毛 豪，王家勝，趙 婷，蔡開云，陳 萍，馮向東，明 聃，陳茂彬

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心，湖北武漢 430068；2.湖北省稻花香酒業(yè)有限公司，湖北宜昌 443000）

乳酸菌是白酒釀造中必不可少的微生物，窖泥中乳酸菌是重要的產(chǎn)酸細(xì)菌，謝玉球等[1-2]在窖泥中分離的乳酸菌中發(fā)現(xiàn)不同種屬和不同生長(zhǎng)特征的乳酸菌對(duì)白酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)是不一樣的。有研究表明，乳桿菌屬與甲氧基乙酸異戊酯、戊酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯等酯類物質(zhì)呈正相關(guān)。乳酸是乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是白酒中四大酸之一，占白酒中有機(jī)酸的43%左右[3-5]，白酒中含有適量的乳酸能夠減輕酒體刺鼻的味道，減少澀味、增強(qiáng)余味、增加甜度使酒體協(xié)調(diào)醇厚[1]。此外有學(xué)者認(rèn)為乳酸能催化新酒老熟[6]。在白酒生產(chǎn)過程中酒醅里的乳酸及乳酸乙酯會(huì)在蒸餾時(shí)進(jìn)入酒體，由于乳酸的沸點(diǎn)較高不易揮發(fā)，一般情況下酒尾乳酸的含量大于酒身，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大部分乳酸不會(huì)被帶入酒體而是留在廢酒糟中[1，7]。

乳酸與乙醇通過酯化作用生成乳酸乙酯，被認(rèn)為是白酒中的四大酯之一，在清香型白酒中乳酸乙酯是除了乙酸乙酯外的第二大主體香氣成分[8-9]，此外，乳酸乙酯與其他三大酯的比例對(duì)酒質(zhì)有顯著的影響，酒體中適量的乳酸乙酯從香味上能“助香”，防止“爆香”，從口感上能減少苦澀味，增加醇厚感。乳酸菌在白酒發(fā)酵中有著重要的地位，研究乳酸和乳酸乙酯對(duì)改善和調(diào)控白酒的品質(zhì)和風(fēng)味有較為積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：馫香型白酒發(fā)酵醅、窖泥。

試劑及耗材：酵母浸粉、吐溫80、牛肉膏，雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；磷酸氫二銨、溴甲酚紫、氯化鈉、葡萄糖、醋酸鈉、檸檬酸三銨、K2HPO4·7H2O、MgSO4·7H2O、醋酸鈉·3H2O、MnSO4·4H2O，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，阿拉丁試劑（上海）有限公司；草酸銨，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；結(jié)晶紫，天津市大茂化學(xué)試劑廠；番紅染色液，北京索萊寶科技有限公司。

儀器設(shè)備：DHG.9140A 恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZHJH-C1214B 超凈工作臺(tái)，上海智城分析儀器有限公司；UtiMae3000高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技公司；PHX智能生化培養(yǎng)箱，寧波萊福科技有限公司；TGL-16C 臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母浸粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫·80 1.0 mL、K2HPO4·7H2O 2.0 g、醋酸鈉·3H2O 5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、瓊脂粉15.0 g，加蒸餾水定容至1000.0 mL。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母浸粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫·80 1.0 mL、K2HPO4·7H2O 2.0 g、醋酸鈉·3H2O 5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g，加蒸餾水定容至1000.0 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的初篩

取各類樣品10.0 g，放入含有玻璃珠的90 mL無菌生理鹽水中，在30 ℃、180 r/min 下振蕩分散30 min，梯度稀釋后取100 μL涂布至含有溴甲酚紫的MRS 固體培養(yǎng)基中，35 ℃厭氧培養(yǎng)2 d。對(duì)單菌落劃線純化3～5 次后保藏于終濃度為20%的甘油管及MRS斜面中。

1.2.2 乳酸菌的復(fù)篩

將初篩得到的8 株產(chǎn)酸菌接種至MRS 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照2%的接種量35 ℃深層厭氧發(fā)酵7 d，采用高效液相色譜法測(cè)定乳酸含量，篩選出產(chǎn)乳酸性能最強(qiáng)的菌作為目的菌株。

