段傳軍 楊瑞 趙紅 劉維明 徐銳 曹志 劉勇 李曙曦

膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BUC)為膀胱癌中最常見的組織學(xué)類型，是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中男性發(fā)病多于女性[1]。多數(shù)患者初診時(shí)為非肌層浸潤性BUC，肌層浸潤性BUC患者占約30%[1]。BUC相較于其他實(shí)體癌復(fù)發(fā)傾向高，超過70%的BUC患者在術(shù)后2年內(nèi)會(huì)復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)患者通常伴隨不良預(yù)后[2]。BUC發(fā)病率及病死率較高，且近年來呈上升趨勢(shì)，因此，探究BUC發(fā)病機(jī)制，并尋找有效的治療靶點(diǎn)，有助于改善BUC患者的預(yù)后[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)為長度超過200 nt的RNA，不編碼蛋白質(zhì)，能夠參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，有望成為診治腫瘤的生物標(biāo)志物[4]。有研究報(bào)道，膀胱癌細(xì)胞中LncRNA煙酰胺核苷酸反義轉(zhuǎn)氫酶RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase-antisense RNA1, NNT-AS1)表達(dá)上調(diào)，可能參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長[5]。LncRNA可與微小RNA(microRNA, miRNA)相互調(diào)控，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。研究顯示，肺鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中LncRNA NNT-AS1表達(dá)上調(diào)，微小RNA-22(microRNA-22, miR-22)表達(dá)下調(diào)，LncRNA NNT-AS1可通過與miR-22結(jié)合直接調(diào)節(jié)叉頭盒蛋白M1的表達(dá)，從而影響肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移、侵襲及凋亡[7]。但LncRNA NNT-AS1、miR-22與BUC患者臨床病理特征的關(guān)系及其在BUC中表達(dá)的相關(guān)性尚未見報(bào)道，本研究通過檢測(cè)LncRNA NNT-AS1、miR-22在BUC患者細(xì)胞及組織中的表達(dá)，探討二者在BUC發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為BUC的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、一般資料

選取本院2016年8月至2021年2月收治的39例BUC患者作為研究對(duì)象。其中男32例，女7例；年齡中位數(shù)為60歲，<60歲者8例，≥60歲者31例。腫瘤浸潤：肌層浸潤25例，非肌層浸潤14例。臨床分期：Ta 4例，T15例，T27例，T313例，T410例。病理分級(jí)：低級(jí)別16例，高級(jí)別23例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(行泌尿系超聲或CT檢查評(píng)估)11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例。腫瘤直徑(根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果評(píng)估)中位數(shù)為3 cm，<3 cm者13例，≥3 cm者26例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國泌尿外科疾病診斷治療指南》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②經(jīng)病理確診為BUC，且均為單發(fā)灶腫瘤；③術(shù)前均未行放化療、膀胱灌注及免疫治療等；④患者行膀胱全切或部分切除，或影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)有腫物者，行膀胱腫瘤電切術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②合并嚴(yán)重肝腎功能不全者；③隨訪記錄缺失者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1和人膀胱癌細(xì)胞株T24(中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)均在RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件：37 ℃、含5% CO2。以T24細(xì)胞作為BUC細(xì)胞組，以SV-HUC-1細(xì)胞作為對(duì)照組。

2.組織樣本采集：留取患者術(shù)中切除的癌組織39例，另取癌旁正常組織(距癌灶邊緣5 cm以上)39例作為對(duì)照，新鮮的組織于液氮中速凍后，置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

3.細(xì)胞及組織中LncRNA NNT-AS1、miR-22水平檢測(cè)：采用Trizol試劑提取細(xì)胞及組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，NNT-AS1基因的cDNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)205111，德國Qiagen公司)合成，miRNA的cDNA采用miRNA cDNA鏈合成試劑盒(貨號(hào)ZY130911，上海澤葉生物科技有限公司)合成。以所得cDNA為模板，配制qRT-PCR反應(yīng)體系，其中LncRNA NNT-AS1內(nèi)參為GAPDH，miR-22內(nèi)參為U6(表1)。于熒光定量PCR儀(貨號(hào)MA-6000，蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司)上檢測(cè)細(xì)胞及組織中LncRNA NNT-AS1、miR-22水平。采用2-△△Ct法計(jì)算LncRNA NNT-AS1、miR-22相對(duì)表達(dá)量。

表1 LncRNA NNT-AS1、miR-22及相應(yīng)內(nèi)參GAPDH、U6的引物序列

4.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：利用ENCORI數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-22與LncRNA NNT-AS1可能的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建LncRNA NNT-AS1野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒，將LncRNA NNT-AS1野生型和突變型質(zhì)粒與miR-22 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)熒光素酶相對(duì)活性，具體檢測(cè)方法參照熒光素酶活性試劑盒(貨號(hào)LM130595-100，上海聯(lián)邁生物工程有限公司)。

