金 晨，王若茜，劉 通，李運生

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，合肥 230036）

豬、牛、羊作為主要的畜牧動物，是重要的肉食來源，提升肉用家畜的產(chǎn)肉性能是人們育種的主要目標(biāo)。肌肉生長抑制素基因（Myostatin，MSTN）主要表達于肌肉組織，參與骨骼肌負(fù)向生長調(diào)控。當(dāng)MSTN缺失時家畜瘦肉產(chǎn)量和嫩度會大幅提高［1］。故對其進行基因編輯，是培育出具有優(yōu)良肌肉性狀家畜的有效方法。文章主要就豬、牛、羊MSTN基因編輯實例進行總結(jié)論述，包括基因編輯手段、編輯效率、編輯后表型等方面，為今后家畜MSTN基因編輯提供參考。

1 MSTN基因概述

1.1 MSTN基因研究背景

1807年，G.Culley首次發(fā)現(xiàn)了“雙肌”牛，該種牛呈現(xiàn)出前后肢、胸部和一些支持性的中肌和前肌異常發(fā)達、皮下脂肪很少、皮膚薄而瘦的特點，完美符合人們對優(yōu)良肉質(zhì)的需求。1997年，美國約翰斯·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的A.C.Mcpherron等人首先從小鼠骨骼肌cDNA中克隆出一種新的基因，該基因具有轉(zhuǎn)錄生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族的典型結(jié)構(gòu)，但與其他基因成員的同源性較低，被列為新的TGF-β超家族成員，即生長分化因子8（growth and differentiation factor 8，GDF-8）。在研究過程中，該團隊通過靶向破壞GDF-8基因發(fā)現(xiàn)，基因突變動物比野生型動物體型更大，并且骨骼肌顯著增加，突變動物的個體肌肉重量是野生型動物的2～3倍。種種跡象均表明GDF-8是骨骼肌生長的負(fù)向調(diào)節(jié)劑，肌肉生長抑制素由此得名［2］。為了證明“雙肌”牛是否與MSTN相關(guān)，科研人員在1997年通過基因連鎖將牛的該基因定位到與肌肉肥大（muscular hypertrophy，MH）基因座相同的區(qū)間［3］。同年，比利時藍牛被發(fā)現(xiàn)在MSTN編碼區(qū)有一段11 bp的缺失導(dǎo)致了移碼突變，從而造成自該堿基缺失后第14個密碼子起停止翻譯。同樣在皮埃蒙特牛相同的編碼區(qū)上發(fā)現(xiàn)，第941位的G-A轉(zhuǎn)換突變，使得氨基酸314位的半胱氨酸被酪氨酸取代。這些變化都導(dǎo)致了“雙肌”表型產(chǎn)生［4］。隨后，大鼠、豬、綿羊、山羊、雞、人、狒狒、鯰魚等物種的MSTN基因信息都被陸續(xù)發(fā)掘出來，對MSTN的研究也逐步深入。

1.2 MSTN基因結(jié)構(gòu)

在常見的豬、牛、羊等家畜中，MSTN基因均含有375個氨基酸殘基，其基因編碼區(qū)均含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。在產(chǎn)生作用前，MSTN會先合成前體蛋白，該前體蛋白由三部分組成：信號肽、編碼前肽（N端）和成熟的編碼肽（C端）。該前體蛋白N端和C端區(qū)域之間有一個蛋白水解加工點［5］。前體蛋白合成后會被不同的蛋白酶酶解加工（去除信號肽、蛋白酶切割位點的切割），從而產(chǎn)生N-端前肽和C-端多肽兩部分，后者通過二硫鍵組成二聚體，成為MSTN成熟蛋白并分泌至血液循環(huán)中，進一步與N-端前肽以非共價鍵形式形成一種潛伏蛋白（LAP），最終在BMP-1／TLD裂解前肽后，MSTN成熟蛋白被激活，與細胞膜上的特異性受體結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)功能［6］。與TGF-β超家族成員類似，MSTN同樣具備以下四個特征：（1）N端有一個信號肽序列，可以穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；（2）與生物活性區(qū)相鄰的一個由4個氨基酸組成的蛋白質(zhì)分解加工點（RSRR，位置是263～266位）；（3）C-末端有一個生物活性區(qū)，含有9個保守的半胱氨酸的生物活性位點，可以形成“Cys Knot”結(jié)構(gòu)；（4）C-末端通過形成二硫鍵組成二聚體發(fā)揮功能。