1.2.3 菌種鑒定

將分離純化的8 株產(chǎn)酸菌制備菌液后送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行檢測(cè)鑒定。

1.2.4 目的菌種的發(fā)酵特性研究

1.2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)L1的生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量的變化

將MRS 液體培養(yǎng)基分裝于試管中，每支試管30 mL，將乳酸菌接種于MRS 培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，30 ℃下180 r/min培養(yǎng)18 h作為種子液，按2%的接種量接入試管中，30 ℃培養(yǎng)7 d，每隔1 d 取出3 個(gè)平行樣品，適當(dāng)稀釋后以未接種培養(yǎng)基作為空白于600 nm 波長(zhǎng)下用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，取平均值，以時(shí)間為橫軸繪制乳酸菌的生長(zhǎng)曲線，同時(shí)對(duì)發(fā)酵液中的乳酸含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4.2 接種量對(duì)L1生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量的變化

將種子液按1%、1.5%、2%、2.5%、3%的接種量接入MRS 液體培養(yǎng)基試管中，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d 后，以未接種MRS 培養(yǎng)基為空白對(duì)照于波長(zhǎng)600 nm 下測(cè)定其OD 值，同時(shí)對(duì)乳酸含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4.3 葡萄糖濃度對(duì)L1生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量的變化

種子液按2 %接種量接入到葡萄糖含量分別為0.5 %、1 %、1.5 %、2 %、2.5 %的MRS 液體培養(yǎng)基試管中，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d 后，以未接種MRS 培養(yǎng)基為空白對(duì)照于波長(zhǎng)600 nm 下測(cè)定其OD 值，同時(shí)對(duì)乳酸含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4.4 培養(yǎng)溫度對(duì)L1生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量的變化

按種子液2 %的接種量接入MRS 培養(yǎng)基試管中，分別置于30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃靜置培養(yǎng)7 d 后，以未接種MRS 培養(yǎng)基為空白對(duì)照于波長(zhǎng)600 nm 下測(cè)定其OD 值，同時(shí)對(duì)乳酸含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4.5 初始pH值對(duì)L1生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量的變化

分別調(diào)整初始MRS 培養(yǎng)基的pH 值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，接入2%的種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d后，以未接種MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照于波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定其OD值，同時(shí)對(duì)乳酸含量進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

2.1.1 乳酸菌的初篩（平板顯色反應(yīng)）

如圖1 所示，以8 株菌落為半徑，產(chǎn)生了一圈黃色透明圈，在pH 值大于6.8 的培養(yǎng)基中，溴甲酚紫為弱堿式結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)為紫色，8 株菌株生長(zhǎng)繁殖時(shí)，產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，使得pH 值降到5.2 以下，培養(yǎng)基中的溴甲酚紫為弱酸式結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)為黃色。因此，當(dāng)菌落周圍出現(xiàn)黃色透明圈時(shí)，說明菌株產(chǎn)生酸性物質(zhì)，可以判斷這8 株為產(chǎn)酸菌株，將它們保藏至MRS斜面和甘油管中作為初篩菌株。

圖1 8株產(chǎn)酸菌平板顯色反應(yīng)

2.1.2 乳酸菌的復(fù)篩

建立的乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=9.0691x+0.3771，R2=0.9998。發(fā)酵7 d 后，將發(fā)酵產(chǎn)物膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)[10-11]，色譜圖如圖2所示，8株菌株全部產(chǎn)生乳酸，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品可知，乳酸的出峰時(shí)間為4.290±0.02。乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)在0.999 以上，可用于準(zhǔn)確定量，根據(jù)線性方程可計(jì)算出樣品中對(duì)應(yīng)乳酸的含量。菌種發(fā)酵7 d 后的pH 值與乳酸含量如圖3 所示，菌種L1—L8 的pH 值較空白普遍下降，說明8 株菌株都產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，使發(fā)酵液中的pH 值降低，菌株L1 的發(fā)酵液pH值最低為4.1，且產(chǎn)乳酸含量最高為4.865 g/L，說明菌株L1 的產(chǎn)乳酸能力與性能比其他菌株強(qiáng)，因此將菌株L1作為目的菌株。

