范恩帝，黃 魏，謝 丹，吳 成，李嶺卓，張 健，尤小龍，程平言，胡 峰

（貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州習水 564622）

作為三大主要香型白酒之一的醬香型白酒，因其獨特的工藝和風味聞名于世[1]。四甲基吡嗪作為川芎主要活性成分，也被稱為川芎嗪，是一類廣泛存在于食品中的生物堿[2]。醬香型白酒中的四甲基吡嗪不但可以起到減輕炎癥和抑制腫瘤等作用[3-4]，更能賦予其烘烤香氣，是形成醬香風味的重要成分[5-6]。因此，在大健康主題作為民生要點備受政府和社會關(guān)注的時代下[7]，研究增加醬香型白酒中四甲基吡嗪含量對于改善和提高其品質(zhì)具有重要意義。

食品中的四甲基吡嗪多產(chǎn)生于美拉德反應(yīng)[8]，但有研究表明醬香型白酒中的四甲基吡嗪主要是通過枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等微生物產(chǎn)生[9-11]。芽孢桿菌作為醬香型白酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)生醬香風味的主要微生物，可以產(chǎn)生3-羥基丁酮（也叫乙偶姻）等風味物質(zhì)[12-13]，還可代謝產(chǎn)生蛋白酶把蛋白質(zhì)降解為氨基酸[9-10]，氨基酸在氨基酸脫氫酶作用下繼續(xù)脫氫產(chǎn)生的氨與其代謝產(chǎn)物3-羥基丁酮發(fā)生非酶促反應(yīng)合成四甲基吡嗪[11，14]。有研究指出在醬香型白酒生產(chǎn)過程中大曲是細菌的主要來源[15]。鑒于此，可通過初步篩選大曲中高產(chǎn)乙偶姻和蛋白酶的芽孢桿菌，再從中篩選高產(chǎn)四甲基吡嗪的芽孢桿菌，用以制作功能性大曲并運用于醬香型白酒生產(chǎn)，進而提高四甲基吡嗪的含量。本研究以成品醬香大曲為研究對象，經(jīng)高溫高滲條件富集芽孢桿菌，再通過V-P 反應(yīng)和產(chǎn)蛋白酶能力初篩得到3-羥基丁酮（作為四甲基吡嗪前體物質(zhì)）和蛋白酶產(chǎn)量較高的芽孢桿菌[16-17]，進一步發(fā)酵和對比各菌株四甲基吡嗪產(chǎn)量最終篩選出高產(chǎn)四甲基吡嗪的微生物。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

醬香大曲：貴州某醬香型白酒公司提供的儲存半年后成品粉碎曲和曲塊。

1.1.2 試劑及耗材

色譜純四甲基吡嗪，上海安譜實驗科技股份有限公司；肌酸，成都西亞化工股份有限公司；酵母浸粉，OXOID；蛋白胨、牛肉膏粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；氫氧化鈉、氯化鈉、葡萄糖、牛肉膏，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉，天津大茂化學試劑廠；酪蛋白、磷酸氫二銨，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏粉3 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加入1 mL 濃度為0.04 g/mL 的溴甲酚紫乙醇溶液，蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH7.3，121 ℃滅菌20 min。

高鹽瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，氯化鈉100 g，瓊脂20 g，加入1 mL 濃度為0.04 g/mL的溴甲酚紫乙醇溶液，蒸餾水定容至1000 mL,調(diào)節(jié)pH7.3，121 ℃滅菌20 min。

V-P培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH7.2，121 ℃滅菌20 min。

酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基：酪蛋白10g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉2 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL，并調(diào)節(jié)pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

芽孢桿菌培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基）：酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，蛋白胨10 g，蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH7.4，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（YPG 培養(yǎng)基）：葡萄糖100 g，蛋白胨30 g，酵母膏10 g，磷酸氫二銨30 g，蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH7.5，115 ℃滅菌15 min。

1.1.4 儀器設(shè)備

全溫震蕩培養(yǎng)箱（ZQPL-200 型），天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；海爾-20 ℃低溫保藏箱（DW-30L278），青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；超純水器（AWL-1001-P），艾科浦公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9075A 型），上海一恒科學儀器有限公司；無菌操作臺（SW-CJ-2F），蘇州凈化設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250），上海一恒科學儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（CL-32L），KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC；高效液相色譜儀（安捷倫1260），安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芽孢桿菌富集