1.3 MSTN基因功能

MSTN基因的關(guān)鍵功能是對骨骼肌進行調(diào)控，主要分為以下幾條途徑：一是激活SMAD經(jīng)典通路。MSTN首先與激活素受體結(jié)合，導(dǎo)致Smad2／3磷酸化并與Smad4形成復(fù)合物，從而干擾MyoD的轉(zhuǎn)錄活性并抑制由MyoD誘導(dǎo)的成肌細胞的肌原性分化，抑制MSTN信號傳導(dǎo)［7］。二是激活MAPKs通路。MSTN通過不同方式激活MAPKs通路，包括JNK通路［8］、p38MAPK通路［9］和ERK1／2通路［10］，從而抑制肌肉生成因子的表達。三是抑制Akt通路。正常情況下，Akt會在胰島素和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的相互作用下發(fā)生磷酸化，誘導(dǎo)mTOR進行調(diào)控，同時還會抑制叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FoxO）家族的成員。肌細胞增殖期間，F(xiàn)oxO以潛伏的磷酸化形式位于細胞質(zhì)中。分化開始后，F(xiàn)oxO會轉(zhuǎn)移到細胞核，并與DNA結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。而Akt會通過磷酸化FoxO調(diào)節(jié)其活性，從而使FoxO保留在細胞質(zhì)中。但病理情況下，去磷酸化的Akt無法抑制FoxO，導(dǎo)致其在細胞核中積累，與DNA結(jié)合并誘導(dǎo)E3泛素連接酶MURF-1和Atrogin-1轉(zhuǎn)錄，參與蛋白質(zhì)降解［11］。此外，MSTN基因敲除小鼠模型驗證了該基因也可調(diào)控脂肪［12］。

2 家畜MSTN基因編輯進展

基因編輯也稱基因組編輯或基因組工程，是一種新型的基因工程技術(shù)，可改變生物體基因組中的特定靶基因，能夠高效地進行靶向基因組編輯，在基因研究、基因治療和遺傳改良方面顯示出巨大的潛力。常用的基因編輯工具有Cre／LoxP（Cre重組酶和一段叫做LoxP位點的DNA序列組成的重組酶系統(tǒng)）、鋅指核糖核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）、規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（CRISPR／Cas9）、單堿基編輯技術(shù)（base editor）及最新的先導(dǎo)編輯技術(shù)（Prime editing）［13］。其中，RNA引導(dǎo)的CRISPR／Cas9系統(tǒng)在農(nóng)作物和動物中都展示出其高效、廣泛、通用的優(yōu)點，成為當(dāng)前主流基因編輯方案。而豬、牛和羊作為重要的畜牧物種，提高其產(chǎn)肉效率是科研人員的主要目標(biāo)，因此負(fù)向調(diào)控肌肉性狀的MSTN成為家畜基因編輯中的明星基因。

2.1 豬MSTN基因編輯進展

豬是與人類比較接近的家畜模型，具有性成熟早、繁殖周期短、每窩產(chǎn)仔數(shù)多的優(yōu)點。隨著體細胞核移植技術(shù)和基因組編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，使高效生成基因編輯大動物成為可能，而負(fù)向調(diào)控肌肉生長的MSTN基因成為了基因編輯豬的主流選擇。豬MSTN基因編輯實例見表1。

表1 豬MSTN基因編輯實例Tab.1 Exam p le of MSTN gene editing in pigs

豬的MSTN基因編輯嘗試較多，加之大多使用體細胞核移植（somatic cell nuclear transplantation，SCNT）的緣故，仔豬基因編輯效率較高。在除SCNT以外的其余方法中，仔豬純合突變率較低，如F.Tanihara等［15］和Song R.G.等［22］的研究中，仔豬MSTN純合突變效率只有20%，其他研究中有的未出現(xiàn)純合突變仔豬［21］。MSTN基因編輯仔豬整體出生率較高，但部分結(jié)果顯示出生后的仔豬存活時間較短，存活仔豬體重和生長速度均高于野生型。同樣，不同品種豬的體重與野生型出現(xiàn)顯著差異的時間不同，如采用MSTN-KO技術(shù)的湖北白豬在4～6月齡體重出現(xiàn)顯著性變化［16］，而巴馬豬在3月齡時就已經(jīng)出現(xiàn)了顯著性變化［23］。

