李素廷 洪 莉 洪莎莎

武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 湖北 武漢 430060

骨骼肌占人體總重的30%～40%，是調(diào)節(jié)機(jī)體代謝以及維持體內(nèi)平衡的重要組織。骨骼肌損傷后可依賴組織駐留的肌衛(wèi)星細(xì)胞（satellite cells，SCs）或通過細(xì)胞因子發(fā)揮直接或間接作用調(diào)節(jié)組織重塑［1］。初始炎癥反應(yīng)期、SCs 活化和增殖再生期以及再生肌纖維成熟重塑期是肌肉損傷后再生過程中的三個(gè)重要階段［2］。骨骼肌在維持機(jī)體生命活動(dòng)中有著無可替代的價(jià)值，在損傷過重或再生受損情況下肌肉功能難以達(dá)到有效修復(fù)，了解骨骼肌組織損傷及修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程，探尋維持肌肉再生的有效機(jī)制對(duì)于修復(fù)受損的肌肉組織具有重要價(jià)值。骨骼肌損傷的原因眾多，包括機(jī)械力造成的肌肉撕裂和挫傷等直接創(chuàng)傷［3］、由年齡或慢性壓力造成的間接損傷［4］，以及其他因素所致的肌肉病變?nèi)缂∥s側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、炎性肌病、肌肉營養(yǎng)不良等［5?7］，選擇合適的模型是深入探尋疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。本文通過綜述骨骼肌損傷動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，分析骨骼肌損傷后修復(fù)的調(diào)控機(jī)制，以為后續(xù)的研究提供參考。

1 肌肉損傷模型構(gòu)建

不同的肌肉損傷方案可以干擾組織的損傷?再生平衡程度，甚至改變?cè)偕^程及結(jié)果。有研究顯示Myf5 缺失小鼠在冷凍損傷后呈現(xiàn)再生表現(xiàn)，但是在心臟毒素（cardiotoxin，CTX）損傷后再生能力明顯減弱［8］。因此，了解不同方案對(duì)肌肉組織的破壞機(jī)制以及骨骼肌在這些條件下不同的反應(yīng)方式尤為重要。根據(jù)模型構(gòu)建的時(shí)間差異，可分為急性損傷及慢性損傷兩種類型。

1.1 急性肌肉損傷常用的急性肌肉損傷模型的構(gòu)建方式包括CTX、虎蛇毒素（notexin，NTX）、氯化鋇（BaCl2）、甘油等生物毒素或化學(xué)物品的肌肉注射［9?11］，冷凍、擠壓、牽拉或針刺等急性機(jī)械性損傷以及電擊傷等。CTX 注射是最為常用的造模手段。CTX 和NTX 是天然毒性蛋白質(zhì)，能夠抑制激酶C以及磷脂酶A（2PLA2）的活性，與肌膜上的受體結(jié)合并使膜產(chǎn)生破損，通透性小孔的存在導(dǎo)致肌纖維去極化以及大量的Ca2+內(nèi)流，從而損害肌肉功能；注射后易擴(kuò)散，能夠在在整個(gè)損傷后修復(fù)過程中呈現(xiàn)出均勻的肌纖維再生。但是由于CTX/NTX 屬于生物類毒素，其效果穩(wěn)定性相比于化學(xué)合成物BaCl2差［12］。冷凍損傷也是較為常用的肌肉損傷造模方式，通過液氮預(yù)冷后的鐵棒通過與暴露的肌肉組織直接接觸造成損傷，產(chǎn)生缺乏活細(xì)胞的“死區(qū)”，以及構(gòu)成再生細(xì)胞來源的遠(yuǎn)端保留區(qū)。相比毒素注射，冷凍損傷也會(huì)破壞脈管系統(tǒng)［12］，造成更為嚴(yán)重的SCs 損失。頓挫、牽拉傷在運(yùn)動(dòng)型損傷中的占比高達(dá)90%以上，鈍器打擊或自體/異物重量造成的頓挫撕裂損傷后的修復(fù)研究也具有一定的意義和價(jià)值［13］。電擊損傷是基于不可逆的電穿孔原理進(jìn)行，有效接受電擊的組織能夠完全受損但保持細(xì)胞外基質(zhì)的完整，適用于特定研究中。機(jī)械性損傷的不足在于模型穩(wěn)定性差，組織損傷不均勻，組織修復(fù)過程常涉及多種細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、相互作用。但在某些情況下，這種細(xì)胞由正常?損傷組織的定向遷移能力能為研究組織內(nèi)不同群體的定向遷移和滲透提供便捷。