對大曲樣品進行粉碎，每個樣品均取兩份含量為25 g 的曲粉，分別置于100 mL 的生理鹽水和LB培養(yǎng)基中。將生理鹽水樣品于37 ℃、150 r/min 搖床中振蕩30 min，稀釋涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和高鹽培養(yǎng)基中，將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置于45 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，將高鹽培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。LB 培養(yǎng)基樣品于37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)1 d后，置于100 ℃水浴鍋中水浴30 min，稀釋涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d[18]。最后再對各平板微生物進行多次純化并保藏。

1.2.2 菌種初篩

將上述微生物活化后接種于V-P 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，將活化后的微生物點接到酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，通過V-P 反應(yīng)中吸光度判斷各微生物乙偶姻產(chǎn)生能力，通過酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基透明圈直徑判斷各微生物產(chǎn)蛋白酶能力。以產(chǎn)乙偶姻能力為主，產(chǎn)蛋白酶能力為輔，篩選出乙偶姻和蛋白酶產(chǎn)量較優(yōu)的微生物。

1.2.3 菌種復(fù)篩

將1.2.2 得到的微生物分別接種到Y(jié)PG 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min 搖床中發(fā)酵3 d，根據(jù)各微生物發(fā)酵液中四甲基吡嗪濃度篩選出高產(chǎn)四甲基吡嗪微生物。

1.2.4 菌種鑒定

形態(tài)鑒定：觀察菌落表面形狀、大小、顏色和邊緣等特征，并通過顯微鏡觀察微觀形態(tài)[19]。

分子生物學鑒定：對微生物進行16S rDNA 測序[20]，利用NCBI 中的在線工具Blast 將獲得的基因序列與GenBank 中的標準菌株進行比對，選取同源性高于99 %的部分具有代表性的物種，通過軟件MEGA X 選擇Neighbor-Joining 模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行同源性分析。

1.2.5 高產(chǎn)四甲基吡嗪微生物的模擬應(yīng)用

稱取若干小麥置于錐形瓶中進行滅菌，按照7%的比例加入母曲，接入10%的高產(chǎn)四甲基吡嗪微生物菌液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，對發(fā)酵物進行香氣評價和四甲基吡嗪含量檢測。

1.2.6 測定分析方法

乙偶姻含量粗測采用V-P 反應(yīng)和光度法[21]。四甲基吡嗪含量測定采用高效液相色譜法[22]，液態(tài)發(fā)酵樣品稀釋10倍后進行檢測，固態(tài)發(fā)酵樣品先于12%乙醇溶液中浸泡10 min，再超聲處理30 min，最后離心進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)四甲基吡嗪微生物初篩

醬香型白酒四甲基吡嗪多由微生物產(chǎn)生，乙偶姻是微生物合成四甲基吡嗪的前體物質(zhì)[23]，可通過V-P 反應(yīng)后的吸光度大小判斷微生物產(chǎn)乙偶姻能力強弱，蛋白酶可以把蛋白質(zhì)降解為氨基酸，為四甲基吡嗪合成提供前體物質(zhì)，可根據(jù)酪蛋白培養(yǎng)基上透明圈大小判斷產(chǎn)蛋白酶能力強弱。因此本研究從富集純化的38 株微生物中篩選高產(chǎn)乙偶姻和蛋白酶微生物，進而篩選四甲基吡嗪產(chǎn)量高的微生物，初篩結(jié)果見圖1和圖2。

由圖1 和圖2 可以看出，在所有菌株中，JPF1、JPF2、△JPF1、JYF1、△JYF1和JM4這6株菌株既能產(chǎn)生較高含量的乙偶姻，又能產(chǎn)生豐富的蛋白酶，具有高產(chǎn)四甲基吡嗪的潛力，因此將這些菌株作為待定菌株，并通過后續(xù)發(fā)酵實驗進一步篩選目標微生物。

圖1 不同菌株產(chǎn)乙偶姻能力

圖2 不同菌株產(chǎn)蛋白酶能力

2.2 高產(chǎn)四甲基吡嗪微生物復(fù)篩

基于產(chǎn)乙偶姻能力和產(chǎn)蛋白酶能力初篩得到的JPF1、JPF2、△JPF1、JYF1、△JYF1 和JM4，通過進一步發(fā)酵實驗以篩選高產(chǎn)四甲基吡嗪微生物，結(jié)果見圖3。

