濃硫酸處理在短時間內(nèi)并不能解除紫椴種子的休眠，層積30天紫椴種子發(fā)芽率最高僅有14.3%。

表4 濃H2SO4處理時間和GA3濃度對紫椴種子發(fā)芽率的影響

2.3.2 單獨使用GA3處理對紫椴種子萌發(fā)的影響 分別用200、500、800 mg/L的GA3溶液浸泡紫椴種子12 h，而后再對種子進行低溫層積處理，30天后取出做發(fā)芽實驗，結(jié)果見表4。可以看出，單獨使用GA3處理對促進種子萌發(fā)的作用較小，層積第30天發(fā)芽率僅有3.0%左右，各濃度對種子萌發(fā)的影響差異不顯著，說明單獨使用GA3并不能解除紫椴種子的休眠。

2.3.3 綜合處理對紫椴種子萌發(fā)的影響 為快速解除紫椴種子的休眠，在短時間內(nèi)獲得理想的發(fā)芽率并提高出苗整齊度，對紫椴種子采取了綜合處理措施，即濃H2SO4處理+GA3處理+低溫層積。種子經(jīng)綜合處理后，僅經(jīng)過10天的低溫層積，11號處理和14號處理的種子裂口率便達到了59.3%和64.3%，并且有部分種子已經(jīng)萌發(fā)出幼根；層積至30天時，大部分處理的種子裂口率達到了70%以上，此時取出種子，置于25℃條件下進行發(fā)芽實驗，各處理的種子均獲得了較高的發(fā)芽率（圖7）。由圖7可以看出，除9號處理外，其余8個處理的紫椴種子發(fā)芽率都達到了80.0%以上，其中以14號處理（濃H2SO4處理15 min+500 mg/LGA3處理12 h）效果最好，發(fā)芽率達92.0%，其次為13號處理（濃H2SO4處理15 min+200 mg/L GA3處理12 h）和11號處理（濃H2SO4處理10 min+500 mg/L GA3處理12 h）發(fā)芽率，分別為89.0%和88.0%，三者之間差異不顯著。方差分析表明，各處理的發(fā)芽率與對照的發(fā)芽率都達到了極顯著差異（方差分析表略），對照發(fā)芽率最低，僅有1.0%。

圖7 各處理對紫椴種子發(fā)芽率的影響

進一步對濃H2SO4不同處理時間和GA3不同濃度下的發(fā)芽率進行分析，結(jié)果表明，兩者對紫椴種子發(fā)芽率的影響均達到了極顯著水平（P<0.01，方差分析表略）。多重比較結(jié)果表明（見表5），隨著濃H2SO4處理時間的延長，紫椴種子發(fā)芽率逐漸提高，隨著GA3濃度的提高，紫椴種子發(fā)芽率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，GA3濃度在200 mg/L和500 mg/L時，種子發(fā)芽率差異不明顯，但當(dāng)濃度達到800 mg/L時，種子發(fā)芽率下降，與前兩者的差異達到極顯著水平（見表5）。

表5 綜合處理中濃H2SO4及GA3處理對紫椴種子發(fā)芽率的影響

3 討論與結(jié)論

植物種子休眠是一種復(fù)雜的生理現(xiàn)象，是植物在長期進化過程中為適應(yīng)外界不良環(huán)境形成的一種自我保護機制。關(guān)于種皮在種子休眠中所起的作用，多數(shù)觀點認為是由于存在透性障礙、機械障礙、存在發(fā)芽抑制物或者由上述因素共同作用所致。魏靈敏等[11]認為種皮的機械障礙及種皮內(nèi)抑制物的存在是導(dǎo)致拐棗種子休眠的主要原因；韓月喬等[12]認為白蘚種子休眠是種皮內(nèi)含有發(fā)芽抑制物質(zhì)及胚根休眠導(dǎo)致的；馬占相思種子的種皮不透性是其休眠的原因，起主導(dǎo)作用的是其致密的柵欄組織[13]。本研究中，紫椴種子經(jīng)酸蝕處理后吸水率大大提高(73.0%)，而對照種子的吸水率僅為20.3%，遠低于種子萌發(fā)所需的基本吸水率(40%)[12]，由此可見紫椴種子存在一定的透性障礙，可能是這種透性障礙在一定程度上限制了紫椴種子胚與外界進行水分與氣體交換，從而抑制了種子的萌發(fā)[14]，這與周健等[15]在對大花四照花種子的研究中得出的結(jié)論較為一致。但通過紫椴種子的萌發(fā)特性研究可知，去掉種皮以后，保留全胚乳的紫椴種子依然不能順利萌發(fā)，發(fā)芽率僅有4.0%，這說明胚乳是引起休眠的重要原因之一，這與杜鳳國等[7]的研究結(jié)論不同。 史鋒厚等[8]在對南京椴的研究中也認為，種皮并不是造成南京椴種子休眠的主要因素。

