趙麗霞 任成波 翟明慧 鮑昕 劉博 趙峻峰

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1腫瘤內(nèi)科，河北 張家口 075000；2放療科；3病理科)

肺癌是一種發(fā)病率與死亡率均位居首位的惡性腫瘤〔1〕，因其高轉(zhuǎn)移、高侵襲和放化療不敏感等因素使目前常用的手術(shù)、放化療等療效并不理想〔2〕。因此，深入研究肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機(jī)制，尋找有效抑制其發(fā)生的潛在治療靶點(diǎn)，一直是肺癌基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。研究顯示，肺癌中存在多種異常表達(dá)的微小RNA(miRNA)，而這些miRNAs可能通過調(diào)控細(xì)胞遷移和侵襲等參與肺癌的惡性發(fā)展〔3〕。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是特定環(huán)境下上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一種現(xiàn)象，是細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移和入侵能力的重要因素，與包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的惡性發(fā)展密切相關(guān)〔4〕。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-374b-5p(miR-374b-5p)在膀胱癌和卵巢癌等組織中異常低表達(dá)，且可通過靶向鋅指E盒結(jié)合的同源盒蛋白(ZEB)2或者叉頭框蛋白(FOX)P1調(diào)控細(xì)胞遷移、侵襲和EMT，發(fā)揮著重要的抑癌作用〔5,6〕；但miR-374b-5p在肺癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT中的作用機(jī)制并不完全清楚。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)C可能是miR-374b-5p的潛在靶基因。VEGFC是血管內(nèi)皮生長因子家族的成員，不僅在血管生成和調(diào)節(jié)血管通透性方面發(fā)揮著重要作用，其異常高表達(dá)還與肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和EMT有關(guān)〔7,8〕；而VEGFC和miR-374b-5p在肺癌中是否存在著靶向調(diào)控關(guān)系并不清楚。本研究通過觀察miR-374b-5p和VEGFC在肺癌細(xì)胞中表達(dá)情況，分析miR-374b-5p可否通過靶向調(diào)控VEGFC影響肺癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑和儀器 人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞(批號(hào)：CBP60577)和肺癌A549細(xì)胞(批號(hào)：CBP60084)、H1299細(xì)胞(批號(hào)：CBP60053)、H358細(xì)胞(批號(hào)：CBP60136)均購自南京科佰生物科技有限公司。Ham F-12K完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，批號(hào)：MPM150910B)和BEAS-2B細(xì)胞專用培養(yǎng)基(批號(hào)：MCM-0496)購自寧波明舟生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基(批號(hào)：E600028)、胎牛血清(批號(hào)：E510008)、LipoHigh脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑(批號(hào)：E607403)、總RNA提取試劑(批號(hào)：B511311)、通用總蛋白提取試劑盒(批號(hào)：C006225)、miRNA熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(批號(hào)：B532461)購自上海生工生物工程股份有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：D0010)購自北京索萊寶生物科技有限公司；VEGFC抗體(批號(hào)：ab83905)、E-鈣黏蛋白(cadherin)抗體(批號(hào)：ab1416)、N-cadherin抗體(批號(hào)：ab245117)、波形蛋白(Vimentin)抗體(批號(hào)：ab137321)、β-肌動(dòng)蛋白(actin)抗體(批號(hào)：ab8227)購自美國Abcam公司；鼠抗人二抗(批號(hào)：MB009)購自上海中科英沐生物科技有限公司；miR-374b-5p mimics、mimics-NC和pcDNA3.1-VEGFC過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：BPN-40RHP)購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：LightCycler 480 Ⅱ)購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；顯微鏡(型號(hào)：LV100N POL)購自日本尼康公司；Transwell小室(型號(hào)：3401)購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)：ChemiScope 6000)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)H1299細(xì)胞和H358細(xì)胞，Ham′s F-12K完全培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，BEAS-2B細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞，均在5%CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-374b-5p表達(dá)水平 參照總RNA提取試劑使用說明書提取A549、H1299、H358和BEAS-2B細(xì)胞總RNA，定量后將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；再將cDNA作為模板，參照miRNA熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-374b-5p表達(dá)水平。