肖 成，劉 宇，吳 健，2，趙玉民，2，曹 陽(yáng)*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 公主嶺 136100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉牛遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130000）

隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，對(duì)高品質(zhì)牛肉的需求越來(lái)越大。擁有大理石花紋的牛肉不僅風(fēng)味好、口感佳，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也更為豐富，同時(shí)花紋的多少也直接影響消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)決策。高品質(zhì)牛肉擁有更廣闊的市場(chǎng)，同時(shí)也具有更高的銷售價(jià)格。沃金黑牛是吉林省皓月集團(tuán)為了滿足市場(chǎng)需求而培育的肉牛品種，是以黑毛牛為父本、延邊牛為母本，采用“級(jí)進(jìn)雜交＋精準(zhǔn)選擇”的方法繁育而成，是具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的牛品種［1］。通過(guò)多年培育及對(duì)黑牛群體生產(chǎn)數(shù)據(jù)精確的測(cè)量和記錄發(fā)現(xiàn)，沃金黑牛具有產(chǎn)肉率高、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)好等特點(diǎn)，但與日本和牛相比生長(zhǎng)及肉質(zhì)性狀仍存在一定差距。為了不斷選育更優(yōu)秀個(gè)體、提高群體肉質(zhì)性狀，科研人員致力于采用分子育種與常規(guī)育種相結(jié)合的方法提高選育強(qiáng)度。影響家畜生長(zhǎng)率及肉品質(zhì)的因素很多，其中遺傳因素是影響生長(zhǎng)以及肉質(zhì)性狀的重要因素之一。有研究表明，IGF-1、GH等基因調(diào)控生長(zhǎng)激素，影響家畜的生長(zhǎng)性狀，同時(shí)PPAR、LPL等基因調(diào)控脂肪沉積量，對(duì)肉的嫩度、風(fēng)味等有明顯影響［2-5］。通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)及育種技術(shù)篩選優(yōu)秀個(gè)體、提高生長(zhǎng)速度、增加肌內(nèi)脂肪含量，是提高我國(guó)自主培養(yǎng)品種經(jīng)濟(jì)性狀的主要研究方向。

研究表明，Axin相互作用蛋白（Axin interactor dorsalization associated，AIDA）基因可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)途徑來(lái)降解脂肪合成代謝酶，從而導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)脂肪合成減少、降低脂肪在小腸內(nèi)的吸收率［6］。通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，sAIDA基因在動(dòng)物體內(nèi)具有重要的生理功能［7］。另有研究表明，AIDA基因能夠參與Wnt／βcatenin信號(hào)通路，從而影響三酰甘油的合成，降低脂肪細(xì)胞中脂滴的積累［8-10］。目前關(guān)于AIDA基因在小鼠及家畜脂代謝調(diào)節(jié)作用的研究較多，但基因本身序列是否存在與家畜經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的突變位點(diǎn)仍然未知。因此，本試驗(yàn)旨在探索AIDA基因可能存在的SNP位點(diǎn)，并與實(shí)際生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為提高沃金黑牛經(jīng)濟(jì)性狀提供新的分子標(biāo)記位點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及數(shù)據(jù)和樣品的采集

12月齡沃金黑牛62頭，其中公牛35頭、母牛27頭，來(lái)自吉林省長(zhǎng)春市皓月集團(tuán)。采用軟米尺對(duì)黑牛體高、十字部高、體斜長(zhǎng)、胸圍、腹圍、管?chē)M(jìn)行測(cè)量；采用B超儀對(duì)眼肌面積及背膘厚進(jìn)行測(cè)量，同時(shí)尾部靜脈采血，用于提取血液基因組。

1.2 主要試劑

血液基因組提取試劑盒，購(gòu)自Axygen生物公司；PCR反應(yīng)預(yù)混液，購(gòu)自康為世紀(jì)生物公司；一代測(cè)序及引物合成，由金唯智生物有限公司提供。

1.3 基因組提取及驗(yàn)證

血液保存于含抗凝劑的采血管中，取250μL血液用血液基因組提取試劑盒提取DNA，方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。所得DNA經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，檢測(cè)片段的完整性。完整性好的基因組通過(guò)超微量分光光度計(jì)測(cè)量其濃度以及純度，OD260／OD280值在1.8～2.1之間表示純度較好。將純度高、完整度好的DNA放置于-20℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 引物設(shè)計(jì)及PCR驗(yàn)證

