趙磊 王一斐 薛國勇

(南陽市中心醫(yī)院 1藥劑科，河南 南陽 473000；2婦科)

卵巢癌是全球第二常見的婦科惡性腫瘤，由于卵巢惡性腫瘤早期病變多無癥狀、不易發(fā)現(xiàn)，約75%病例在晚期診斷出來〔1〕?；熓峭砥诼殉舶┑闹饕委熓侄?，紫杉醇(Taxol)在卵巢癌化療中尤為重要，其和順鉑的聯(lián)合應(yīng)用已成為卵巢癌患者的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，然而由于Taxol耐藥性的出現(xiàn)極大限制了其臨床應(yīng)用范圍，降低其臨床療效〔2，3〕。因此，探索卵巢癌進展和耐藥的分子機制對提高卵巢癌患者的生存率至關(guān)重要。近年研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在惡性腫瘤的進展和耐藥中發(fā)揮重要作用〔4，5〕。膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(BLACAT)1在胃癌奧利沙鉑耐藥組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，抑制其表達(dá)可促進胃癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移，提高胃癌細(xì)胞對奧利沙鉑的敏感性〔6〕；BLACAT1在非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥和阿法替尼耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，干擾其表達(dá)可降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對順鉑和阿法替尼的耐藥性〔7，8〕。但BLACAT1在卵巢癌中的表達(dá)及其對卵巢癌細(xì)胞Taxol耐藥性的影響尚不清楚。miR-374b-5p在卵巢癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-374b-5p可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性〔9〕。生物信息學(xué)分析顯示，miR-374b-5p是BLACAT1的潛在靶基因，但BLACAT1能否通過靶向調(diào)控miR-374b-5p表達(dá)影響卵巢癌細(xì)胞Taxol耐藥性目前還尚未可知。本研旨在闡明BLACAT1對卵巢癌細(xì)胞Taxol耐藥性的影響和調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 收集2017年1月至2018年6月于南陽市中心醫(yī)院確診并進行手術(shù)切除的20例卵巢癌組織和與其對應(yīng)的癌旁組織(距離癌灶2 cm)，患者在術(shù)前均接受化療，均簽署知情同意書。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；人卵巢癌Taxol耐藥細(xì)胞株SKOV3/Taxol購于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購于美國Gibco公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司；Trizol一步法總RNA提取試劑購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司；si-NC、si-BLACAT1、miR-NC、miR-374b-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-374b-5p、pcDNA、pcDNA-BLACAT1及WT-BLACAT1、MUT-BLACAT1的構(gòu)建均由上海吉瑪制藥有限公司提供；細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、放射免疫沉淀試驗(RIPA)細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1兔單克隆抗體、P21兔單克隆抗體、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2兔單克隆抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗購于美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/ml)在37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)SKOV3和SKOV3/Taxol細(xì)胞。將SKOV3/Taxol細(xì)胞以每孔2×105個細(xì)胞的密度接種在6孔培養(yǎng)板，第2天利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別將si-NC、si-BLACAT1、miR-NC、miR-374b-5p mimics轉(zhuǎn)染至SKOV3/Taxol細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，檢測轉(zhuǎn)染效果，進行后續(xù)實驗。為進一步驗證BLACAT1調(diào)控miR-374b-5p表達(dá)影響卵巢細(xì)胞對Taxol的耐藥性，將si-BLACAT1分別與anti-miR-374b-5p或anti-miR-NC共轉(zhuǎn)染至SKOV3/Taxol細(xì)胞，經(jīng)Taxol干預(yù)處理后，檢測細(xì)胞的增殖和凋亡情況。

1.2.2細(xì)胞藥物處理 將對數(shù)期SKOV3和SKOV3/Taxol細(xì)胞分別接種至96孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁后每孔分別加入不同濃度Taxol(20、40、80、160、320 ng/ml)干預(yù)處理48 h，隨后采用CCK-8法測定細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.3實驗分組 分組：Taxol+si-NC組、Taxol+si-BLACAT1組、Taxol+miR-NC組、Taxol+miR-374b-5p組、Taxol+si-BLACAT1+anti-miR-NC組和Taxol+si-BLACAT1+ anti-miR-374b-5p組。以上各組在轉(zhuǎn)染后，均采用40 ng/ml Taxol干預(yù)處理48 h。

