馬孝琛，許 鼎，張 恒，劉 鵬，馬鵬程，馮 睿，景在平，馮家烜

1 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院血管外科，上海 200433

2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院血管外科，山東 青島 266100

3 上海市第一人民醫(yī)院介入中心、血管外科，上海 201600

近年來(lái)，基因編輯技術(shù)是生物和醫(yī)療等諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，也是21世紀(jì)的生命科學(xué)的前沿。得益于基因組測(cè)序技術(shù)的成熟和發(fā)展，人們對(duì)龐大而復(fù)雜的基因序列有了越來(lái)越準(zhǔn)確、直觀的認(rèn)識(shí)，這為基因編輯提供了必要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。近年來(lái)，基因編輯方法的發(fā)展和完善使對(duì)基因組的調(diào)控和研究成為可能，并且為人類實(shí)現(xiàn)基因治療提供了新的途徑[1]。雖然到目前為止，多數(shù)疾病的基因治療仍然處于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，尚未進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但是其實(shí)驗(yàn)結(jié)果所展現(xiàn)出的臨床應(yīng)用前景較為樂(lè)觀。本綜述主要對(duì)基因編輯進(jìn)行總結(jié)并對(duì)其在血管外科中的應(yīng)用提出初步設(shè)想和展望。

1 DNA 編輯

DNA 編輯是目前研究最多、涉及領(lǐng)域最廣的基因編輯類型，根據(jù)其可編程核酸酶的DNA 識(shí)別模式大致分為兩類：通過(guò)DNA-蛋白質(zhì)相互作用實(shí)現(xiàn)特定的DNA 位點(diǎn)結(jié)合（如鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶和巨核酸酶）、通過(guò)RNA引導(dǎo)分子直接與特定靶向DNA序列堿基對(duì)結(jié)合（如Cas9）[2]。而Cas9由于其穩(wěn)定性和便捷性而受到人們關(guān)注，所以基于成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced palindromic repeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白（Cas）系統(tǒng)的堿基編輯逐漸成為DNA 編輯的主要方法。CRISPR系統(tǒng)源自細(xì)菌獲得性免疫機(jī)制，40%的細(xì)菌和90%的古核生物擁有內(nèi)源性CRISPR機(jī)制，它使用小RNA通過(guò)堿基配對(duì)進(jìn)行識(shí)別，并切割外源DNA元件，以序列特異性方式賦予對(duì)這些元件的遺傳抗性[3]。其中Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)在宿主基因組內(nèi)的CRISPR之間整合入侵的DNA 序列，利用其整合DNA 的特性再經(jīng)過(guò)加工即可作為DNA 編輯的工具[4]。

堿基編輯以在目標(biāo)靶位引發(fā)雙鏈DNA斷裂作為基因校正的第一步[2]，但這種方式仍然存在著許多的問(wèn)題，如在斷裂的標(biāo)靶雙鏈DNA上誘導(dǎo)大量的隨機(jī)插入和缺失[2,5]，效率較低，只能進(jìn)行4種堿基轉(zhuǎn)換（C轉(zhuǎn)換為T、G轉(zhuǎn)換為A、A轉(zhuǎn)換為G、T轉(zhuǎn)換為C）而不能進(jìn)行8種堿基轉(zhuǎn)換（C轉(zhuǎn)換為A、C轉(zhuǎn)換為G、G轉(zhuǎn)換為C、G轉(zhuǎn)換為T、A轉(zhuǎn)換為C、A轉(zhuǎn)換為T、T轉(zhuǎn)換為A、T轉(zhuǎn)換為A）等。在此基礎(chǔ)上，Anzalone等[6]發(fā)現(xiàn)了一種可以在不斷裂雙鏈DNA的基礎(chǔ)上進(jìn)行DNA編輯的新方法——Prime編輯。該方法可以進(jìn)行全部12種堿基的變換，并顯示出比同源定向修復(fù)（homologydirected repair，HDR）相似或較高的效率及較少的副產(chǎn)物，與其他堿基編輯相比具有互補(bǔ)的優(yōu)點(diǎn)，且在已知的Cas9脫靶位點(diǎn)，Prime編輯的脫靶編輯現(xiàn)象低于Cas9核酸酶。Prime編輯擴(kuò)展了基因組編輯的范圍和能力，理論上可以糾正89%與人類疾病相關(guān)的已知遺傳變異[6-7]。應(yīng)用上述方法，DNA編輯在血紅蛋白疾?。é?地中海貧血，鐮狀細(xì)胞病）、遺傳性眼?。↙eber 先天性黑蒙）、肌肉遺傳?。ǘ攀霞I(yíng)養(yǎng)不良癥）、遺傳性肝?。ㄟz傳性酪氨酸血癥Ⅰ型，α-1抗胰蛋白酶缺乏癥）、先天性遺傳性肺?。倚岳w維化，遺傳性表面活性蛋白綜合征）和遺傳性耳聾等方面也有了良好的進(jìn)展，一些基因編輯藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[8]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，將CRISPR-Cas9編輯后的自體CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞移植到骨髓清除后的輸血依賴性β-地中海貧血患者和鐮狀細(xì)胞病患者體內(nèi)，一段時(shí)間后均產(chǎn)生了較好的療效，這為單基因突變的血液疾病的基因治療提供了有力的證據(jù)[9]。即便如此，由于DNA 編輯是在基因?qū)用嫔蠈?duì)DNA 序列進(jìn)行根本性的改變，對(duì)于人體來(lái)說(shuō)其安全性方面仍然存在著許多未知的隱患，而且在臨床試驗(yàn)中還會(huì)有復(fù)雜的倫理問(wèn)題，所以DNA 編輯在疾病的治療和臨床應(yīng)用方面仍然面臨著較大的局限性。與DNA 編輯相比，RNA編輯的發(fā)現(xiàn)和研究則較好地解決了這一問(wèn)題。

