蔡嘉洛，朱貽霖，李曉屏，易剛強，夏新華，鄧桂明，童巧珍，黃莉

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙 410000；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙 410208）

糖尿病前期（pre-diabetes，PD）又稱為糖調(diào)節(jié)受損，是指由血糖調(diào)節(jié)正常發(fā)展為糖調(diào)節(jié)受損，為血糖升高但尚未達到糖尿病診斷標準的狀態(tài)[6.1 mmol/L≤空腹血糖（FPG）＜7.0 mmol/L，或者7.8 mmol/L≤餐后2 h血糖（2hPG）＜11.1 mmol/L]，糖尿病前期可進一步發(fā)展成為2型糖尿病[1]。然而，糖尿病前期一般沒有癥狀，不易被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者在健康體檢或因其他疾病檢查時發(fā)現(xiàn)。但糖尿病前期是一個可逆的過程，對該人群進行早期干預，可使2型糖尿病發(fā)病危險降低58%[2-3]。

根據(jù)中醫(yī)臨床特征，糖尿病前期歸屬于中醫(yī)的“脾癉”病范疇。糖尿病前期發(fā)病多與稟賦不足、飲食不節(jié)、情緒失調(diào)、勞逸失度等因素相關(guān)[4-5]。經(jīng)過長期臨床經(jīng)驗總結(jié)，本課題組認為，糖尿病前期病機為外邪攻伐脾胃，致脾氣虧虛，脾主運化功能失職，造成水濕內(nèi)停，濕邪內(nèi)生則發(fā)生本病，表現(xiàn)為脾虛痰濕證。建立并規(guī)范脾虛痰濕證糖尿病前期模型對于闡明該疾病機理具有重要的研究意義。本研究在以往動物模型的基礎(chǔ)上進行改良，旨在探索一種更好地模擬臨床糖尿病前期及符合中醫(yī)脾虛痰濕證候特點的病證結(jié)合動物模型，模型表現(xiàn)有精神萎靡，朦朧欲睡，毛發(fā)枯槁，體味增加，糞便黏稠，呼吸喘急，檢測指標總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）異常，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）正常，且6.1 mmol/L≤FPG＜7.0 mmol/L，或者7.8 mmol/L≤2hPG＜11.1 mmol/L。本實驗采用60%高脂飼料喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因BKS-db小鼠4周，同時結(jié)合強制游泳模擬疲勞因素建模，觀察模型小鼠宏觀表征和脾虛痰濕證指標，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單一因素造模實驗組均不能完全符合預期目標，而高脂喂養(yǎng)結(jié)合疲勞干預組模型表現(xiàn)則可符合預期目標，現(xiàn)將具體研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 40只無特殊病原微生物（specific pathogen free，SPF）雄 性BKS-db小 鼠（BKSLeprem2Cd479/Nju基因敲除小鼠，通過敲除瘦素受體Lepr導致出現(xiàn)自發(fā)的血糖升高），購自江蘇集萃藥康生物科技公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）20180008。動物實驗單位為湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，動物使用許可證號：SYXK（湘）2020-0010。常規(guī)飼料適應性喂養(yǎng)4 d，60 W日光燈照射（07∶00-21∶00），室內(nèi)溫度（20±3）℃。本實驗方案通過湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批（批件號：HN-LL-SWST-2021-02）。

1.2 試劑與儀器 基礎(chǔ)配方飼料，60%高脂配方飼料（60%脂肪、20%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)），購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司。高速冷凍離心機（美國Thermo公司）。血液樣本檢測由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科完成。

1.3 分組與造模 將40只BKS-db小鼠按照隨機數(shù)字表分為4組，分別為空白對照組（對照組）、高脂飼料喂養(yǎng)組（高脂組）、強制游泳組（游泳組）、高脂飼料喂養(yǎng)+強制游泳組（多因素組），每組10只。對照組：給予基礎(chǔ)配方飼料喂養(yǎng)4周。高脂組：給予60%高脂飼料喂養(yǎng)4周。游泳組：基礎(chǔ)配方飼料喂養(yǎng)，每日將小鼠放入高20 cm、直徑20 cm的圓柱形玻璃缸中，缸中水深10 cm，水溫（25±1）℃，每缸1只，每日強制游泳15 min，隨后取出放回籠中，持續(xù)4周。多因素組：給予60%高脂飼料喂養(yǎng)，同時每日強制游泳15 min，持續(xù)4周[6]。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 小鼠一般情況觀察 每周觀察并記錄各組小鼠的皮毛色澤、行為狀態(tài)、體質(zhì)量、呼吸狀態(tài)、大小便等外觀行為方面的變化。