其中，每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增程序如下：94℃ 240 s；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 360 s。引物由北京索萊寶生物科技有限公司合成。引物序列為：內(nèi)參U6上游5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′，下游5′-GTACAACACATTGTT TCCTCGGA-3′；miR-374b-5p上游5′-TCAGCGGA TATAATACAACCTGC-3′，下游5′-TATCGTTGTTCT CCACTCCTTCAC-3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長期的H1299細(xì)胞按照每孔2.5×105個(gè)接種至6孔板上，常規(guī)培養(yǎng)貼壁后，參照LipoHigh脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑使用說明書將miR-374b-5p mimics轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞中作為mimics組，將mimics-NC轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞中作為NC組，將miR-374b-5p mimics和pcDNA3.1-VEGFC共轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞中作為mimics+VEGFC組，將miR-374b-5p mimics和pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞中作為mimics+pcDNA3.1組，并將未做轉(zhuǎn)染的H1299細(xì)胞作為對(duì)照組。其中，每組設(shè)置3個(gè)平行。在轉(zhuǎn)染5 h時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-374b-5p和VEGFC的靶向關(guān)系 采用TargetScan和miRDB數(shù)據(jù)庫軟件預(yù)測(cè)miR-374b-5p和VEGFC之間的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)結(jié)合位點(diǎn)序列及定點(diǎn)突變后的序列克隆擴(kuò)增后插入pGL3-Basic載體上，分別構(gòu)建VEGFC野生型質(zhì)粒(VEGFC-Wt)和VEGFC突變型質(zhì)粒(VEGFC-Mut)；將miR-374b-5p mimics及mimics-NC分別與VEGFC-Wt、VEGFC-Mut共轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞中，其中每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；在轉(zhuǎn)染48 h后，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)H1299細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 首先，以Maker在6孔板背面過孔畫橫線，每孔加入106個(gè)H1299細(xì)胞，分為NC組、mimics組、mimics+pcDNA3.1組和mimics+VEGFC組，按照1.4中方法轉(zhuǎn)染后，采用小號(hào)槍頭垂直橫線劃痕；將劃下的細(xì)胞除去后，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；分別在培養(yǎng)0、48 h于顯微鏡下拍照觀察，并計(jì)算各組H1299細(xì)胞的劃痕愈合率。其中，劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲 收集轉(zhuǎn)染48 h后的NC組、mimics組、mimics+pcDNA3.1組和mimics+VEGFC組H1299細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基制成濃度為105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液；在基質(zhì)膠包被的Transwell小室上室每孔接種200 μl H1299細(xì)胞懸液，在小室下室每孔接種600 μl含胎牛血清的培養(yǎng)基；常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出小室；經(jīng)甲醇固定20 min后，加入0.5%結(jié)晶紫染色15 min；在顯微鏡下觀察拍照分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8Western印跡檢測(cè)VEGFC、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平 參照通用總蛋白提取試劑盒說明書提取待測(cè)細(xì)胞總蛋白后，采用二奎啉甲酸法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量；將變性后的蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上；封閉1 h后，加入特異性一抗VEGFC(1∶2 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶2 000)和β-actin(1∶2 000)室溫孵育2 h；再經(jīng)二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h后，顯影液顯影；β-actin作為內(nèi)參，Image J軟件分析VEGFC、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-374b-5p和VEGFC蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞相比，人肺癌A549、H1299、H358細(xì)胞中miR-374b-5p表達(dá)水平明顯降低，而VEGFC蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，且miR-374b-5p和VEGFC蛋白表達(dá)水平在H1299細(xì)胞中變化最顯著(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 miR-374b-5p和VEGFC蛋白在不同細(xì)胞系中的表達(dá)水平