2 RNA 編輯

RNA編輯是在RNA水平上對(duì)目標(biāo)RNA進(jìn)行堿基的精準(zhǔn)改變和修飾，其原理與DNA 編輯相似，但其最大的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控是暫時(shí)性的，這就大大增加了其在臨床應(yīng)用方面的安全性和可控性[10]。

自發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸（microRNA，miRNA）和小干擾核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）以來(lái)，定點(diǎn)靶向RNA的研究就進(jìn)入了更加深入的探索階段，許多利用內(nèi)源性miRNA和siRNA機(jī)制來(lái)抑制基因表達(dá)的治療方式出現(xiàn)了[11-12]，但是RNA編輯仍然是一項(xiàng)前沿的新技術(shù)。目前研究表明，基于治療目的，在定點(diǎn)RNA編輯方面，有兩種類型的堿基轉(zhuǎn)換是較為有效且能夠直接改變密碼子并編碼RNA，即C轉(zhuǎn)換為U、A轉(zhuǎn)換為I[13]。A到I轉(zhuǎn)換需要作用于RNA的腺苷脫氨酶（adenosine deaminases acting on RNA，ADAR），在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)3種與編碼堿基轉(zhuǎn)換有關(guān)的酶，即ADAR1、ADAR2和ADAR3。其中ADAR1含量最多、分布最廣；ADAR2主要在神經(jīng)、血管和消化系統(tǒng)中表達(dá)；ADAR3是大腦特有的，但由于ADAR3不具有酶活性，所以認(rèn)為ADAR3與其他ADAR酶競(jìng)爭(zhēng)從而可以發(fā)揮調(diào)節(jié)RNA編輯的作用[14-15]。研究表明，ADAR1是重復(fù)位點(diǎn)的主要編輯器，ADAR2是非重復(fù)編碼位點(diǎn)的主要編輯器，而無(wú)催化活性的ADAR3主要充當(dāng)編輯抑制劑[16]。C轉(zhuǎn)換為U也是由ADAR體外轉(zhuǎn)換的編碼[17]，由于編輯的酶與哺乳動(dòng)物同源，這使得這兩種方式在編碼的過(guò)程中幾乎不會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)。

近年來(lái)，隨著對(duì)CRISPR 相關(guān)系統(tǒng)的深入研究，發(fā)現(xiàn)了Ⅵ型CRISPR 核酸酶Cas13，它使得CRISP-Cas 系統(tǒng)的使用從DNA 靶向擴(kuò)展到RNA 靶向[18-22]。CRISPR系統(tǒng)的靶向特異性由RNA 嵌合體和靶DNA 之間的堿基配對(duì)，以及Cas9蛋白與靶DNA 3'端常見的短DNA 基序[原型間隔區(qū)相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）]之間的結(jié)合決定，PAM 是CRISPR 機(jī)制識(shí)別的關(guān)鍵基序[3]。由于Cas13是RNA 的靶向，不需要PAM，這就使得其能夠融合的靶向空間幾乎沒(méi)有限制[10]，也使得CRISPR 系統(tǒng)的RNA 編輯靶向治療具有更加廣泛的應(yīng)用前景。

目前RNA編輯已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了初步的良好結(jié)果。Zhou 等[23]的研究通過(guò)RNA靶向的CRISP系統(tǒng)CasRx將小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有功能的神經(jīng)元細(xì)胞，這為神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如阿爾茨海默病、帕金森綜合征等）的治療提供了新的方向。

3 基因編輯在循環(huán)系統(tǒng)疾病治療中的進(jìn)展

由于因編輯技術(shù)的完善和進(jìn)步，通過(guò)基因編輯技術(shù)治療遺傳性疾病的研究也在逐漸深入并取得了一定的成效。Zhao 等[24]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在小鼠體內(nèi)腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）CRISPR-Cas 介導(dǎo)的Ldlr基因校正可以部分提高低密度脂蛋白受體的表達(dá)，有效改善Ldlr突變體的動(dòng)脈粥樣硬化表型，為家族性高膽固醇血癥患者的治療提供了一種潛在的治療方法，而高膽固醇血癥是動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一。

