熊偉，周鐵軍，佘琴，牟春如，楊成萬(wàn)

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川 瀘州 646000

肝細(xì)胞癌（HCC）是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。因早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)病情已進(jìn)展至中晚期，五年生存率極低。因此，研究HCC 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找新治療靶點(diǎn)，對(duì)于制定合理HCC治療策略，改善患者預(yù)后具有重要臨床意義［1］。真核翻譯起始因子6（eukaryotic initiation factor 6，EIF6），也被命名為ITGB4BP，是真核翻譯起始因子家族的重要成員之一，參與調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯起始過(guò)程［2，3］。EIF6 作為一種抗締合因子，能通過(guò)拮抗40S小核糖體亞基與60S亞基結(jié)合，影響延伸復(fù)合物80S亞基形成，發(fā)揮翻譯起始階段的限速作用［4］。鼻咽癌、膽囊癌、結(jié)腸癌等多種實(shí)體腫瘤的研究［5-7］表明，EIF6 表達(dá)異常與腫瘤的增殖、凋亡及不良預(yù)后有關(guān)。目前，EIF6在HCC 中的表達(dá)及其作用機(jī)制相關(guān)研究報(bào)道較少。我們觀察了HCC 組織中EIF6 的表達(dá)變化，并分析其與HCC 患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2014年12 月-2021 年8 月間收治的原發(fā)性HCC 患者116例，其中男103 例、女13 例；年齡29～84（53.99 ±10.38）歲；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥分期聯(lián)合委員會(huì)（UICC/AJCC）分期分為Ⅰ～Ⅱ期102 例、Ⅲ～Ⅳ期14 例；腫瘤直徑＜5 cm 者60 例，≥5 cm 者56 例；HCC 分化程度分級(jí)參照2019消化系統(tǒng)腫瘤WHO 分類標(biāo)準(zhǔn)分為高分化23例、中分化73例、低分化20例；存在血管侵犯45 例，無(wú)侵犯71 例；存在衛(wèi)星結(jié)節(jié)者26例，無(wú)90例；乙肝表面抗原（HBsAg）陽(yáng)性77例，陰性39例；均無(wú)術(shù)前放療、化療、介入治療等相關(guān)治療史。116例患者均行肝癌根治術(shù)，術(shù)后病理檢查明確診斷為原發(fā)性HCC，術(shù)中保存HCC 及癌旁組織石蠟標(biāo)本備用，標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定24 h 后取材，經(jīng)常規(guī)脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、染色。標(biāo)本獲取均按照倫理程序，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 HCC及癌旁組織EIF6檢測(cè) 取HCC及癌旁組織標(biāo)本，采用免疫組化Envision 兩步法檢測(cè)EIF6，所有操作均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。兔抗人EIF6多克隆抗體（1∶150）購(gòu)自上海賽信通生物試劑有限公司；DAB 顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液（粉劑）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；EDTA 抗原修復(fù)液（PH，9.0）購(gòu)自北京澳博森生物技術(shù)有限公司。采用雙盲法進(jìn)行結(jié)果判讀，由兩名資深病理醫(yī)師獨(dú)立閱片并對(duì)切片進(jìn)行判讀，評(píng)分一致性達(dá)95%，取平均值為最終評(píng)分。EIF6蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃色至棕褐色，顆粒狀或簇狀分布。染色強(qiáng)度評(píng)分為無(wú)著色計(jì)0分、淺棕黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、黃褐色計(jì)3分；隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡視野計(jì)算100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞百分比平均值，陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分為無(wú)著色計(jì)0 分、＜10%計(jì)1 分、10%～30%計(jì)2 分、＞30%計(jì)3 分。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分及陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分相乘為最終結(jié)果，0～2者為EIF6低表達(dá)，≥3者為EIF6高表達(dá)。