肌肉表型上，MSTN基因編輯仔豬出現(xiàn)明顯的雙肌表型，主要在背部、臀部和后腿出現(xiàn)更寬闊的肌肉。但不同試驗中出現(xiàn)明顯變化的部位也不相同，如Peng D.W.等［24］報道：基因編輯仔豬肩部肌肉變化明顯；對肌纖維分析發(fā)現(xiàn)，基因編輯仔豬的單位面積肌纖維數(shù)量顯著高于野生型，但是肌纖維大小不變，故肌肉量增加是由于肌纖維增生而不是肥大［20］。 有趣的是，在ZFN方法編輯的梅山豬中，有部分突變豬出現(xiàn)15個胸椎［26］（正常為14個），這在野生型豬中尚未發(fā)現(xiàn)，同時該現(xiàn)象在其他基因編輯中也未發(fā)現(xiàn)?？梢钥隙ǖ氖?，MSTN對骨骼的形成和維持有影響，但為什么該現(xiàn)象只在此基因編輯豬中出現(xiàn)，是否與基因編輯方法或豬品種有關(guān)？具體機制還有待進一步研究。無論如何，胸椎數(shù)量與豬肉產(chǎn)量之間存在正相關(guān)關(guān)系，胸椎數(shù)量增加與豬肉生產(chǎn)經(jīng)濟效益相關(guān)，研究其中存在的機制對豬育種有著很大幫助。除此以外，還有部分MSTN基因編輯豬出現(xiàn)跛行現(xiàn)象［18］，這可能與MSTN突變導(dǎo)致的豬隱性腿無力綜合征有關(guān)［28］。

2.2 羊MSTN基因編輯進展

綿羊和山羊由于體型適宜，性情溫順，是最早的家養(yǎng)動物之一，可提供多種產(chǎn)品，包括羊毛、羊皮、肉類和奶制品。對MSTN進行基因編輯，是培育出具有優(yōu)良肌肉性狀羊的有效方法。羊MSTN基因編輯實例見表2。

表2 羊MSTN基因編輯實例Tab.2 Exam p le of MSTN gene editing in sheep

山羊和綿羊的MSTN基因編輯大多使用的是CRISPR／Cas9和TALENs技術(shù)，從編輯效率來說CRISPR／Cas9顯著高于TALENs，CRISPR／Cas9的敲除效率是TALENs的2.24倍［47］。在使用顯微注射（microinjection，MI）生產(chǎn)基因編輯羊的實例中，羔羊MSTN純合突變率也較低，如在綿羊中報道的有0［30］、25%［32］和36.4%［29］，山羊中為33%［42］。

與預(yù)期相似，MSTN編輯后的羔羊體重會重于野生型（WT），背部、臀部和后腿部肌肉變化較為明顯，但是每項研究出現(xiàn)體重顯著性差異的時間有所不同。在綿羊中，M.Crispo等［29］的基因編輯羔羊在出生時體重和WT組沒有差異，出生第15，30天時出現(xiàn)較大差異，第60天時超出20%～30%。其余如Zhou S.W.等［32］、Li H.H.等［36］的研究中，編輯羔羊出現(xiàn)顯著差異的時間點大致相同，于出生后30，60，90天都表現(xiàn)出顯著差異。也有研究者報道，羔羊體重在第60，90天未表現(xiàn)出明顯差異，但在150～240 d表現(xiàn)出顯著差異［31］。Ding Y.等［34］的研究中，基因編輯羔羊表現(xiàn)出與其他研究不同的變化，在0～60 d內(nèi)體重存在顯著差異，在90～180 d，基因編輯組體重高于WT組，但差異不顯著。

在山羊上，He Z.Y.等［42］的基因編輯山羊表現(xiàn)出與綿羊不同的體重變化，基因編輯山羊在第0，20，36，60，90，120天的體重與WT山羊均沒有顯著差異，但在第210天的體重顯著高于WT山羊。出現(xiàn)這種不同可能與研究人員使用的綿羊和山羊品種不同有關(guān)，遺傳內(nèi)在差異導(dǎo)致基因編輯后的羔羊出現(xiàn)不同的表型，具體的影響機制還需要進一步探索。

2.3 牛MSTN基因編輯進展

牛同樣也是重要的畜牧物種之一，特別是在動物蛋白供應(yīng)上，來自牛和水牛的牛奶及肉類占全球動物蛋白供應(yīng)的45%［48］。因此增加牛肉產(chǎn)量和提高牛肉品質(zhì)顯得尤為重要，選擇敲除負(fù)調(diào)控肌肉的MSTN基因也就成了科研人員的首要目標(biāo)。牛MSTN基因編輯實例見表3。