1.2.4實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測BLACAT1和miR-374b-5p的表達(dá)水平 收集臨床樣本、SKOV3細(xì)胞及各組SKOV3/Taxol細(xì)胞，采用Trizol一步法分別提取組織和各組細(xì)胞的總RNA，隨后進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，然后以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測。反應(yīng)體系(20 μl)：cDNA為2 μl，上游引物(10 μmol/L)0.5 μl，下游引物(10 μmol/L)0.5 μl，SYBR Green Mix 10 μl，RNase-Free水7 μl。引物序列為：BLACAT1上游引物5′-CCTGCTTGGAAACTAATGACC-3′，下游5′-AGGCTCAACTTCCCAGACTCA-3′；miR-374b-5p上游引物5′-TCAGCGGATATAATACAACCTGC-3′，下游5′-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC-3′;U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAG-ATT-3′，下游5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′。采用2-ΔΔCt法計算BLACAT1和miR-374b-5p的相對表達(dá)量。

1.2.5CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為60%時按照1.2.3分組進行轉(zhuǎn)染，48 h后每孔加入Taxol濃度為40 ng/ml的培養(yǎng)液100 μl，培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h在酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度(OD)值，計算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化各組SKOV3/Taxol細(xì)胞，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，離心后，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml。取100 μl細(xì)胞懸液加入到流式管內(nèi)，隨后加入5 μl的Annexin V-FITC，混勻后，室溫避光孵育10 min，再加入10 μl PI溶液，繼續(xù)孵育5 min，補加PBS至500 μl，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7Western印跡檢測增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 采用RIPA細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞蛋白后，按照BCA試劑盒測定蛋白濃度。取適量細(xì)胞蛋白和上樣緩沖液混合后，沸水浴5 min變性細(xì)胞蛋白。按照每孔30 μg變性蛋白樣品進行上樣，隨后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析細(xì)胞蛋白。電泳完畢后，利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，隨后將膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，吸盡封閉液，洗膜緩沖液漂洗3 min，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜，洗膜液漂洗5 min，漂洗3次后，加入相應(yīng)的Ⅱ抗室溫孵育1 h，洗膜液再次漂洗3次后，采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑進行顯色，拍照后，采用Image J軟件分析目的條帶灰度值。

1.2.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?采用StarBase在線預(yù)測顯示，BLACAT1的3′UTR含有與miR-374b-5p互補的核苷酸序列，猜測miR-374b-5p是BLACAT1的靶基因，隨后采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。利用LipofectamineTM2000將含有BLACAT1的3′UTR的WT熒光素酶報告基因載體WT-BLACAT1和MUT熒光素酶報告基因載體MUT-BLACAT1分別與miR-374b-5p mimics和miR-NC共轉(zhuǎn)染至SKOV3/Taxol細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后分別收集各組細(xì)胞，按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書測定熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較，卵巢癌組織中BLACAT1表達(dá)水平顯著升高，miR-374b-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌組織中的表達(dá)

2.2lncRNA BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌細(xì)胞和卵巢癌Taxol耐藥細(xì)胞中的表達(dá) 與卵巢癌細(xì)胞SKOV3比較，卵巢癌Taxol耐藥細(xì)胞SKOV3/Taxol中BLACAT1表達(dá)水平顯著升高，miR-374b-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 BLACAT1和miR-374b-5p在卵巢癌細(xì)胞和卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞中的表達(dá)

2.3Taxol對卵巢癌細(xì)胞和卵巢癌Taxol耐藥細(xì)胞的抑制作用 SKOV3細(xì)胞和SKOV3/Taxol細(xì)胞中，隨著Taxol劑量增高，細(xì)胞抑制率均顯著升高，且同一劑量Taxol，SKOV3/Taxol細(xì)胞抑制率顯著低于SKOV3細(xì)胞(P<0.05)；SKOV3/Taxol細(xì)胞IC50(631.21±41.21)顯著低于SKOV3細(xì)胞(109.90±9.11，P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度Taxol對卵巢癌細(xì)胞和卵巢癌Taxol耐藥細(xì)胞抑制率的影響

2.4沉默BLACAT1聯(lián)合Taxol(40 ng/ml)對SKOV3/Taxol細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與Taxol+si-NC組比較，Taxol+si-BLACAT1組SKOV3/Taxol細(xì)胞BLACAT1、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，miR-374b-5p、p21、Bax蛋白水平、細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均顯著增加(均P<0.05)。見圖1、表4。

2.5過表達(dá)miR-374b-5p聯(lián)合Taxol對SKOV3/Taxol細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與Taxol+miR-NC組比較，Taxol+miR-374b-5p組SKOV3/Taxol細(xì)胞CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，miR-374b-5p、p21和Bax蛋白水平、細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均顯著增加(均P<0.05)。見表5、圖2。