1.2 慢性肌肉損傷慢性肌肉損傷的研究常是以某些疾病為基礎(chǔ)，如杜氏進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良（DMD）、ALS 等，其模型的多樣性遠(yuǎn)不如急性肌肉損傷。Mdx 小鼠（dystrophin 缺失）是常用的慢性損傷動(dòng)物模型，雖然Mdx 小鼠的肌肉功能受損程度弱于病人的表現(xiàn)，但是其骨骼肌處于較為頻繁的損傷?修復(fù)過程中，是研究骨骼肌損傷修復(fù)的最有效模型之一。ALS 特征是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性和死亡導(dǎo)致骨骼肌失神經(jīng)支配、萎縮，神經(jīng)肌肉接頭的功能障礙在ALS 的發(fā)作中起著至關(guān)重要的作用［14］。去神經(jīng)支配造成的肌肉功能損傷也是研究肌肉退行性病變的有效模型之一，以肌肉萎縮以及骨骼肌組織纖維化為主要表現(xiàn)［15］，修復(fù)過程伴隨著線粒體過氧化物、單胺氧化酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶等均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)［16］。

2 骨骼肌損傷后修復(fù)及調(diào)控相關(guān)因素

成人骨骼肌的組成主要是由終末分化的肌纖維組成，肌肉損傷后的修復(fù)主要由駐留于肌膜的靜止?fàn)顟B(tài)的SCs 激活后重新進(jìn)入細(xì)胞周期并參與肌纖維分化以完成修復(fù)或重建。肌肉功能的有效重建還需要其他肌肉組織中的細(xì)胞/因子調(diào)節(jié)，如纖維脂肪形成祖細(xì)胞（fibrocyte/adipocyte progenitors，F(xiàn)APs）、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞成分，以及胰島素樣生長因子1（insulin?like growth factor?1，IGF?1）、轉(zhuǎn)化生長因子?β1（transforming growth fac?tor?β1，TGF?β1）等細(xì)胞因子。

2.1 SCs 分化主導(dǎo)的肌纖維修復(fù)骨骼肌由肌纖維、神經(jīng)元、脈管系統(tǒng)和結(jié)締組織組成，其中骨骼肌的結(jié)構(gòu)和功能單元為肌纖維，每個(gè)肌纖維被內(nèi)膜（也稱為基底膜或基底層）包圍。SCs 處于肌纖維的質(zhì)膜之間，位于周圍的基底層下方和肌纖維質(zhì)膜外側(cè)，SCs 及同期有相互作用的周圍環(huán)境被稱為衛(wèi)星細(xì)胞龕。SCs 在正常情況下大都處于靜止?fàn)顟B(tài)，激活后重新進(jìn)入細(xì)胞周期。在此過程中，肌纖維的從頭合成分為兩個(gè)階段。第一階段是成肌細(xì)胞間的相互融合形成新生肌管，第二階段是新的成肌細(xì)胞融合到新生肌管中形成成熟肌纖維，表現(xiàn)為MyHC 以及其他肌肉收縮相關(guān)蛋白的表達(dá)增加。肌肉損傷后的修復(fù)過程受到關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如MyoD、MyoG、Myf5 等分子的調(diào)節(jié)，這些成分表達(dá)的時(shí)間及多少?zèng)Q定了SCs增殖與分化之間的平衡。盡管該肌肉損傷后修復(fù)過程中SCs 的作用已得到一定程度的闡釋，但是探索決定SCs 內(nèi)在數(shù)量及平衡的機(jī)制、了解調(diào)節(jié)肌肉肥大及萎縮的機(jī)制，從而對(duì)相關(guān)疾病或癥狀進(jìn)行有效預(yù)防或治療仍需要進(jìn)一步研究解決。