1.3 隨訪方法 臨床病理資料及生存隨訪數(shù)據(jù)從病歷檔案和電話隨訪中獲得。隨訪截至2022年1月24 日。將死于肝癌記為終點(diǎn)事件，生存時(shí)間均按月計(jì)算。116例患者中71例隨訪資料完整，45例失訪。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher 確切概率法；EIF6 蛋白表達(dá)與HCC 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系均采用χ2 檢驗(yàn)；EIF6 表達(dá)對(duì)HCC 患者生存期的影響采用Kaplan-Meier 法、用Log-rank 法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)；分別采用單因素和多因素Cox 回歸分析法分析HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 及癌旁組織EIF6蛋白表達(dá)情況 HCC 組織中EIF6 蛋白高表達(dá)76 例、低表達(dá)40 例，癌旁組織中EIF6 蛋白高表達(dá)12 例、低表達(dá)104 例。與癌旁組織比較，HCC組織EIF6表達(dá)升高（P＜0.05）。

2.2 不同臨床病理參數(shù)的HCC患者癌組織EIF6表達(dá)情況 不同臨床病理參數(shù)的HCC 患者癌組織EIF6表達(dá)情況見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)的HCC患者癌組織EIF6表達(dá)情況（例）

EIF6 表達(dá)與HCC 患者HBsAg、分化程度、TNM分期有關(guān)（P均＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、有無(wú)衛(wèi)星結(jié)節(jié)、有無(wú)血管侵犯無(wú)關(guān)（P均＞0.05）。

2.3 HCC 組織中EIF6表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響 71例HCC患者分為EIF6低表達(dá)者26例和EIF6高表達(dá)者45 例，中位生存時(shí)間為53 個(gè)月。Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，與EIF6 低表達(dá)者比較，EIF6高表達(dá)的HCC 患者生存時(shí)間短（P＜0.05）。不同EIF6表達(dá)的HCC患者的生存曲線見(jiàn)圖1。

圖1 不同EIF6表達(dá)的HCC患者的生存曲線

單因素Cox回歸分析結(jié)果表明，EIF6表達(dá)、TNM分期與HCC 患者預(yù)后有關(guān)（HR分別為8.590、0.313，P=0.037、0.032＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、HBsAg、有無(wú)衛(wèi)星結(jié)節(jié)、有無(wú)血管侵犯、分化程度等均無(wú)關(guān)（P 均＞0.05）。多因素Cox 回歸分析結(jié)果表明，EIF6 表達(dá)、TNM 分期均不是HCC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（HR 分別為7.129、0.485；P均＞0.05）。

3 討論

原發(fā)性肝癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，常見(jiàn)的組織學(xué)類型包括HCC 及膽管細(xì)胞癌，其中以HCC最為常見(jiàn)。HCC 的發(fā)生常常與肝炎病毒感染、黃曲霉毒素中毒、非酒精性脂肪肝病有關(guān)，我國(guó)以病毒性肝炎引起的HCC 尤為多見(jiàn)。目前臨床常用的治療手段包括手術(shù)治療、經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、放化療及分子靶向治療等方法。但因其惡性程度高、早期起病隱匿，確診患者大多為中晚期患者等特點(diǎn)，常導(dǎo)致臨床治療效果欠佳［8-9］。因此，研究HCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制顯得尤為重要。同其他實(shí)體腫瘤一樣，HCC 的發(fā)生是其基因出現(xiàn)異常所致。真核生物要完成基因表達(dá)需要兩個(gè)關(guān)鍵步驟，即轉(zhuǎn)錄和翻譯，而真核生物成熟信使RNA（mRNA）的翻譯是一個(gè)涉及了多種分子機(jī)制的復(fù)雜過(guò)程，該過(guò)程大致由起始、延長(zhǎng)、終止三個(gè)階段構(gòu)成［10-11］。該過(guò)程可被調(diào)控，而調(diào)控多發(fā)生在翻譯過(guò)程的起始階段，整個(gè)調(diào)控過(guò)程需要至少12 個(gè)蛋白質(zhì)因子參與，即真核翻譯起始因子（ElFs）［12-13］。