1.4.2 生化檢查 造模4周后，禁食不禁水12 h，采用生化分析儀檢測小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT水平。

1.4.3 進食前后血糖測量 造模4周后，禁食不禁水12 h，通過尾尖采血的方式測量小鼠進食前后血糖的情況。具體操作方法：先將小鼠放置于單個操作籠中，將其固定并露出尾巴，用碘伏棉球擦拭消毒尾尖部，使用醫(yī)用剪刀剪尾至出微量血液，用血糖試紙采血后等待讀數(shù)，然后將小鼠尾尖碘伏消毒后放回原籠中。在測量完全部小鼠的FPG含量后，立刻給予葡萄糖灌胃，2、12、24 h后再次進行尾尖采血測量血糖值[6]。

1.4.4 脾虛痰濕證模型評估標準 脾虛證評估：根據(jù)脾虛表現(xiàn)分級量化標準（見表1），計算表中各項目得分之和即為脾虛積分，評價脾虛嚴重程度?？偡帧?分，為無脾虛；7分≤總分≤12分，為輕度脾虛；13分≤總分≤18分，為脾虛；19分≤總分≤24分，為重度脾虛。

表1 脾虛分級量化評分標準Table 1 Quantitative grading criteria for spleen deficiency

痰濕證評估：觀察各組小鼠形體、被毛、活動情況；采用生化分析儀檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C。若小鼠形體肥胖、被毛油膩、活動遲緩，血脂升高，則表明痰濕證造模成功[7-8]。

1.4.5 小鼠糖尿病前期診斷標準 當6.1 mmol/L≤FPG＜7.0 mmo1/L或7.8 mmo1/L≤2hPG＜11.1 mmol/L時，表明糖尿病前期模型造模成功[9]。

最后，根據(jù)脾虛痰濕證模型評估標準及糖尿病前期診斷標準，同時滿足兩者條件者即為脾虛痰濕證糖尿病前期模型。觀測各組的成模率以及模型制備質(zhì)量，從而對比出更佳的模型制備方法。

1.5 統(tǒng)計方法 應用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用成組設(shè)計的兩樣本均數(shù)的t檢驗分析，或采用成組設(shè)計的兩樣本以上的多樣本單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況 圖1結(jié)果顯示，對照組小鼠體質(zhì)量隨著時間的推移穩(wěn)步增長，高脂組和多因素組小鼠由于喂養(yǎng)高脂飼料的緣故，體質(zhì)量迅速增長，形成肥胖。游泳組小鼠因給予勞倦過度法造模，在第20～25 d周體質(zhì)量有所下降甚至減輕。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況Figure 1 Changes in body mass of mice in each group

2.2 各組小鼠一般情況比較 對照組小鼠毛發(fā)光澤，活動度良好，糞便呈顆粒固體狀。高脂組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)后出現(xiàn)肥胖，毛發(fā)油膩。游泳組小鼠在后期出現(xiàn)毛發(fā)泛黃，體味發(fā)臭，呼吸急促，大便濕爛。多因素組小鼠毛發(fā)泛黃，光澤度下降，肛門附近經(jīng)常殘留大便且黏膩，活動減弱。造模4周后，多因素組和游泳組由于每日游泳過度疲勞導致各有1只動物死亡。

2.3 各組小鼠脾虛積分比較 表2結(jié)果顯示：與對照組比較，游泳組、多因素組、高脂組造模4周后脾虛積分均升高（P＜0.01）。由表2數(shù)據(jù)可知，對照組無脾虛癥狀，高脂組為輕度脾虛，而游泳組與多因素組小鼠均表現(xiàn)為典型脾虛。

表2 各組小鼠脾虛積分比較Table 2 Comparison of the spleen deficiency scores among various groups of mice （±s）

表2 各組小鼠脾虛積分比較Table 2 Comparison of the spleen deficiency scores among various groups of mice （±s）