去掉種皮后，進一步對紫椴的胚乳進行不同的切除處理，結(jié)果表明，紫椴種子的離體胚發(fā)育完整，萌發(fā)迅速，萌發(fā)率可達100%，說明紫椴種子的休眠不是胚性休眠，也不存在生理后熟現(xiàn)象，其休眠是由胚外因素導(dǎo)致的，這與王九齡等[10]的觀點一致。切除部分胚乳但胚根沒有露出的種子，其萌發(fā)率僅為23.3%；剝除胚乳帽使根尖露出的種子，萌發(fā)率可達84.0%，但在萌發(fā)的種子中僅有26.0%的種子子葉可以突破胚乳的束縛而展開；而保留全胚乳的種子萌發(fā)率僅有4.0%。由此可見，胚乳對紫椴種子的萌發(fā)有很大的限制作用，尤其是胚乳帽的限制作用最大，這與盧明艷等[16]在對無髯鳶尾種子的研究中得出的結(jié)論類似，她們認為珠孔端的胚乳是造成5種野生無髯鳶尾種子休眠的主要因素。李成浩等[17]通過對五味子種子休眠原因的研究，也指出胚乳的機械障礙是導(dǎo)致五味子休眠的主要原因之一。另有研究指出，胚根進行伸長生長并突破周圍的包被物是種子完成發(fā)芽的標(biāo)志，而促進胚根進行伸長生長的原因之一就是胚根頂端外圍組織束縛力的降低[18]；去掉細葉鳶尾珠孔端的胚乳，使其胚根露出，細葉鳶尾隨即就能順利萌發(fā)[19]；黃精種子的種胚跟紫椴種子的種胚一樣被胚乳完全包被，且胚乳厚而致密，其萌發(fā)的過程伴也隨著胚乳的弱化[20]。本研究中，紫椴的離體胚和露出根尖的種子萌發(fā)率顯著高于其他處理的種子，此結(jié)果恰好印證了這一點。故可推測，胚乳尤其是胚乳帽的機械障礙是造成紫椴種子休眠的主要因素。當(dāng)前已有很多的研究提出并證實了這一觀點，即很多種子的休眠都是由于種皮或胚乳的機械障礙引起的[21-22]。

從生物力學(xué)的視角出發(fā)，種子覆蓋物的弱化以及胚的生長潛力共同調(diào)控種子的萌發(fā)，種子能否萌發(fā)取決于胚生長產(chǎn)生的動力及種子覆被物（種皮、胚乳）所產(chǎn)生的機械阻力之間的平衡[23]，如何削弱其作用，是促進種子萌發(fā)的關(guān)鍵所在。破壞種皮結(jié)構(gòu)可以增強種皮透性，減小種皮的機械阻力，并有利于供給種胚生長發(fā)育所需的水氣條件。濃硫酸常被用來處理種皮堅硬的種子，本研究中，致密堅硬的紫椴種皮經(jīng)濃硫酸處理后變薄變軟，透性增強，這是解除紫椴種子休眠的首要條件，但僅僅使用濃硫酸處理在短時間內(nèi)并不能打破紫椴種子的休眠，需要與GA3處理和低溫層積相結(jié)合才能達到快速解除紫椴種子休眠的目的。

GA3已被廣泛應(yīng)用于種子休眠的處理中[24-26]，GA3促進種子萌發(fā)至少有兩種作用，即增強胚的生長勢和軟化胚周圍組織（如種皮和胚乳）以利于胚根的突破[27]。Jinrong Peng等[28]在對番茄種子的研究中指出，番茄GA缺乏突變型的種子(gib-1)在沒有外源赤霉素情況下是不能萌發(fā)的，但如果去掉胚乳帽便可順利萌發(fā)，他們的這一結(jié)論與本實驗的研究結(jié)果高度一致，故可推測，GA3在這些種子中的作用可能是誘導(dǎo)使胚乳強度減弱的酶的活性，從而削弱胚乳的機械障礙。正在發(fā)芽的野生型番茄種子中，由于β-甘露聚糖內(nèi)酶的作用，使胚根穿透富含甘露聚糖的胚乳細胞壁所需的穿透力降低[29]，這個酶最先產(chǎn)生于發(fā)芽孔周圍，發(fā)芽后再產(chǎn)生于胚乳的其它部位[30-31]。筆者在對南京椴種子休眠機理的研究中發(fā)現(xiàn)，GA3最重要的作用很可能就是誘導(dǎo)降解細胞壁的酶的產(chǎn)生來弱化胚乳對種胚生長的機械阻力，以及誘導(dǎo)降解胚乳細胞內(nèi)大分子不溶營養(yǎng)物質(zhì)的酶的出現(xiàn)[32]。但單獨使用GA3不能解除紫椴種子的休眠，需與濃硫酸處理和低溫層積處理結(jié)合使用才能發(fā)揮其作用。

綜上所述，濃硫酸處理+GA3處理+低溫層積是快速解除紫椴種子休眠的有效方法，單獨使用濃硫酸或GA3都不能在短時間內(nèi)取得理想的效果。但由于濃硫酸腐蝕性強，容易對種子造成傷害，在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用有一定的難度，可以考慮使用熱水或其他腐蝕性較小的試劑代替濃硫酸，這需要在生產(chǎn)中不斷摸索實踐。