圖2 8株乳酸菌產(chǎn)乳酸的HPLC色譜圖

圖3 發(fā)酵液中乳酸含量及pH值

2.2 菌種鑒定

將16S rDNA 序列進(jìn)行NCBI-BLAST，通過比對(duì)L1 菌株與Weissella confusa相似性達(dá)100%并且與MT515858.1 菌株親緣關(guān)系最為接近，從BLAST結(jié)果中選取相似性較高的10 株菌并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建L1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ）[12]。

圖4 L1菌株發(fā)育樹

2.3 L1發(fā)酵特性的研究

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)L1的生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量的變化

由圖5A 中L1 隨著培養(yǎng)時(shí)間OD600的變化趨勢(shì)可知，在0～1 d 生長(zhǎng)速率緩慢，是菌種生長(zhǎng)的遲緩階段，細(xì)菌進(jìn)入新的環(huán)境需要適應(yīng)，生長(zhǎng)較為遲緩；在1～2 d 生長(zhǎng)速率加快，說明生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，細(xì)菌生長(zhǎng)速率最快，且此時(shí)細(xì)菌的大小、生理活性等都比較典型，因此進(jìn)行菌種鑒定時(shí)一般選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期的菌種，第2 d時(shí)生長(zhǎng)量達(dá)到峰值；在第2～3 d，菌種量保持相對(duì)穩(wěn)定，菌種數(shù)量處于穩(wěn)定期；在第3～4 d，菌種生長(zhǎng)量下降，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖速度減慢或者停止，死亡數(shù)大于生長(zhǎng)量，菌種生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。L1 的整個(gè)生長(zhǎng)曲線符合微生物生長(zhǎng)規(guī)律。由圖5B 中L1 的乳酸含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)可知，在0～2 d，乳酸含量較低，此時(shí)乳酸菌生長(zhǎng)量較低，導(dǎo)致乳酸產(chǎn)率低；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸含量升高，這是由于菌體含量高，β-半乳糖苷酶的含量較多，活力較高。有研究表明，在一定條件下，乳酸的生成速率和β-半乳糖苷酶的活力呈現(xiàn)正相關(guān)；在第6 d，乳酸含量不再增長(zhǎng)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸過多使得pH 值降低，抑制了酶的活力，或者由于乳酸含量過高抑制了菌體的生長(zhǎng)，菌體衰亡，導(dǎo)致乳酸含量不再增加。

圖5 L1隨著培養(yǎng)時(shí)間生長(zhǎng)量及乳酸含量的變化

2.3.2 接種量對(duì)L1的生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量的變化

接種量的大小決定菌種的生長(zhǎng)速度，從而影響菌種代謝產(chǎn)物的含量。接種量過多，導(dǎo)致溶氧不足，代謝產(chǎn)物過多，不利于產(chǎn)物合成。由圖6A 中接種量對(duì)L1 的生長(zhǎng)量影響可知，隨著接種量的增加，L1 的生長(zhǎng)量隨之增加，當(dāng)接種量≥2 %時(shí)，菌體量趨于平穩(wěn)。由圖6B 中接種量對(duì)L1 產(chǎn)酸量的影響可知，當(dāng)接種量為2 %時(shí)，乳酸含量達(dá)到峰值4.611 g/L，隨著接種量的增加，乳酸含量開始下降，這可能是由于在接種量變大時(shí)種子液中的有毒代謝物被大量帶入發(fā)酵體系，代謝產(chǎn)物的毒性抑制了乳酸的生成。結(jié)合接種量對(duì)菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)乳酸的影響，當(dāng)接種量為2 %時(shí)，菌種含量達(dá)到峰值的80 %以上，產(chǎn)酸含量達(dá)到最高，因此選擇2 %作為最佳接種量。

圖6 接種量對(duì)L1的生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸影響

2.3.3 葡萄糖添加量對(duì)L1 的生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量的變化

葡萄糖作為菌種生長(zhǎng)的必要物質(zhì)，也是乳酸菌生產(chǎn)乳酸的重要原料，探究葡萄糖的添加量對(duì)發(fā)酵特性的影響是必要的。如圖7A 中葡萄糖添加量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)量的變化趨勢(shì)所示，隨著葡萄糖含量的升高，生長(zhǎng)量隨之升高，當(dāng)達(dá)到1.5 %時(shí)，生長(zhǎng)量趨于穩(wěn)定。由圖7B 中葡萄糖的添加量對(duì)乳酸含量的影響可知，當(dāng)葡萄糖含量為2.0 %時(shí)，乳酸含量最高，為5.15 g/L；葡萄糖添加量繼續(xù)升高，乳酸含量降低，這可能是由于底物濃度過高產(chǎn)生了底物抑制和高滲應(yīng)激效應(yīng)，導(dǎo)致乳酸產(chǎn)量變低。