三、隨訪

對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間6～36個(gè)月，平均16.5個(gè)月，無失訪者，隨訪開始時(shí)間為術(shù)后第1天，結(jié)束時(shí)間截至2021年8月或患者死亡。以電話、微信或院內(nèi)復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，每3個(gè)月至少隨訪1次。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組細(xì)胞中LncRNA NNT-AS1、miR-22的水平比較

BUC細(xì)胞組中LncRNA NNT-AS1水平高于對(duì)照組(P<0.05)，miR-22水平低于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組細(xì)胞中LncRNA NNT-AS1、miR-22的水平比較

二、不同組織中LncRNA NNT-AS1、miR-22的水平比較

癌組織中LncRNA NNT-AS1水平高于癌旁正常組織(P<0.05)，miR-22水平低于癌旁正常組織(P<0.05)，見表3。

表3 不同組織中LncRNA NNT-AS1、miR-22的水平比較

三、LncRNA NNT-AS1、miR-22水平與BUC患者臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、年齡及腫瘤直徑患者LncRNA NNT-AS1、miR-22水平比較，不同臨床分期患者LncRNA NNT-AS1水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LncRNA NNT-AS1、miR-22水平與患者腫瘤浸潤、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，且miR-22水平與患者臨床分期有關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 LncRNA NNT-AS1、miR-22水平與BUC患者臨床病理特征的關(guān)系

四、癌組織中LncRNA NNT-AS1、miR-22的相關(guān)性分析

ENCORI數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)顯示，miR-22與LncRNA NNT-AS1存在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，見圖1；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于miR-NC與LncRNA NNT-AS1野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，miR-22 mimics與LncRNA NNT-AS1野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對(duì)活性明顯降低(P<0.05)；相對(duì)于miR-NC與LncRNA NNT-AS1突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，miR-22 mimics與LncRNA NNT-AS1突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對(duì)活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2；Pearson法分析顯示，BUC患者組織中LncRNA NNT-AS1與miR-22呈負(fù)相關(guān)(r=-0.479，P=0.002)，見圖3。

圖1 LncRNA NNT-AS1與miR-22的結(jié)合位點(diǎn)

五、LncRNA NNT-AS1、miR-22水平與BUC患者總生存率的關(guān)系

39例BUC患者隨訪期間有10例死亡，總生存率為74.36%。以癌組織LncRNA NNT-AS1、miR-22表達(dá)的中位數(shù)(1.51、0.78)將39例患者分為LncRNA NNT-AS1高表達(dá)組(20例)、LncRNA NNT-AS1低表達(dá)組(19例)及miR-22高表達(dá)組(19例)、miR-22低表達(dá)組(20例)。經(jīng)Kaplan-Meier生存分析顯示，LncRNA NNT-AS1高表達(dá)組的總生存期平均值為22.93個(gè)月(95%CI：17.08～28.79)，低表達(dá)組總生存期平均值為32.81個(gè)月(95%CI：29.04～36.57)，LncRNA NNT-AS1高表達(dá)組的總生存率(60.0%)低于LncRNA NNT-AS1低表達(dá)組(89.5%)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(log-rank檢驗(yàn)χ2=5.834，P=0.016)，見圖4；miR-22高表達(dá)組的總生存期平均值為33.67個(gè)月(95%CI：29.93～37.40)，低表達(dá)組總生存期平均值為22.92個(gè)月(95%CI：17.35～28.49)，miR-22高表達(dá)組總生存率(94.7%)高于miR-22低表達(dá)組(55.0%)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(log-rank檢驗(yàn)χ2=6.940，P=0.008)，見圖5。

圖4 LncRNA NNT-AS1高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存曲線

將LncRNA NNT-AS1高表達(dá)+miR-22低表達(dá)患者12例作為A組，LncRNA NNT-AS1低表達(dá)+miR-22高表達(dá)患者10例作為B組，其余患者17例為C組，分析3組患者的總生存率，結(jié)果顯示，A組總生存率最低，B組總生存率最高，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(log-rank檢驗(yàn)χ2=12.747，P=0.002)，見圖6。

討 論

在過去幾十年，BUC發(fā)病率持續(xù)增加[9]，目前主要采用手術(shù)治療BUC。BUC具有侵襲性強(qiáng)、術(shù)后復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，盡管術(shù)后輔助免疫或灌注治療等可一定程度上降低復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率，但效果不甚理想，仍有部分患者會(huì)進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌，導(dǎo)致預(yù)后不良[10]。因此，探索和開發(fā)可靠的預(yù)后生物標(biāo)志物對(duì)于預(yù)測(cè)BUC患者的預(yù)后及治療至關(guān)重要。