表3 牛MSTN基因編輯實例Tab.3 Exam p le of MSTN gene editing in cattle

相比于豬羊，牛MSTN基因編輯實例較少。牛MSTN基因編輯效率也比較低，大多數(shù)低于50%，出生率也相對較低，這說明牛MSTN基因編輯仍存在很多問題。MSTN基因編輯牛同樣也出現(xiàn)了雙肌表型，肩、髖部出現(xiàn)肌肉生長。由于基因編輯實例過少，未發(fā)現(xiàn)特殊的編輯表型。但有一個有趣的現(xiàn)象是在韓國肉牛基因編輯中，發(fā)現(xiàn)在細胞和胚胎試驗時出現(xiàn)了多種突變模式，而所有基因編輯犢牛只發(fā)現(xiàn)了一種MSTN突變模式［49］。這表明其他的突變模式可能在胚胎移植后的某個時間段具有致死性，但對此缺乏試驗證明，需要進一步研究。

3 家畜MSTN基因編輯存在問題及發(fā)展趨勢

目前MSTN基因編輯在多種家畜上都已經(jīng)取得不錯的進展，在編輯效率和脫靶效應(yīng)等方面都在不斷改進。然而應(yīng)用到生產(chǎn)實際中仍需面對很多挑戰(zhàn)。如生產(chǎn)基因編輯動物的方法仍存在缺陷，生產(chǎn)MSTN基因編輯家畜是否安全及多基因聯(lián)合編輯效率低等。特別值得注意的是，所有文章均未闡明SNP突變是否會改變MSTN基因在家畜各組織中的表達模式和是否會引發(fā)其他問題，這需要進一步試驗證明。

3.1 基因編輯效率仍舊較低

當(dāng)前生產(chǎn)基因編輯動物的主流方法是顯微注射法（MI）和體細胞核移植法（SCNT）。通過顯微注射進行基因編輯的生產(chǎn)過程，一般是胚胎在顯微注射后不經(jīng)過基因編輯效率檢測而直接將胚胎移植到受體體內(nèi)，在胎兒出生后再檢測基因編輯效率。由于家畜妊娠時間較長，使得試驗周期較長、科研經(jīng)費投入較高。因此，提高胚胎基因編輯效率顯得尤為重要。然而，目前顯微注射基因編輯效率還不能令人滿意。例如，在已經(jīng)發(fā)表的利用顯微注射法生產(chǎn)基因編輯MSTN羊的研究中，MSTN基因突變山羊占總出生 山 羊 的 比 率 分 別 為26.5%［41］、20%［43］和75%［42］。在綿羊上的編輯效率為分別為5.7%［35］、15.6%［37］和45.5%［29］。體細胞核移植技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了20年，但克隆大家畜出生率仍舊較低。雖然近年來一些基于早期克隆胚胎表觀遺傳修飾機制的研究提升了克隆動物胚胎的生產(chǎn)效率，但由于物種特異性差異，需要研究者深入解析不同家畜早期克隆胚胎發(fā)育的表觀遺傳機制，其成果有助于進一步提升基因編輯動物的生產(chǎn)效率。

3.2 基因編輯家畜健康問題

基因編輯動物健康問題一直被人們所關(guān)注，特別是像豬、牛、羊這樣的家畜，其基因編輯后代是否健康是關(guān)系到能否大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)的關(guān)鍵。目前，MSTN基因編輯家畜的存活率仍較低，例如在研究中，基因編輯仔豬在一周內(nèi)全部死亡［14］，甚至還有的24 h存活率僅為50%，存活的仔豬還出現(xiàn)了跛行現(xiàn)象［18］。這種死亡可能是由于體細胞核移植產(chǎn)生基因編輯動物的缺陷引起的，因為通過顯微注射生產(chǎn)基因編輯豬存活率可達80%［22］。但在羊的研究中，使用顯微注射產(chǎn)生了22只羔羊，有3只在出生第1天死亡，其中2只為MSTN突變羔羊，且死亡的MSTN基因編輯幼畜大多為雙等位基因突變。顯微注射實例雖較少，但也足以警示人們，MSTN突變的家畜可能存在健康問題，特別是純合突變家畜。之前的研究也發(fā)現(xiàn)，缺乏MSTN基因的動物會表現(xiàn)出類似巨型胎兒綜合癥的疾?。?2］，MSTN純合突變的比利時藍牛會出現(xiàn)包括肺在內(nèi)的多個器官體積減?。?3］；MSTN純合敲除仔豬表現(xiàn)為前后肢異常、不能站立和行走，患病仔豬無法競爭哺乳并在出生后3 d內(nèi)死亡（該結(jié)果尚未發(fā)表）［54］?；蚓庉嫾倚蟮哪康氖菫榱水a(chǎn)生優(yōu)良性狀，但若編輯家畜存活率低、優(yōu)良性狀無法表現(xiàn)，同時會導(dǎo)致無法應(yīng)用于未來大規(guī)模生產(chǎn)。因此，MSTN基因編輯家畜的健康需要更全面的評估，如何設(shè)計生產(chǎn)出健康、與野生型無異的基因編輯幼畜一直是亟待解決的問題。