圖7 葡萄糖含量對(duì)L1的生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸影響

2.3.4 培養(yǎng)溫度對(duì)L1的生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量的變化

溫度對(duì)生物體內(nèi)的酶有著很大的影響，對(duì)菌體生長(zhǎng)量以及與乳酸合成有關(guān)的酶有一定的調(diào)控作用。由圖8A 培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)量的變化趨勢(shì)可知，隨著溫度的升高，L1 的生長(zhǎng)量隨之升高，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，OD600達(dá)到最大值為4.76，因此最適生長(zhǎng)溫度為35 ℃，且產(chǎn)酸含量最高為4.56 g/L；超過35 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，菌體生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量都下降，說明溫度過高，減緩了乳酸菌體的生長(zhǎng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)量下降，并且抑制了合成乳酸關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致乳酸含量下降。

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)L1的生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸影響

2.3.5 初始pH值對(duì)L1的生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸量的變化

pH 值對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有很大的影響，過酸過堿都會(huì)抑制菌種量，pH 值可以影響酶的活性、膜表面的表面電荷性質(zhì)及通透性等從而影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，找到細(xì)菌適宜的生長(zhǎng)pH值是重要的。如圖9A中初始pH值對(duì)L1的生長(zhǎng)量的變化趨勢(shì)所示，生存環(huán)境由酸到中性，菌體含量持續(xù)上升，當(dāng)中性環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)閴A性環(huán)境時(shí)，生長(zhǎng)量趨勢(shì)開始下降，說明L1 在中性環(huán)境中的生長(zhǎng)量較好。如圖9B 中初始pH 值對(duì)L1 產(chǎn)乳酸含量的變化趨勢(shì)所示，隨著pH 值的升高，乳酸含量升高，L1在酸性環(huán)境中的生長(zhǎng)量低；因此產(chǎn)物較低。當(dāng)pH值為6.0 時(shí)，乳酸含量達(dá)到最高；當(dāng)pH 值高于6.0時(shí)，乳酸含量隨之降低，這是由于生長(zhǎng)量最高時(shí)，產(chǎn)物復(fù)雜，抑制了乳酸的合成，導(dǎo)致乳酸含量較低，生長(zhǎng)量較低時(shí)，代謝產(chǎn)物種類較少，對(duì)酶的活性及菌體的抑制效果較弱，因此pH6.0 時(shí)乳酸含量最高，為4.53 g/L，而不是pH7.0 時(shí)生長(zhǎng)量最大時(shí)的乳酸含量最高。

圖9 初始pH值對(duì)L1的生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸影響

3 討論

從樣品中分離的8 株產(chǎn)酸菌經(jīng)過復(fù)篩得出L1菌株產(chǎn)乳酸能力最強(qiáng)；對(duì)乳酸菌L1 發(fā)酵性能進(jìn)行分析，結(jié)果表明，最佳發(fā)酵時(shí)間為6 d，最佳接種量為2%，最佳葡萄糖添加量為20 g/L，最佳培養(yǎng)溫度為33 ℃，最佳初始pH6.0，在此條件下乳酸含量最高為5.341 g/L。

本實(shí)驗(yàn)得到的乳酸菌具有與酵母菌進(jìn)行復(fù)配直接共培養(yǎng)生產(chǎn)乳酸乙酯用于酒和食品調(diào)香的能力[9]。在釀造體系中乳酸菌是不可缺少的，當(dāng)酒中出現(xiàn)乳酸乙酯含量不足，整體香味欠協(xié)調(diào)，酒體欠圓潤(rùn)的問題時(shí)，可以在發(fā)酵過程或者制曲過程加入適量的乳酸菌強(qiáng)化發(fā)酵，提升酒的品質(zhì)。