LncRNA不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，但可通過染色質(zhì)重塑激活或沉默相關(guān)基因，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及細(xì)胞周期停滯等過程[11]。LncRNA NNT-AS1包含3個(gè)外顯子，位于染色體5p12區(qū)域，是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA分子。研究發(fā)現(xiàn)，與鄰近的非癌組織和正常細(xì)胞相比，LncRNA NNT-AS1在多數(shù)癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)，如消化系統(tǒng)腫瘤、女性生殖系統(tǒng)腫瘤等，且其高表達(dá)常與預(yù)后不良有關(guān)[12]。LncRNA NNT-AS1在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，可能通過上調(diào)凋亡蛋白表達(dá)從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[13]。Yao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NNT-AS1在前列腺癌細(xì)胞中明顯上調(diào)，抑制LncRNA NNT-AS1表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞的活力、增殖及遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。近年來研究顯示，LncRNA NNT-AS1在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可通過靶向調(diào)控miR-1301-3p促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞生長并激活Wnt通路，敲低其表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[5]。本研究中，BUC細(xì)胞組LncRNA NNT-AS1水平高于對(duì)照組，LncRNA NNT-AS1在癌組織中表達(dá)水平高于癌旁正常組織，且其水平與BUC患者腫瘤浸潤、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示LncRNA NNT-AS1可能通過促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移等參與BUC的疾病進(jìn)程。進(jìn)一步研究顯示，LncRNA NNT-AS1高表達(dá)患者總生存率低于低表達(dá)患者，其高表達(dá)預(yù)示著BUC患者預(yù)后不良。

miRNA同樣無編碼蛋白質(zhì)的功能，可通過靶向3′UTR區(qū)的互補(bǔ)序列調(diào)節(jié)基因表達(dá)，已有研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在癌癥中異常表達(dá)并參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展。miR-22在膀胱癌組織和癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-22可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其對(duì)癌細(xì)胞的生理過程的影響與靶向調(diào)控E2F轉(zhuǎn)錄因子3有關(guān)[15]。研究顯示，miR-22-3p可通過靶向神經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化1促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的化學(xué)抗性，有望成為膀胱癌患者預(yù)后生物標(biāo)志物[16]。本研究中，BUC細(xì)胞及癌組織中miR-22水平下降，與上述研究一致，且不同腫瘤浸潤、病理分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-22水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-22可參與BUC的發(fā)生、發(fā)展。此外，有研究表明，miR-22在BUC中異常表達(dá)，miRNA靶基因預(yù)測(cè)分析顯示，其有望成為BUC的靶向治療位點(diǎn)[17]。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-22高表達(dá)患者總生存率高于低表達(dá)患者，監(jiān)測(cè)miR-22水平能夠早期預(yù)測(cè)患者預(yù)后。有研究表明，LncRNA可與miRNA相互作用，共同影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，LncRNA可作為miRNA前體直接影響miRNA功能，也可作為競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA間接影響miRNA的調(diào)控作用[18]。也有研究表明，LncRNA NNT-AS1可與不同miRNA相互作用，參與多種惡性腫瘤的疾病進(jìn)程[5,7]。本研究雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LncRNA NNT-AS1與miR-22存在靶向關(guān)系，且通過繪制散點(diǎn)圖發(fā)現(xiàn)LncRNA NNT-AS1與miR-22表達(dá)在BUC癌組織中呈負(fù)相關(guān)，二者可能共同調(diào)控BUC的發(fā)生及發(fā)展，但具體機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。此外，LncRNA NNT-AS1高表達(dá)+miR-22低表達(dá)患者總生存率低于LncRNA NNT-AS1低表達(dá)+miR-22高表達(dá)患者及其他患者，亦提示二者可能共同影響B(tài)UC患者的預(yù)后，監(jiān)測(cè)二者水平有助于篩選出BUC預(yù)后不良高危人群，并及時(shí)采取相關(guān)治療措施以改善患者預(yù)后。

綜上所述，在BUC細(xì)胞及癌組織中LncRNA NNT-AS1表達(dá)上調(diào)，miR-22表達(dá)下調(diào)，LncRNA NNT-AS1與miR-22呈負(fù)相關(guān)，且均與患者臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)。但本研究仍有一定局限性，如納入BUC患者較少，且沒有分析LncRNA NNT-AS1、miR-22與患者隨訪期間復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，下一步我們將納入更多的患者，并充實(shí)研究內(nèi)容，從而更好地為BUC預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。