①P＜0.01，與對照組比較

組別對照組高脂組游泳組多因素組鼠數(shù)/只10 10 10 10脾虛積分/分5.1±1.8 16.2±2.1①18.8±2.0①9.2±1.7①

2.4 各組小鼠血脂水平比較 表3結(jié)果顯示，與對照組比較，多因素組和高脂組的TC、TG、LDL-C值明顯升高，HDL-C值及HDL-C/LDL-C比值明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。游泳組各項血脂指標水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠血脂水平比較Table 3 Comparison of levels of blood lipids among various groups of mice （±s）

表3 各組小鼠血脂水平比較Table 3 Comparison of levels of blood lipids among various groups of mice （±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與對照組比較

組別對照組高脂組游泳組多因素組鼠數(shù)/只10 10 10 10 TC/（mmol·L-1）1.3±0.3 2.4±0.4①1.2±0.1 2.4±0.7①TG/（mmol·L-1）2.0±0.1 4.1±0.1①2.0±0.3 4.1±0.4①HDL-C/（mmol·L-1）2.1±0.3 0.6±0.3①2.3±0.3 0.6±0.1①LDL-C/（mmol·L-1）0.4±0.1 2.1±0.1②0.5±0.1 2.4±0.1②HDL-C/LDL-C比值5.25±0.3 0.25±0.3②4.6±0.3 0.25±0.1②

2.5 各組小鼠的ALT值比較 表4結(jié)果顯示，與對照組比較，多因素組和游泳組的ALT值無顯著差異（P＞0.05），而高脂組ALT水平明顯上升（P＜0.01），表明高脂飼養(yǎng)單因素造?？梢鹦∈蟾喂δ艿膿p傷。

表4 各組小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）值比較Table 4 Comparison of alanine transaminase（ALT）value among various groups of mice[±s，（IU·L-1）]

表4 各組小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）值比較Table 4 Comparison of alanine transaminase（ALT）value among various groups of mice[±s，（IU·L-1）]

注：①P＜0.05，與對照組比較

組別對照組高脂組游泳組多因素組鼠數(shù)/只10 10 10 10 ALT 47.6±1.7 59.9±3.1①46.0±2.3 49.0±1.9

2.6 各組小鼠進食前后血糖值變化比較 造模4周后，對各組小鼠進食前，進食后2、12、24 h血糖進行測量。表5結(jié)果顯示，各組血糖值均升高，6.1mmol/L≤FPG＜7.0 mmol/L，或者7.8 mmol/L≤血糖值（進食后2、12、24 h）＜11.1 mmol/L，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表5 各組小鼠進食前后血糖值變化比較Table 5 Comparison of blood glucose changes among various groups of mice before and after feeding[±s，（mmol·L-1）]

表5 各組小鼠進食前后血糖值變化比較Table 5 Comparison of blood glucose changes among various groups of mice before and after feeding[±s，（mmol·L-1）]

組別對照組高脂組游泳組多因素組鼠數(shù)/只10 10 10 10進食前6.12±0.3 6.67±0.3 6.88±0.4 6.78±0.3進食后2 h 7.22±1.49 7.87±1.21 7.69±1.11 7.92±1.39 12 h 7.93±0.83 8.31±0.21 7.93±0.29 8.98±1.65 24 h 7.77±0.21 8.01±0.56 7.77±0.18 8.43±0.34

3 討論

糖尿病前期歸屬于中醫(yī)“脾癉”的范疇。脾癉的發(fā)生，主要與濕、痰二邪有關(guān)。然痰濕之邪久滯，往往損及正氣，如痰濕偏重，則損傷脾胃，造成濕邪困脾；痰濕久而化熱耗損陰液，最終轉(zhuǎn)化為消渴。因此，脾癉也是消渴的發(fā)病原因。有效控制甚至逆轉(zhuǎn)脾癉可有效控制消渴的發(fā)生[10]。

調(diào)查顯示，我國有大量患者處于糖尿病前期階段，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，確診人群以成人最為常見[3]。因糖尿病前期階段以及肥胖型2型糖尿病無明顯的臨床癥狀，故這部分人群極易被忽略。糖尿病前期最主要表現(xiàn)為血糖升高但尚未達到糖尿病診斷標準的狀態(tài)（6.1 mmol/L≤FPG＜7.0 mmol/L，或者7.8 mmol/L≤2hPG＜11.1 mmol/L）[1]，同時，伴隨與中醫(yī)脾虛痰濕證相似的體征表現(xiàn)。因此，脾虛痰濕型糖尿病前期動物模型模擬臨床糖尿病前期病例有較高的參考性[11-13]。