2.2miR-374b-5p和VEGFC的靶向關(guān)系 采用TargetScan和miRDB軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-374b-5p與VEGFC之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與mimics-NC組比較，miR-374b-5p mimics組轉(zhuǎn)染VEGFC-Wt的H1299細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，但miR-374b-5p mimics組轉(zhuǎn)染VEGFC-Mut的H1299細(xì)胞熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。見表2。

表2 兩組H1299細(xì)胞的熒光素酶活性

2.3轉(zhuǎn)染miR-374b-5p mimics后肺癌H1299細(xì)胞中miR-374b-5p表達(dá)水平 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(1.00±0.00)比較，NC組H1299細(xì)胞中miR-374b-5p表達(dá)水平(0.95±0.08)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC組比較，mimics組H1299細(xì)胞中miR-374b-5p表達(dá)水平(20.16±2.35)明顯升高(P<0.05)。

2.4miR-374b-5p過表達(dá)對(duì)肺癌H1299細(xì)胞中VEGFC蛋白表達(dá)的影響 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，mimics組H1299細(xì)胞中VEGFC蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與mimics組比較，mimics+pcDNA3.1組H1299細(xì)胞中VEGFC蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但mimics+VEGFC組H1299細(xì)胞中VEGFC蛋白表達(dá)水平較mimics+pcDNA3.1組明顯升高(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 轉(zhuǎn)染后各組H1299細(xì)胞中VEGFC蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞遷移及侵襲能力比較

2.5miR-374b-5p過表達(dá)靶向調(diào)控VEGFC對(duì)肺癌H1299細(xì)胞遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，mimics組H1299細(xì)胞遷移能力明顯減弱(P<0.05)；與mimics組比較，mimics+pcDNA3.1組H1299細(xì)胞遷移能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但mimics+VEGFC組H1299細(xì)胞遷移能力較mimics+pcDNA3.1組明顯增強(qiáng)(P<0.05)。見表3、圖4。

2.6miR-374b-5p過表達(dá)靶向調(diào)控VEGFC對(duì)肺癌H1299細(xì)胞侵襲的影響 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，mimics組H1299細(xì)胞侵襲能力明顯減弱(P<0.05)；與mimics組比較，mimics+pcDNA3.1組H1299細(xì)胞侵襲能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但mimics+VEGFC組H1299細(xì)胞侵襲能力較mimics+pcDNA3.1組明顯增強(qiáng)(P<0.05)。見表3、圖5。

2.7miR-374b-5p過表達(dá)靶向調(diào)控VEGFC表達(dá)對(duì)肺癌H1299細(xì)胞EMT的影響 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，mimics組H1299細(xì)胞中EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與mimics組比較，mimics+pcDNA3.1組H1299細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與mimics+pcDNA3.1組比較，mimics+VEGFC組H1299細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖6、表4。

表4 各組H1299細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

3 討 論

miRNAs是一類較短的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過與靶基因mRNA特異性結(jié)合引起mRNA降解或抑制其翻譯來影響基因表達(dá)，在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲和遷移等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用〔9，10〕。miR-374b-5p是miRNAs中的一員，其異常表達(dá)可通過靶向調(diào)控生長抑制因子(ING)1、三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族A亞家族成員(ABCA)8和FOXP1參與乳腺癌、肝癌和卵巢癌等腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移〔6，11，12〕；另外，miR-374b-5p過表達(dá)還可通過靶向下調(diào)ZEB2抑制膀胱癌細(xì)胞EMT能力〔5〕。盡管已有學(xué)者指出，miR-374b-5p在肺癌組織中低表達(dá)，且其過表達(dá)可通過靶向富含絲氨酸/精氨酸剪接因子(SRSF)7抑制H460細(xì)胞及H661細(xì)胞遷移和侵襲〔13〕；但其對(duì)肺癌細(xì)胞EMT的影響未見報(bào)道；同時(shí)，miR-374b-5p是否還通過調(diào)控其他基因發(fā)揮抗腫瘤作用也有待探討。

腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗的重要原因，而淋巴道轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要途徑〔14〕；VEGFC是一種在淋巴血管發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的調(diào)節(jié)因子，其異常表達(dá)與宮頸癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌和肝內(nèi)膽管癌等多種腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和EMT密切相關(guān)〔15～18〕。有研究報(bào)道，VEGFC在肺癌常見類型非小細(xì)胞肺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)〔19〕，且VEGFC表達(dá)下調(diào)是拓?fù)涮婵狄种品伟┘?xì)胞轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制〔20〕。然而，VEGFC在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響并不清楚。本研究結(jié)果提示，miR-374b-5p和VEGFC可能在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，VEGFC是miR-374b-5p的靶基因，miR-374b-5p過表達(dá)可通過靶向下調(diào)VEGFC表達(dá)抑制肺癌H1299細(xì)胞遷移、侵襲和EMT發(fā)生。

綜上，在肺癌細(xì)胞中miR-374b-5p表達(dá)降低，而VEGFC蛋白表達(dá)升高，本研究首次揭示了miR-374b-5p抑制肺癌H1299細(xì)胞遷移、侵襲和EMT是通過靶向下調(diào)VEGFC表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。該結(jié)果局限于細(xì)胞水平和單一細(xì)胞株，后期還需在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和其他肺癌細(xì)胞株中進(jìn)行驗(yàn)證。