在循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)遺傳疾病的方向上，基因編輯正在成為一顆冉冉升起的新星。研究表明，通過(guò)應(yīng)用Cas對(duì)胚胎細(xì)胞進(jìn)行DNA編輯，已經(jīng)在肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）[25]和馬方綜合征（Marfan syndrome，MFS）[26]等遺傳病的基因治療中取得了一定進(jìn)展。

HCM是一種以左心室肥厚和心肌纖維紊亂為特征的心肌疾病，患病率為1 ∶500，臨床上常伴有心力衰竭表現(xiàn)[27]。已有研究表明，超過(guò)350個(gè)位點(diǎn)的肌球蛋白結(jié)合蛋白C3（myosin-binding protein C3，MYBPC3）基因突變與HCM有關(guān)，占所有HCM突變的40%～50%，使MYBPC3成為HCM中最常見的突變基因[28-29]。Ma等[25]使用CRISPRCas9在人類生殖細(xì)胞中成功修正了MYBPC3突變，純合野生型基因型比例修復(fù)比例達(dá)到66.7%，且在MⅡ期卵母細(xì)胞中注入CRISPR-Cas9比在受精卵中注入具有更有效的靶向作用，表明CRISPR-Cas9可用于消除人類胚胎中的致病突變，并且在胚胎發(fā)生過(guò)程中通過(guò)對(duì)Cas9注射時(shí)間的修改可顯著提高HDR效率。

MFS 是一種與多器官系統(tǒng)異常相關(guān)的遺傳性結(jié)締組織病，其引發(fā)的胸主動(dòng)脈瘤和主動(dòng)脈夾層是主要的致死病因，其最常由編碼的纖維蛋白-1（fibrillin-1，F(xiàn)BN1）基因的常染色體顯性突變引起[30]。Zeng 等[26]研究使用Cas9糾正了胚胎期MFS 致病突變基因FBN1T7498C，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證了在雜合人類胚胎中成功實(shí)現(xiàn)了遺傳校正。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了通過(guò)堿基編輯在人類早期胚胎中糾正致病突變的安全性，并為MFS 提供了可能的治療方法。但對(duì)于發(fā)育成熟的MFS 患者的血管壁細(xì)胞（血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）的基因編輯修復(fù)效應(yīng)至今還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

除了遺傳性疾病之外，由于高脂飲食和缺少運(yùn)動(dòng)的生活方式等原因所引起的肥胖，作為心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，在基因編輯方面也有了一定的進(jìn)展。Wang等[31]利用CRISPR編輯技術(shù)成功將人類白色脂肪組織轉(zhuǎn)化為高表達(dá)解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）基因的人類褐色脂肪樣細(xì)胞，并在被移植人類褐色脂肪樣細(xì)胞的小鼠中觀察到體內(nèi)的白色脂肪比例明顯更低、體重也更輕且均接近直接移植褐色脂肪細(xì)胞的小鼠。該實(shí)驗(yàn)證明了使用CRISPR基因編輯技術(shù)改造人類白色脂肪細(xì)胞，使其顯示褐色脂肪樣細(xì)胞表型的實(shí)用性，為使用基因療法對(duì)抗肥胖癥等代謝性疾病提供了新的機(jī)會(huì)，也為心血管疾病的預(yù)防提供了新思路。

4 小結(jié)與展望

盡管基因編輯已取得較大進(jìn)展，但是其存在的問(wèn)題還是不容忽視。DNA 編輯中堿基編輯方法會(huì)引起DNA 雙鏈的斷裂從而引起大量堿基的錯(cuò)配、插入、缺失等改變；Prime 編輯不會(huì)斷裂雙鏈，但卻有較高的脫靶效應(yīng)，無(wú)法解決DNA 編輯后的安全問(wèn)題，且引入CRISPR-Cas9會(huì)使機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)。對(duì)于許多先天性的遺傳病來(lái)說(shuō)，只有在胚胎期進(jìn)行DNA 編輯才有希望從根本上治療下一代的遺傳病，而這將面臨嚴(yán)峻的醫(yī)學(xué)倫理問(wèn)題，且對(duì)于親代已經(jīng)存在的因遺傳病導(dǎo)致的組織器官的器質(zhì)性病變作用較小，所以在將來(lái)的臨床應(yīng)用場(chǎng)景和適用患者的選擇方面有較大困難。相比之下，RNA編輯盡管尚處于探索初期階段，也存在著一定脫靶效應(yīng)和免疫反應(yīng)等問(wèn)題，但卻因其不改變基因結(jié)構(gòu)，僅通過(guò)改變DNA 轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物RNA來(lái)對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而大大增加了基因治療的可調(diào)控性和安全性，而且已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其在遺傳疾病治療方面的可行性，所以RNA編輯在基因治療中有著更廣闊的臨床應(yīng)用前景。

盡管現(xiàn)在還沒(méi)有明確的研究將RNA編輯用于血管疾病的基因治療，但已有的發(fā)現(xiàn)表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)級(jí)聯(lián)和編碼平滑肌收縮器的組成部分的基因突變與主動(dòng)脈遺傳疾病密切相關(guān)[32]，這些位點(diǎn)的確定也為血管疾病的RNA編輯治療提供了新的有潛力的研究方向。