既往對脾虛痰濕證模型的研究多采用中醫(yī)學病因結(jié)合西藥藥理方法復合因素造模，往往造成模型動物臟器不可逆轉(zhuǎn)的損傷。中醫(yī)學病因法包括耗氣破氣法、苦寒瀉下法、饑飽失常法、過度勞累法等[14-16]。以往多使用大黃或者番瀉葉等藥物導瀉[17-19]。但大黃或者番瀉葉這些藥物的毒副反應較大。本研究選用轉(zhuǎn)基因BKS-db小鼠，模擬臨床上糖尿病前期疾病，并采用高脂飼養(yǎng)聯(lián)合強制游泳法的復合因素造模，以期可以更好地模擬臨床脾虛痰濕證且能有效避免藥物的毒副反應及對模型動物不可逆轉(zhuǎn)的損傷。

在既往研究的動物模型[7]基礎(chǔ)上，本研究對模型動物進行了改良，采用BSK-db小鼠造模。BSKdb小鼠的優(yōu)點在于空腹血糖值和體質(zhì)量可以始終維持在較高的水平，且與通過外部因素誘導胰島素抵抗或者糖尿病前期小鼠模型相比，BSK-db小鼠由于其自發(fā)血糖異常的特點，無外界干擾誘導。同時，與目前最常用的糖尿病前期小鼠模型的建立方法——高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量腹腔注射STZ法比較，本研究模型所采用的BSK-db小鼠是因瘦素（leptin）受體基因缺陷導致的先天肥胖性2型糖尿病小鼠，其因瘦素受體基因失去功能，在出生后2周內(nèi)即發(fā)生高胰島素血癥，3～4周發(fā)展為肥胖。而高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量腹腔注射STZ法構(gòu)建糖尿病前期小鼠模型的機制是通過高脂飲食誘導小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，通過注射STZ引起β細胞受損，其體型與正常小鼠體型無顯著差異，少見肥胖現(xiàn)象。因此，雖然高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量腹腔注射STZ造模法與BSK-db小鼠高脂喂養(yǎng)結(jié)合疲勞法造模均在一定程度上模擬了臨床糖尿病的癥狀，包括高血糖、高血脂、胰島素抵抗等，但本研究采用BSK-db小鼠高脂喂養(yǎng)結(jié)合疲勞法造模，能較好地綜合體現(xiàn)糖尿病前期脾虛痰濕證的各項生物體征及指標，更符合脾虛痰濕證糖尿病前期模型。

本研究結(jié)果顯示，多因素組脾虛積分維持在18分，游泳組脾虛積分維持在16分，均較對照組明顯升高，表明2組均出現(xiàn)明顯脾虛癥狀。同時，多因素組與高脂組出現(xiàn)TC、TG、HDL-C、LDL-C指標異常，表明符合痰濕證模型特征，對照組和游泳組血脂水平未出現(xiàn)異常。飼養(yǎng)4周后，高脂組ALT較對照組明顯升高，提示長期高脂喂養(yǎng)單因素可引起肝功能異常。各組小鼠均6.1 mmol/L≤FPG＜7.0 mmol/L，或 者7.8 mmol/L≤2hPG＜11.1 mmol/L，表明BSK-db小鼠是理想的自發(fā)性糖尿病前期動物模型。

綜合以上指標，高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合強制游泳復合因素造模較高脂單因素，脾虛癥狀更加明顯，且無ALT指標異常，較強制游泳單因素造模的小鼠血脂參數(shù)更符合痰濕證模型特征?？傮w來看，高脂飼料喂養(yǎng)合并強制游泳BSK-db小鼠表現(xiàn)為精神萎靡，朦朧欲睡，毛發(fā)枯槁，體味增加，糞便黏稠，呼吸喘急，TC、TG、HDL-C、LDL-C指標異常，而ALT指標無異常，符合脾虛痰濕證的體征，且6.1 mmol/L≤FPG＜7.0 mmol/L，或者7.8mmol/L≤2hPG＜11.1 mmol/L，因此可以作為脾虛痰濕證糖尿病前期模型的優(yōu)選模型。