2.2 FAPs 的調(diào)節(jié)存在于肌間質(zhì)中，具有分化成成纖維細(xì)胞或脂肪細(xì)胞的特征，對(duì)SCs 的增殖以及終末分化有重要調(diào)控作用。FAPs 是促進(jìn)細(xì)胞分化因子的來源之一，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明FAPs 能夠通過分泌某些因子驅(qū)動(dòng)成肌細(xì)胞的分化和融合，并且能夠抑制白喉毒素所致的肌肉再生受損［17］。此外衰老會(huì)損害FAPs 的功能，衰老小鼠骨骼肌的FAPs 中WNT1 誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白1（WISP1）丟失，年輕小鼠體內(nèi)的FAP 移植或WISP1 添加治療可恢復(fù)老年小鼠中SCs 的成肌能力，促進(jìn)骨骼肌損傷后的再生修復(fù)［18］。FAPs 也是纖維化的主要來源，去神經(jīng)引起骨骼肌組織中FAPs 的逐步積累，細(xì)胞表現(xiàn)出持續(xù)的STAT3 激活并分泌較高水平的IL?6，從而促進(jìn)肌肉萎縮和纖維化。同時(shí)在小鼠脊髓損傷、脊髓性肌萎縮、ALS 患者的肌肉中發(fā)現(xiàn)了STAT3?IL?6信號(hào)異常激活的FAPs［19］。而在營養(yǎng)不良小鼠中，F(xiàn)APs 能夠分化成類似于成纖維細(xì)胞的基質(zhì)生成細(xì)胞。因此，F(xiàn)APs 在再生期間在肌肉生理學(xué)中發(fā)揮顯著的調(diào)節(jié)和營養(yǎng)作用。

2.3 神經(jīng)支配調(diào)控在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，有髓神經(jīng)軸突自神經(jīng)元胞體發(fā)出后，被施萬細(xì)胞所組成的髓鞘包繞。施萬細(xì)胞可通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞黏附分子等引導(dǎo)軸突生長錐的定向生長。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)、具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均有重要的調(diào)控作用。NGF 在發(fā)育中的肌肉中表達(dá)，并在再生受損的肌肉中再次升高，如肌營養(yǎng)不良癥、ALS，提示NGF 的表達(dá)可能與肌肉再生有相關(guān)性［20，21］。與NGF 類似，成人骨骼肌中腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)能夠使SCs 保持其靜止?fàn)顟B(tài)并防止其成肌分化，內(nèi)源性BDNF 的減少會(huì)導(dǎo)致早期的肌源性分化。這些數(shù)據(jù)表明神經(jīng)營養(yǎng)因子或同時(shí)能夠以自分泌方式起作用，調(diào)節(jié)SCs 的行為和肌肉的再生。

2.4 免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)正常情況下骨骼肌中駐留的免疫細(xì)胞較少，在損傷發(fā)生的早期階段，免疫細(xì)胞被快速募集。肌肉穩(wěn)態(tài)和再生涉及多種免疫細(xì)胞的相互作用，中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞是組織損傷后首先招募的細(xì)胞，在損傷后3 h 內(nèi)出現(xiàn)，它們通過分泌蛋白水解酶清除、吞噬壞死組織。巨噬細(xì)胞根據(jù)損傷后出現(xiàn)的時(shí)間可分為M1 與M2 兩種類型，不同類型的巨噬細(xì)胞具有不同的免疫調(diào)節(jié)功能，最終對(duì)肌肉再生過程發(fā)揮調(diào)控功能［11］。在老年肌肉中SCs 周圍的免疫細(xì)胞顯示出功能缺陷，自由基產(chǎn)生、吞噬作用和趨化作用的能力降低，這在一定程度上導(dǎo)致了老年骨骼肌再生功能的下降。

3 總結(jié)及展望

骨骼肌再生過程涉及多種細(xì)胞的相互作用，具有不同特性的細(xì)胞亞群提供了在再生過程中不同的推動(dòng)力。能夠同SCs 直接相互作用其他因素，如局部其他間質(zhì)細(xì)胞，血管及其相關(guān)的分泌因子也具有調(diào)節(jié)SCs 功能并影響肌肉再生的潛力。多年來骨骼肌一直用于再生干細(xì)胞生物學(xué)研究，但該領(lǐng)域仍然缺乏統(tǒng)一化的損傷和修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究方案，由于模型或者取材時(shí)間的差異，不同實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)的可比較性稍差。盡管已有大量研究顯示出有效的調(diào)節(jié)SCs 增殖、分化能力或者促進(jìn)其移植后修復(fù)能力的結(jié)果，但是SCs 移植后的低存活率和自我更新能力以及受限的運(yùn)動(dòng)能力等問題仍未解決。設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)化的骨骼肌疾病研究方案，開發(fā)SCs 更為有效的體外增殖以及體內(nèi)移植方法，在此基礎(chǔ)上深入研究SCs 活動(dòng)和分化行為的內(nèi)外調(diào)控機(jī)制，生物醫(yī)學(xué)工程的發(fā)展有望通過這些技術(shù)緩解肌肉相關(guān)疾病的患病及治療壓力。