真核生物進(jìn)行翻譯起始過(guò)程的主要分子機(jī)制就是依賴于m7G 帽結(jié)構(gòu)的核糖體掃描機(jī)制（m7G capdependent scanning mechanism）。首先，40S 亞基與三元復(fù)合物（EIF2-GTP-Met-tRNAiMet）可通過(guò)翻譯起始因EIF1、EIF1A、EIF3 和EIF5 等的作用，結(jié)合形成43S 前起始復(fù)合物（preinitiation complex，PIC）；而EIF4E 能與mRNA 5'末端的m7G 帽結(jié)構(gòu)進(jìn)行綁定，進(jìn)一步激活mRNA。隨后，43S 復(fù)合物就與激活的mRNA 區(qū)域相互結(jié)合，43S 復(fù)合物沿著mRNA 從5'至3'的方向掃描5'UTR，直至起始密碼子AUG 處，此時(shí)60S 亞基加入，延伸復(fù)合物80S 形成，延伸過(guò)程開(kāi)始。其中EIF6 能夠通過(guò)與60S 亞基結(jié)合的方式，來(lái)拮抗60S 亞基與40S 亞基在翻譯起始階段的過(guò)早結(jié)合，從而阻止沒(méi)有mRNA 的80S 亞基的形成，以此來(lái)發(fā)揮其限速調(diào)節(jié)作用［10，14-16］。

EIF6 在膽囊癌［6］、鼻咽癌［5］、甲狀腺癌［17］、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［18］等多種惡性腫瘤中均有高表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)其與Shwachman-Diamond 綜合征等遺傳性疾病有一定關(guān)系［19］。多項(xiàng)研究均表明，EIF6 參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。在三陰性乳腺癌中，EIF6通過(guò)激活Myh9/Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，顯著增強(qiáng)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲［20］。同樣在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中也發(fā)現(xiàn)EIF6 存在高表達(dá)，在體外過(guò)表達(dá)EIF6 基因后發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等能力被顯著提升，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EIF6 蛋白和AKT 蛋白在胞質(zhì)中直接相互作用，提示該過(guò)程與AKT 相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)［21］。以上多項(xiàng)研究提示EIF6 作為影響翻譯起始的重要分子，可通過(guò)影響多條信號(hào)通路來(lái)參與實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展，未來(lái)有望作為腫瘤治療的靶點(diǎn)之一。

本研究通過(guò)免疫組化法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HCC 組織中EIF6 蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，且與HCC的分化程度以及TNM分期明顯相關(guān)，提示EIF6可能在HCC 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，EIF6 的表達(dá)與HCC 患者HBsAg 感染有關(guān)，提示乙肝病毒的感染可能也對(duì)EIF6 的高表達(dá)有促進(jìn)作用。通過(guò)Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)，EIF6 與HCC 的總生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，高表達(dá)患者的術(shù)后生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)患者，提示EIF6 高表達(dá)的HCC 患者預(yù)后更差。Cox 單因素分析結(jié)果表明，EIF6 表達(dá)水平、TNM 分期都是影響患者生存時(shí)間的相關(guān)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但Cox 多因素分析表明EIF6 表達(dá)水平尚不能作為影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，這可能與選取樣本量不足有關(guān)。在后續(xù)研究中可增加樣本數(shù)量，進(jìn)一步分析影響HCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

本研究為單中心、回顧性研究，且納入樣本量相對(duì)較小，且并未深入探討EIF6基因在HCC患者不良預(yù)后中的分子機(jī)制。因此，EIF6 基因是否能作為一個(gè)有效的腫瘤標(biāo)志物，今后還有待多中心、前瞻性且大樣本的研究進(jìn)一步探索。

綜上所述，HCC組織中EIF6高表達(dá)。EIF6高表達(dá)提示腫瘤惡性程度高、預(yù)后不佳，可作為影響HCC 患者預(yù)后的重要因素，但EIF6 表達(dá)、TNM 分期不是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。EIF6 可能參與HCC 的發(fā)生、發(fā)展，可作為HCC 不良預(yù)后的參考指標(biāo)及潛在治療靶點(diǎn)。