根據(jù)圖3 結(jié)果可以看出，菌株△JYF1 四甲基吡嗪產(chǎn)量為424 mg/L，明顯高于其余菌株，尤其是JPF2、△JPF1、JYF1、JM4。結(jié)合初篩結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)乙偶姻能力強的菌株（JPF1 和△JYF1）在四甲基吡嗪產(chǎn)量上具有更好表現(xiàn)，說明較高產(chǎn)量的前體物質(zhì)（乙偶姻）對四甲基吡嗪的產(chǎn)生有一定助益。

圖3 不同菌株四甲基吡嗪產(chǎn)量

2.3 微生物鑒定

2.3.1 微生物形態(tài)學觀察

將篩選的菌株△JYF1 分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d，對其宏觀菌落形態(tài)和微觀細胞形態(tài)進行觀察，結(jié)果如圖4所示。

從圖4 可以看出，菌株△JYF1 菌落在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈扁平的白色橢圓形，表面粗糙干燥不透明，邊緣呈嚙齒狀；LB 培養(yǎng)基中菌株△JYF1 經(jīng)適當稀釋并染色后通過顯微鏡進行觀察，菌株細胞形態(tài)為短桿狀。

圖4 菌株△JYF1菌落形態(tài)（a）及細胞形態(tài)（b）

2.3.2 微生物分子生物學鑒定

對篩選得到的菌株△JYF1 進行16S rDNA 測序，利用NCBI 中的在線工具Blast 將測序獲得的基因序列與GenBank 中的標準菌株進行比對，選取同源性高于99 %的部分具有代表性的物種，并通過軟件MEGA X 選擇Neighbor-Joining 模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示。

從圖5 可以看出，菌株△JYF1 與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）和西姆芽孢桿菌（B.siamensis）等多種芽孢桿菌同源性均大于99%，其中，西姆芽孢桿菌與菌株△JYF1 處于同一分支，結(jié)合對菌株△JYF1 的形態(tài)學觀察，故可鑒定其為西姆芽孢桿菌。

圖5 菌株△JYF1基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 高產(chǎn)四甲基吡嗪微生物的模擬應(yīng)用

為了探究高產(chǎn)四甲基吡嗪微生物對醬香大曲生產(chǎn)的影響，本研究設(shè)置三組實驗（未接種小麥組、加母曲小麥組、加母曲和菌液小麥組）進行對比，結(jié)果見表1。

由表1 可看出，相較于未接種小麥組和加母曲小麥組，加母曲和菌液小麥組既能產(chǎn)生較高含量的四甲基吡嗪，又具有醬香味和酒香味，說明單獨加入母曲的小麥在短時間發(fā)酵過程中僅有霉菌較為活躍，無四甲基吡嗪產(chǎn)生，加入母曲和菌液則可以加速四甲基吡嗪的產(chǎn)生。同時也說明高產(chǎn)蛋白酶的菌株△JYF1 可以降解小麥，有益于母曲中酵母等微生物在小麥中的生長繁殖。

表1 功能微生物對小麥發(fā)酵的影響

3 結(jié)論

本研究從醬香大曲中初篩得到6 株高產(chǎn)乙偶姻和蛋白酶的微生物，并通過進一步發(fā)酵從中篩選到1 株四甲基吡嗪生成能力較強的芽孢桿菌△JYF1。在YPG發(fā)酵培養(yǎng)基中該菌株四甲基吡嗪產(chǎn)量可以達到424 mg/L，與目前已報道的相關(guān)研究相比產(chǎn)量更高[2，24，25]。通過對其進行形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，鑒定為西姆芽孢桿菌。菌株△JYF1 應(yīng)用于醬香大曲模擬生產(chǎn)時，可大大加速四甲基吡嗪的產(chǎn)生，發(fā)酵4 d 后的產(chǎn)物中四甲基吡嗪產(chǎn)量可以達到65.51 mg/kg，在同類研究中處于較高水平[26]，同時還具有濃郁的醬香味。該菌株的成功篩選為提高醬香白酒中四甲基吡嗪含量提供了可能，但其實際推廣應(yīng)用還有待進一步的中試實驗和大試實驗加以驗證。