2.6lncRNA BLACAT1靶向調(diào)控miR-374b-5p的表達(dá) 利用StarBase在線預(yù)測顯示，BLACAT1的3′UTR含有與miR-374b-5p互補的核苷酸序列，見圖3。與miR-NC和WT-BLACAT1共轉(zhuǎn)染組比較，miR-374b-5p mimics和WT-BLACAT1共轉(zhuǎn)染組SKOV3/Taxol細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-BLACAT1共轉(zhuǎn)染組比較，miR-374b-5p mimics和MUT-BLACAT1共轉(zhuǎn)染組SKOV3/Taxol細(xì)胞的熒光素酶活性無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。與pcDNA組SKOV3/Taxol細(xì)胞miR-374b-5p表達(dá)水平(1.00±0.09)比較，pcDNA-BLACAT1組(0.42±0.04)顯著降低(P<0.05)；與si-NC組SKOV3/Taxol細(xì)胞miR-374b-5p表達(dá)水平(0.99±0.08)比較，si-BLACAT1組(2.24±0.23)顯著升高(P<0.05)。提示miR-374b-5p是BLACAT1的靶基因，BLACAT1負(fù)性調(diào)控miR-374b-5p表達(dá)。

表6 雙熒光素酶報告實驗

2.7干擾miR-374b-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)沉默BLACAT1對SKOV3/Taxol細(xì)胞耐藥性 與Taxol+si-BLACAT1+anti-miR-NC組比較，Taxol+si-BLACAT1+anti-miR-374b-5p組SKOV3/Taxol細(xì)胞CyclinD1和Bcl-2水平、miR-374b-5p、p21和Bax水平、細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖4、表7。

3 討 論

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，獲得性耐藥是導(dǎo)致卵巢癌患者死亡的主要原因〔10〕。Taxol作為治療卵巢癌的一線化療藥物，其和順鉑聯(lián)合使用初期效果較好。然而，大多數(shù)患者在治療1～2年后會出現(xiàn)化療耐藥和復(fù)發(fā)，其中位無進展生存期僅為12～16個月，5年存活率僅為27%〔11〕。lncRNAs是一種非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本，其在卵巢癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中發(fā)揮調(diào)控作用〔12〕。研究表明lncRNA表達(dá)失調(diào)與卵巢癌細(xì)胞Taxol耐藥有關(guān)。例如，lncRNA KB-1471A8.2在卵巢癌組織和耐藥卵巢癌細(xì)胞中均顯著下調(diào)，過表達(dá)KB-1471A8.2可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和Taxol耐藥，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡〔11〕；然而，LINC01118在卵巢癌組織和耐藥細(xì)胞中呈高表達(dá)，LINC01118可抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞遷移、侵襲和Taxol耐藥〔13〕。本研究結(jié)果提示BLACAT1的表達(dá)上調(diào)可能與卵巢癌細(xì)胞的Taxol耐藥有關(guān)。隨后構(gòu)建沉默BLACAT1的SKOV3/Taxol細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)沉默BLACAT1可抑制SKOV3/Taxol細(xì)胞增殖，促進Taxol誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提高卵巢癌細(xì)胞對Taxol的敏感性。

miR-374b-5p的表達(dá)失調(diào)與人類多種疾病相關(guān)，包括腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)miR-374b-5p在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)〔14〕；然而miR-374b-5p在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)發(fā)揮抑癌基因作用〔15〕。此外，miR-374b-5p和胰腺癌細(xì)胞的吉西他濱耐藥相關(guān)，其胰腺癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá)低于藥物敏感性的細(xì)胞，過表達(dá)miR-374b-5p可改善胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱藥物的耐藥性〔16〕。本研究結(jié)果提示，沉默BLACAT1通過上調(diào)miR-374b-5p可提高卵巢癌細(xì)胞對Taxol的敏感性。在后續(xù)研究中，將開展體內(nèi)實驗進一步驗證BLACAT1/miR-374b-5p軸在卵巢癌細(xì)胞Taxol耐藥中的作用。

綜上，lncRNA BLACAT1在卵巢癌組織和Taxol耐藥卵巢癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，而miR-374b-5p呈低表達(dá)，沉默BLACAT1通過上調(diào)miR-374b-5p可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，促進Taxol誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提高卵巢癌細(xì)胞對Taxol的敏感性。BLACAT1/miR-374b-5p軸有望成為Taxol耐藥卵巢癌的分子治療靶點。