3.3 未來發(fā)展趨勢

圍繞基因編輯家畜MSTN基因的一系列問題，可以先從MSTN基因本身入手，運用分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)掘更多上下游基因和結(jié)合位點，同時解析MSTN基因在不同家畜上的多態(tài)性，使用高通量測序及轉(zhuǎn)錄子分析技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)方法，尋找有效的自然突變位點，為基因編輯打下基礎(chǔ)。除加深對基因本身的研究外，改良使用工具也至關(guān)重要。單堿基編輯技術(shù)（base editing）是一項基于CRISPR／Cas9開發(fā)出的全新技術(shù)，目前能夠?qū)崿F(xiàn)堿基C到T、A到G［55］及C到G［56］的自由變換。對現(xiàn)有的文章進行檢索，沒有發(fā)現(xiàn)利用單堿基編輯技術(shù)對?；蜓虬∕STN基因在內(nèi)的多個基因進行編輯的報道，而在豬上單堿基編輯技術(shù)已經(jīng)同時被應(yīng)用于對CD163、IGF2和MSTN基因進行編輯，仔豬中這些基因均發(fā)生了需要的突變，編輯效率為100%。因此在羊和牛多基因編輯上可以嘗試單堿基編輯，以提高效率、優(yōu)化育種。而面對有些文章提到的MSTN編輯安全問題，死亡大多出現(xiàn)在純合敲除MSTN動物上，但如果使用單堿基編輯技術(shù)、不敲除MSTN基因，而是使用上述研究發(fā)現(xiàn)的SNP突變位點對其進行突變，生產(chǎn)肉質(zhì)優(yōu)良的家畜，可能是一種有效的解決基因編輯動物健康問題的方法。在動物育種方面，可以選擇不同物種的動物，比如在豬、牛上發(fā)現(xiàn)了一些有效的SNP位點，且這些位點位于豬、牛、羊MSTN共同序列上，但在羊上未見突變報道，就可以在羊上運用單堿基編輯技術(shù)對其進行突變，研究該位點突變是否會對生長發(fā)育造成影響。同樣不只是單堿基編輯技術(shù)，先導(dǎo)編輯技術(shù)在SNP突變方面更具優(yōu)勢。它可有效實現(xiàn)所有12種堿基的自由轉(zhuǎn)換，而且還能有效實現(xiàn)多堿基的精確插入與刪除［57］，擴大了基因編輯范圍，可實現(xiàn)更多自然位點突變。除此以外，還有改造Cas蛋白的多種新型CRISPR工具，如Cas12iMax、Cas12iHiFi［58］等，它們在實現(xiàn)高特異性編輯的同時，能夠識別更多的PAM位點，突破編輯窗口單一限制，在今后的MSTN基因編輯過程中可提供更多的sgRNA選擇，實現(xiàn)更高效的編輯。這些新技術(shù)產(chǎn)生的同時也面臨著新的挑戰(zhàn)，如先導(dǎo)編輯的編輯效率低、prgRNA設(shè)計困難，單堿基編輯容易脫靶等。但基因編輯也是一項不斷發(fā)展進步的技術(shù)，最新研究表明，單堿基編輯技術(shù)實現(xiàn)了單窗口編輯，大大提高了編輯精確性［59］。先導(dǎo)編輯也在不斷優(yōu)化Cas9蛋白，從而提高編輯效率，增大應(yīng)用范圍［60］。因此，未來家畜MSTN基因編輯發(fā)展的主要方向依然是改良原技術(shù)、創(chuàng)造新技術(shù)。

4 結(jié)語

MSTN作為重要的肌肉生產(chǎn)調(diào)控基因，在動物育種方面意義重大。雖然目前MSTN基因編輯家畜實例很多，編輯方法也逐漸完善，但仍存在一些問題有待解決。因此，繼續(xù)深入研究家畜MSTN基因功能、優(yōu)化基因編輯方法，是高效生產(chǎn)MSTN基因編輯動物的基礎(chǔ)。相信隨著基因編輯技術(shù)的不斷完善，和對MSTN基因編輯動物的不斷了解，MSTN基因編輯家畜必將為促進畜牧業(yè)生產(chǎn)高效發(fā)展做出貢獻。