以NCBI網(wǎng)站提供的牛AIDA基因組NM-001205634.1為參考，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)第10外顯子引物，引物信息見(jiàn)表1。從62頭沃金黑牛基因組中隨機(jī)選擇10頭牛的血液基因組進(jìn)行混池，并以其為模板對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10μL，ddH2O 8μL，上下游引物各0.5μL，混池DNA 1μL，共20μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56.5℃退火30s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min，產(chǎn)物于12℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶單一代表其特異性良好。

表1 AIDA基因第10外顯子引物序列Tab.1 Prim er sequence of exon 10 of AIDA gene

1.5 Sanger測(cè)序、SNP統(tǒng)計(jì)及關(guān)聯(lián)分析

對(duì)特異性好的引物進(jìn)行混池PCR反應(yīng)，產(chǎn)物特異性好的直接進(jìn)行Sanger測(cè)序。查看測(cè)序結(jié)果，尋找可能存在的SNP位點(diǎn)，然后對(duì)每頭牛的基因組進(jìn)行PCR試驗(yàn)及測(cè)序，檢測(cè)此突變位點(diǎn)在62頭牛中的基因型分布情況。統(tǒng)計(jì)突變位點(diǎn)每頭牛的基因型，計(jì)算基因頻率、基因型頻率、雜合度、PIC含量及氨基酸變化情況等。由于公母牛的生產(chǎn)數(shù)據(jù)存在差異，為了避免數(shù)據(jù)差異對(duì)關(guān)聯(lián)分析造成干擾，公牛、母牛分別統(tǒng)計(jì)生產(chǎn)數(shù)據(jù)，與不同基因型進(jìn)行的關(guān)聯(lián)分析。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

沃金黑牛生產(chǎn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。不同基因型與實(shí)際生產(chǎn)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，采用單因素方差分析及LSD法進(jìn)行多重比較，P＜0.05差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AIDA基因引物特異性驗(yàn)證

通過(guò)PCR試驗(yàn)和瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AIDA基因第10外顯子片段的引物特異性良好，可用于下一步試驗(yàn)。AIDA基因第10外顯子PCR產(chǎn)物電泳圖譜見(jiàn)圖1，條帶為980 bp，與目的片段大小符合。

圖1 AIDA基因第10外顯子PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic pattern of PCR products in exon 10 of AIDA gene

2.2 AIDA基因第10外顯子多態(tài)位點(diǎn)分析

通過(guò)對(duì)沃金黑?；蚪MPCR以及Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在AIDA基因第10外顯子89 bp處，也就是Chr16：26159088存在A／C突變，見(jiàn)圖2。此突變位點(diǎn)存在3種基因型，分別是CC、CA、AA型，CA為主要基因型，A為主效基因，見(jiàn)圖3。突變位點(diǎn)為中度多態(tài)，符合哈代-溫格伯定理。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。AIDA基因的第10外顯子的突變位點(diǎn)為錯(cuò)義突變，賴氨酸突變成谷氨酰胺。

圖2 沃金黑牛AIDA基因測(cè)序序列對(duì)比Fig.2 Comparison of AIDA gene sequencing sequence ofWojin Black cattle

圖3 沃金黑牛AIDA基因不同基因型峰圖Fig.3 Peaks of different genotypes of AIDA gene in Wojin Black cattle

表2 AIDA基因第10外顯子多態(tài)位點(diǎn)（Chr16：26159088位點(diǎn)）相關(guān)信息Tab.2 Related information of polymorphic locus（Chr16：26159088 locus）in exon 10 of AIDA gene

2.3 AIDA基因第10外顯子與生產(chǎn)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析

由于公母牛在生產(chǎn)數(shù)據(jù)上存在差異，試驗(yàn)將62頭沃金黑牛的生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了按性別分別統(tǒng)計(jì)，與AIDA基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，避免公牛、母牛生產(chǎn)數(shù)據(jù)的差距導(dǎo)致分析錯(cuò)誤，結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，在公牛組中基因型CC背膘厚顯著高于CA基因型（P＜0.05），而在母牛組中不同基因型在本次測(cè)量的生產(chǎn)數(shù)據(jù)中未出現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。

表3 AIDA基因第10外顯子不同基因型與生產(chǎn)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析Tab.3 Correlation analysis between different genotypes of exon 10 of AIDA gene and production data

3 討論

本研究還對(duì)黑牛不同階段的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行了測(cè)量。通過(guò)與其他牛品種的生產(chǎn)數(shù)據(jù)相比發(fā)現(xiàn)，沃金黑牛生長(zhǎng)及肉質(zhì)性狀高于同月齡草原紅牛，但低于日本和牛［11-14］。因此，沃金黑牛仍需要不斷提高選育強(qiáng)度以提高經(jīng)濟(jì)性狀。影響家畜肉質(zhì)性狀的因素很多，如營(yíng)養(yǎng)水平、飼喂條件、品種類型等，但具體原因是由于肌纖維組成種類、肌內(nèi)脂肪含量、氨基酸組成、脂肪酸組成等因素影響肉質(zhì)的口感、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等［15］。通常衡量家畜肉質(zhì)性狀都需要測(cè)定背膘厚、肌內(nèi)脂肪含量、眼肌面積等，這表明動(dòng)物本身的脂肪合成代謝及在肌肉內(nèi)的積累對(duì)于肉質(zhì)改善具有重要作用。動(dòng)物出生前，脂肪細(xì)胞的數(shù)量就已經(jīng)確定，因此參與脂肪細(xì)胞分化及代謝的基因決定了家畜后天脂肪積累的能力［16］。例如Wnt／β-catenin信號(hào)通路決定了間充質(zhì)干細(xì)胞分化方向，同時(shí)也可以誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞分化成成熟脂肪細(xì)胞［17］。C／EBPα、FABP4也促進(jìn)了脂肪細(xì)胞分化并且與動(dòng)物肉質(zhì)性狀相關(guān)［18-19］。而目前針對(duì)AIDA基因的研究也多數(shù)集中在調(diào)控脂肪代謝方面，同時(shí)有大量研究表明，AIDA基因是調(diào)控脂代謝的重要成員之一，與Wnt／β-catenin通路及脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ、C／EBPα、FABP4等基因相關(guān)［20］。本研究在前人的基礎(chǔ)上尋找可能與牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AIDA基因在第10外顯子處存在一個(gè)突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)與公牛背膘厚顯著相關(guān)。通常背膘厚較大的個(gè)體在適當(dāng)飼喂條件下脂肪囤積的能力更強(qiáng)，肉質(zhì)可能更好；AIDA基因此處突變導(dǎo)致賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０?。賴氨酸為極性帶正電荷的堿性氨基酸，而谷氨酰胺為極性不帶電荷的親水性氨基酸，這樣劇烈的變化將會(huì)影響其蛋白構(gòu)象、空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其蛋白質(zhì)表達(dá)水平或作用發(fā)生改變，從而導(dǎo)致表型可能出現(xiàn)不同。這方面內(nèi)容值得深入研究。本試驗(yàn)群體中，基因型CC沃金黑牛個(gè)體不多，但該突變位點(diǎn)符合哈代-溫伯格定律，表明試驗(yàn)結(jié)果可信。在12月齡母牛群體中只檢測(cè)到CC基因型1個(gè)個(gè)體，無(wú)法進(jìn)行數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，但可以確定公母牛背膘厚這項(xiàng)數(shù)據(jù)之間不具有顯著差異（P＞0.05）。由此看來(lái)，隨著測(cè)量數(shù)據(jù)的不斷擴(kuò)增，對(duì)其調(diào)控機(jī)制的深入探索，AIDA基因可能成為調(diào)控肉質(zhì)性狀重要的候選基因。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：AIDA基因Chr16：26159088處存在A／C突變，有AA、CA和CC三種突變型，且均為錯(cuò)義突變；氨基酸由賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０?；該位點(diǎn)處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）；關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性與雄性沃金黑牛牛背膘厚呈顯著相關(guān)（P＜0.05），基因型CC個(gè)體的背膘厚高于其他基因型。